Isolation of mineralizing Nestin+ Nkx6.1+ vascular muscular cells from the adult human spinal cord

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>The adult central nervous system (CNS) contains different populations of immature cells that could possibly be used to repair brain and spinal cord lesions. The diversity and the properties of these cells in the human adult CNS remain to be fully explored. We previously isolated Nestin⁺Sox2⁺neural multipotential cells from the adult human spinal cord using the neurosphere method (i.e. non adherent conditions and defined medium).</p> <p>Results</p> <p>Here we report the isolation and long term propagation of another population of Nestin⁺cells from this tissue using adherent culture conditions and serum. QPCR and immunofluorescence indicated that these cells had mesenchymal features as evidenced by the expression of Snai2 and Twist1 and lack of expression of neural markers such as Sox2, Olig2 or GFAP. Indeed, these cells expressed markers typical of smooth muscle vascular cells such as Calponin, Caldesmone and Acta2 (Smooth muscle actin). These cells could not differentiate into chondrocytes, adipocytes, neuronal and glial cells, however they readily mineralized when placed in osteogenic conditions. Further characterization allowed us to identify the Nkx6.1 transcription factor as a marker for these cells. Nkx6.1 was expressed in vivo by CNS vascular muscular cells located in the parenchyma and the meninges.</p> <p>Conclusion</p> <p>Smooth muscle cells expressing Nestin and Nkx6.1 is the main cell population derived from culturing human spinal cord cells in adherent conditions with serum. Mineralization of these cells in vitro could represent a valuable model for studying calcifications of CNS vessels which are observed in pathological situations or as part of the normal aging. In addition, long term propagation of these cells will allow the study of their interaction with other CNS cells and their implication in scar formation during spinal cord injury.</p

Les cellules souches neurales médullaires (Organisation de la niche et rôle de la molécule d adhérence OCAM dans le contrôle de leurs propriétés)

La découverte de cellules souches neurales (CSN) dans la moelle épinière a ouvert de nouvelles perspectives en matière de réparation des lésions médullaires par stimulation des cellules souches endogènes. Un pré-requis à l'établissement de telles stratégies thérapeutiques réside dans la connaissance de l'identité de ces cellules souches ainsi que des mécanismes contrôlant leur proliférant et leur différenciation. C'est dans ce but qu'à été entrepris ce travail de thèse qui s'organise en deux parties : dans un premier temps, nous avons identifié les cellules souches médullaires comme étant des cellules GFAP+ de morphologie radiaire localisées dans la partie dorsale du canal de l'épendyme. Nous avons également montré que ces cellules résidaient au sein d'une niche exprimant de nombreuses signalisations (CD15, Jag1, DAN, Hes1). Plus curieusement, cette niche présente des caractéristiques mésenchymateuses telle que l'expression du facteur de transcription Zeb1 qui s'avère nécessaire à la survie des cellules souches. Dans la deuxième partie de cette thèse, nous avons étudié le rôle de la molécule d'adhérence OCAM dans le contrôle des propriétés des cellules souches neurales médullaires. Nous avons ainsi montré que OCAM était exprimée par les CSN aussi bien in vitro dans le modèle des neurosphères qu'in vivo dans la moelle épinière embryonnaire de souris. Cette molécule est secrétée dans le milieu extracellulaire et agit comme un inhibiteur de la prolifération et de l'autorenouvellement des cellules souches. Ces résultats constituent un nouveau pas dans la compréhension des mécanismes de régulation des propriétés des CSNMONTPELLIER-BU Sciences (341722106) / SudocSudocFranceF

The spinal cord ependymal region: A stem cell niche in the caudal central nervous system

peer reviewedIn the brain, specific signalling pathways localized in highly organized regions called niches, allow the persistence of a pool of stem and progenitor cells that generate new neurons and glial cells in adulthood. Much less is known on the spinal cord central canal niche where a sustained adult neurogenesis is not observed. Here we review our current knowledge of this caudal niche in normal and pathological situations. Far from being a simple layer of homogenous cells, this region is composed of several cell types localized at specific locations, expressing characteristic markers and with different morphologies and functions. We further report on a screen of online geneexpression databases to better define this spinal cord niche. Several genes were found to be preferentially expressed within or around the central canal region (Bmp6, CXCR4, Gdf10, Fzd3, Mdk, Nrtn, Rbp1, Shh, Sox4, Wnt7a) some of which by specific cellular subtypes. In depth characterization of the spinal cord niche constitutes a framework to make the most out of this endogenous cell pool in spinal cord disorders

Caractérisation des cellules souches et précurseurs neurales et étude des déterminants moléculaires régulant leur prolifération et leur différenciation

Les cytokines et les molécules d adhérence sont des signaux clés de l ontogénèse du système nerveux. Nous avons étudié leurs rôles in vitro dans le contrôle de la prolifération et de la différenciation des cellules souches neurales de la moelle épinière. Par un criblage à grande échelle, nous avons montré que ces cellules expriment un ensemble de récepteurs aux cytokines dont l activation régule leur croissance. Elles possèdent notamment le récepteur B aux endothélines qui, ajoutées de manière exogène induisent l augmentation de leur croissance. L activation des récepteurs aux cytokines CNTF, BMP7, IFNgamma et TNFalpha réduit au contraire leur prolifération et provoque une diminution drastique de la différenciation en oligodendrocytes. Nous avons par ailleurs montré que les cellules souches expriment des cytokines endogènes dont certaines sont régulées par les facteurs de croissance FGF et EGF. Notamment, les BMP endogènes sont largement impliquées dans la différenciation astrocytaire tandis que le CNTF endogène contrôle l apoptose des cellules pendant leur croissance et le niveau d expression de la GFAP après leur différenciation. Parallèlement au rôle des cytokines, celui des molécules d adhérence dans le contrôle de la destinée des cellules souches neurales a été examiné. Nous avons établi que in vivo et in vitro les cellules souches neurales de moelle expriment fortement NCAM2. A E13, durant le développement de la moelle, cette protéine est présente dans la plupart des cellules prolifératives et est co-exprimée avec des marqueurs de cellules gliales radiaires et neuronales. In vitro, NCAM2 est exprimée par la glie radiaire et est exclusivement retrouvée après différenciation, dans les lignages neuronal et oligodendrocytaireCytokines and adhesion molecules are key signals during CNS ontogenesis. We have studied in vitro their role in the proliferation and differentiation of spinal cord neural stem cells. Using a gene-array strategy, we showed that these cells express a wide array of cytokine receptors that upon activation regulates their growth. Neural stem cells notably express the endothelin receptor B, and exogenously added endothelins increase their growth. On the contrary, activation of endogenous receptors for the cytokines CNTF, BMP7, IFNgamma and TNFalpha induces a growth decrease together with a drastic reduction of the oligodendrocytic differentiation. We also found that neural stem cells express endogenous cytokines some of which are tightly regulated by growth factors (bFGF and EGF). Notably, endogenous BMPs are largely involved in the astrocytic differentiation whereas endogenous CNTF controls apoptosis of cells during their growth and regulates GFAP expression after their differentiation. In addition to cytokines, the control of neural stem cells fate by adhesion molecules has been examined. We found that in vivo and in vitro, putative spinal cord neural stem cells strongly express NCAM2. At E13, during spinal cord development, NCAM2 is present in most of the proliferating cells and colabelled with markers of radial glia and neuronal cells. In vitro, NCAM2 is expressed by radial glia cells during proliferation then on differentiation it is specifically present on neurons and oligodendrocytes excluding astrocytesMONTPELLIER-BU Sciences (341722106) / SudocSudocFranceF

Rôle de NKX2-2, NGN2 et DCX dans la prolifération, différenciation et migration des cellules tumorales de glioblastomes

Les Glioblastomes (Gb) sont des tumeurs primaires du SNC les plus fréquentes et sont particulièrement agressives car résistantes à la radio/chimiothérapie. Elles présentent généralement une composante solide et infiltrante. Cette dernière étant difficile à éliminer par la chirurgie sera en partie responsable de la récurrence de la tumeur. Une des avancées majeures du domaine est la mise en évidence dans les Gb de sous populations présentant des caractéristiques de précurseurs neuraux. Ces cellules cancéreuses utilisent des réseaux de gènes spécifiques pour maintenir leur prolifération et leur état indifférencié. Une approche possible pour éliminer ces cellules cancéreuses serait de cibler les facteurs de transcription impliqués dans la prolifération ou encore de forcer leur différenciation. Dans ce but, j'ai étudié le rôle de NKX2.2 et NGN2 à partir de 3 cultures primaires multipotentes. Les résultats montrent que l'expression de NKX2.2 dans ces cultures est nécessaire pour la survie, la prolifération et la capacité à former des neurosphères. A l'inverse, la surexpression de NGN2 conduit à une apoptose massive, à un arrêt de la prolifération avec formation de neurones dont certains sont électrophysiologiquement actifs. Une approche différente consisterait à cibler une des protéines impliquées dans la migration pour limiter la composante infiltrante. Des études antérieures ont montrées un rôle clef de DCX dans la migration des jeunes neurones au cours du développement. La forte expression de DCX dans certains Gb m'a conduit à étudier la régulation et le rôle de ce gène. In vitro, les résultats obtenus montrent que DCX est exprimé par une sous population de cellules. La purification des cellules Dcx+ ainsi qu'une étude clonale a permis de montrer qu'elles se comportent comme des progéniteurs multipotents avec une capacité d'autorenouvellement restreinte. Par ailleurs, j'ai montré que les cellules Dcx+ peuvent réverter vers un état Dcx- et que le gène Dcx est régulé par les voies NOTCH et SHH.Glioblastomas (GB) are the most common primary tumors of the CNS and are particularly resistant to radio/chemotherapy. They generally have a solid and infiltrative component. The latter being difficult to remove by surgery will be partly responsible for tumor recurrence. One of the major advances in the field is highlighted in the Gb of subpopulations with features of neural precursors. Cancer cells use specific gene networks to maintain their proliferation and undifferentiated state. One approach to eliminate these cancer cells would be to target transcription factors involved in the proliferation or to force their differentiation. To this end, I studied the role of NKX2.2 and NGN2 from 3 primary multipotent cultures. The results show that NKX2.2 expression in these cultures is necessary for survival, proliferation and ability to form neurospheres. Conversely, overexpression of NGN2 led to massive apoptosis, proliferation arrest with formation of neurons, some of which are electrophysiologically active. A different approach would be to target proteins involved in migration to limit the invasive component. Previous studies have shown a key role of DCX in the migration of young neurons during development. The strong expression of DCX in some Gb led me to study the regulation and the role of this gene. In vitro, the results show that DCX is expressed by a subpopulation of cells. Purification of Dcx+ cells and clonal study has shown that they behave as multipotent progenitors with limited self-renewal capacity. I also found that Dcx+ cells can revert back to a Dcx- state and that DCX is regulated by SHH and NOTCH pathways.MONTPELLIER-BU Sciences (341722106) / SudocSudocFranceF

'Gerardi Lud. Flora provincialis'

International audienceAmyotrophic lateral sclerosis (ALS) is characterized by a gradual muscular paralysis resulting from progressive motoneurons death. ALS etiology remains unknown although it has been demonstrated to be a multifactorial disease involving several cellular partners. There is currently no effective treatment. Even if the effect of exercise is under investigation for many years, whether physical exercise is beneficial or harmful is still under debate

Vascular Transdifferentiation in the CNS: A Focus on Neural and Glioblastoma Stem-Like Cells

International audienceGlioblastomas are devastating and extensively vascularized brain tumors from which glioblastoma stem-like cells (GSCs) have been isolated by many groups. These cells have a high tumorigenic potential and the capacity to generate heterogeneous phenotypes. There is growing evidence to support the possibility that these cells are derived from the accumulation of mutations in adult neural stem cells (NSCs) as well as in oligodendrocyte progenitors. It was recently reported that GSCs could transdifferentiate into endothelial-like and pericyte-like cells both in vitro and in vivo, notably under the influence of Notch and TGFβ signaling pathways. Vascular cells derived from GBM cells were also observed directly in patient samples. These results could lead to new directions for designing original therapeutic approaches against GBM neovascularization but this specific reprogramming requires further molecular investigations. Transdifferentiation of nontumoral neural stem cells into vascular cells has also been described and conversely vascular cells may generate neural stem cells. In this review, we present and discuss these recent data. As some of them appear controversial, further validation will be needed using new technical approaches such as high throughput profiling and functional analyses to avoid experimental pitfalls and misinterpretations