The crystal structure of the Split End protein SHARP adds a new layer of complexity to proteins containing RNA recognition motifs

The Split Ends (SPEN) protein was originally discovered in Drosophila in the late 1990s. Since then, homologous proteins have been identified in eukaryotic species ranging from plants to humans. Every family member contains three predicted RNA recognition motifs (RRMs) in the N-terminal region of the protein. We have determined the crystal structure of the region of the human SPEN homolog that contains these RRMs—the SMRT/HDAC1 Associated Repressor Protein (SHARP), at 2.0 Å resolution. SHARP is a co-regulator of the nuclear receptors. We demonstrate that two of the three RRMs, namely RRM3 and RRM4, interact via a highly conserved interface. Furthermore, we show that the RRM3-RRM4 block is the main platform mediating the stable association with the H12-H13 substructure found in the steroid receptor RNA activator (SRA), a long, non-coding RNA previously shown to play a crucial role in nuclear receptor transcriptional regulation. We determine that SHARP association with SRA relies on both single- and double-stranded RNA sequences. The crystal structure of the SHARP-RRM fragment, together with the associated RNA-binding studies, extend the repertoire of nucleic acid binding properties of RRM domains suggesting a new hypothesis for a better understanding of SPEN protein function

Introduction

Intitulé « Parcours doctoral en SIC : littérature scientifique, méthodes et terrains », ce dossier aborde diverses problématiques soulevées par l’itinéraire scientifique de neuf jeunes chercheurs. La thèse est, en effet, un chemin semé d’embûches, au cours duquel les doctorants se forment au difficile, mais fécond, apprentissage de la recherche. Il s’agit d’une expérience qui marque le cheminement universitaire et fait émerger des questionnements qui trouvent un écho bien au-delà du simple ca..

Exploitation of the structure-function relationship of the vitamin D nuclear receptor for the deciphering of the mechanisms of vitamin D signaling

L'expression de l'information génétique est régulée par des facteurs de transcription. Parmi ces facteurs, le récepteur de la vitamine D (VDR) appartient à la famille des récepteurs nucléaires, activables par la fixation d'un ligand. La forme active de la vitamine D, le Calcitriol, est le ligand naturel du VDR et est impliqué dans de nombreuses fonctions biologiques telles que l'homéostasie du calcium et du phosphate, l'inflammation, la différenciation et la prolifération cellulaires et l'apoptose. Cependant, ses actions intrinsèques génomiques s'accompagnent d'effets hypercalcémiques non-génomiques qui limitent ses applications thérapeutiques. Dans l'objectif de dissocier les actions anti-tumorales du Calcitriol de ses effets hypercalcémiques pour des applications thérapeutiques, le challenge consiste à différencier précisément les acteurs de la voie non-génomique de ceux de la voie génomique. Précédemment, le résidu Leu337 du VDR de poisson-zèbre a été identifié comme jouant un rôle majeur dans l'adaptabilité du domaine de fixation du ligand. Une étude classique de mutagenèse a mis en évidence un résultat surprenant : le mutant VDR Leu337His abolit l'activité génomique du VDR en présence du Calcitriol mais présente une activité transcriptionnelle identique au récepteur sauvage en présence du ligand synthétique à double chaîne latérale Gemini. Mon travail de thèse a consisté à comprendre les bases structurales de cette sélectivité. Les résultats présentés montrent que tout comme les VDR sauvages humain et du poisson-zèbre, les VDR mutés de ces deux espèces se comportent de manière similaire en présence des ligands Calcitriol et Gemini en termes d'affinités de liaison et de transactivation. L'étude structurale a mis en évidence une interaction cruciale pour la stabilisation du ligand naturel. En revanche, la mutation Leu337His a un effet silencieux en présence du Gemini et de deux analogues du Gemini que nous avons étudiés. De plus, les résultats structuraux révèlent que les ligands à deux chaînes latérales sont moins sensibles aux modifications affectant le réseau de contacts entre les résidus de la poche et le ligand. Mes travaux de thèse ont permis d'établir les bases structurales et moléculaires pour la création d'un modèle animal original (souris génétiquement modifiée exprimant le VDR muté) qui permettra d'éteindre ou d'allumer le VDR nucléaire selon la présence de Calcitriol ou de Gemini, et ainsi de dissocier la voie génomique de la voie nongénomique induite par le Calcitriol. Ce travail de thèse s'inscrit dans une approche pluridisciplinaire, allant de l'atome à l'organisme et l'intégration de l'ensemble des données in vivo permettra une meilleure compréhension de la signalisation induite par l'hormone Calcitriol et le développement de nouveaux traitements hautement spécifiques.Genetic expression is regulated by transcriptional factors. Among them, the Vitamin D receptor (VDR) belongs to the superfamily of nuclear receptors which adopt their active conformation upon ligand binding. The active form of Vitamin D, Calcitriol is the natural ligand of VDR and plays important roles in several biological functions such as calcium and phosphate homeostasis, inflammation, cell differentiation and proliferation and apoptosis. However, its intrinsic genomic actions are accompanied by hypercalemic nongenomic effects which limit the use of Calcitriol in therapeutic treatments. To further dissociate the antitumor actions of Calcitriol from its hypercalcemic effects, the challenge is to decipher the mechanisms involved in the non-genomic pathway from those involved in the genomic one. Previously, we identified the Leu337 of zebrafish VDR as a key residue in the adaptability of the ligand binding domain. Then, a classical mutagenesis study stressed a surprising finding : the VDR Leu337His abolishes the genomic activity of VDR in presence of Calcitriol but not in presence of the synthetic double-chained Gemini ligand. The results of my thesis confirm that as for the wild-type human and zebrafish VDRs, both zebrafish VDR Leu337His and human VDR Leu309His behave similarly in presence of Calcitriol and Gemini in terms of ligand binding and transactivation. The structural study conducted in parallel emphasizes a crucial interaction for the stabilization of Calcitriol. In sharp contrast, the mutation Leu337His has a neutral incidence on the stabilization of Gemini and the two Gemini derivatives studied. Moreover, the structural findings reveal that double-chained ligands are less sensitive to structural modifications targeting the network of ligand/residues interactions. This study relates the structural and molecular basis for the design of an original animal model (knock-in-mice expressing the corresponding mutation Leu337His) which will allows us to switch on/off the nuclear VDR following the presence of Calcitriol or Gemini, and to gain insight into the non-genomic pathway induced by Calcitriol. My work enrolls a multi-disciplinary approach, from atomic structure to the organism and the integration of the in vivo data will provide us with a better understanding of the Calcitriol signalization and with the development of highly specific new treatments

Exploitation of the structure-function relationship of the vitamin D nuclear receptor for the deciphering of the mechanisms of vitamin D signaling

L'expression de l'information génétique est régulée par des facteurs de transcription. Parmi ces facteurs, le récepteur de la vitamine D (VDR) appartient à la famille des récepteurs nucléaires, activables par la fixation d'un ligand. La forme active de laGenetic expression is regulated by transcriptional factors. Among them, the Vitamin D receptor (VDR) belongs to the superfamily of nuclear receptors which adopt their active conformation upon ligand binding. The active form of Vitamin D, Calcitriol is th

EXPLOITATION DE LA RELATION STRUCTURE-FONCTION DU RÉCEPTEUR NUCLÉAIRE DE LA VITAMINE D POUR L'ÉLUCIDATION DES MÉCANISMES DE LA SIGNALISATION DE LA VITAMINE D.

Genetic expression is regulated by transcriptional factors. Among them, the Vitamin D receptor (VDR) belongs to the superfamily of nuclear receptors which adopt their active conformation upon ligand binding. The active form of Vitamin D, Calcitriol is the natural ligand of VDR and plays important roles in several biological functions such as calcium and phosphate homeostasis, inflammation, cell differentiation and proliferation and apoptosis. However, its intrinsic genomic actions are accompanied by hypercalemic non-genomic effects which limit the use of Calcitriol in therapeutic treatments. To further dissociate the anti-tumor actions of Calcitriol from its hypercalcemic effects, the challenge is to decipher the mechanisms involved in the non-genomic pathway from those involved in the genomic one. Previously, we identified the Leu337 of zebrafish VDR as a key residue in the adaptability of the ligand binding domain. Then, a classical mutagenesis study stressed a surprising finding: the VDR Leu337His abolishes the genomic activity of VDR in presence of Calcitriol but not in presence of the synthetic double-chained Gemini ligand. The results of my thesis confirm that as for the wild-type human and zebrafish VDRs, both zebrafish VDR Leu337His and human VDR Leu309His behave similarly in presence of Calcitriol and Gemini in terms of ligand binding and transactivation. The structural study conducted in parallel emphasizes a crucial interaction for the stabilization of Calcitriol. In sharp contrast, the mutation Leu337His has a neutral incidence on the stabilization of Gemini and the two Gemini derivatives studied. Moreover, the structural findings reveal that double-chained ligands are less sensitive to structural modifications targeting the network of ligand/residues interactions. This study relates the structural and molecular basis for the design of an original in vivo animal model (knock-in-mice expressing the corresponding mutation Leu337His) which will allows us to switch on/off the nuclear VDR following the presence of Calcitriol or Gemini, and to gain insight into the non-genomic pathway induced by Calcitriol. My work enrolls a multi-disciplinary approach, from atomic structure to the organism and the integration of the in vivo data will provide us with a better understanding of the Calcitriol signalization and with the development of highly specific new treatments.L'expression de l'information génétique est régulée par des facteurs de transcription. Parmi ces facteurs, le récepteur de la vitamine D (VDR) appartient à la famille des récepteurs nucléaires, activables par la fixation d'un ligand. La forme active de la vitamine D, le Calcitriol, est le ligand naturel du VDR et est impliqué dans de nombreuses fonctions biologiques telles que l'homéostasie du calcium et du phosphate, l'inflammation, la différenciation et la prolifération cellulaires et l'apoptose. Cependant, ses actions intrinsèques génomiques s'accompagnent d'effets hypercalcémiques non-génomiques qui limitent ses applications thérapeutiques. Dans l'objectif de dissocier les actions anti-tumorales du Calcitriol de ses effets hypercalcémiques pour des applications thérapeutiques, le challenge consiste à différencier précisément les acteurs de la voie non-génomique de ceux de la voie génomique. Précédemment, le résidu Leu337 du VDR de poisson-zèbre a été identifié comme jouant un rôle majeur dans l'adaptabilité du domaine de fixation du ligand. Une étude classique de mutagenèse a mis en évidence un résultat surprenant : le mutant VDR Leu337His abolit l'activité génomique du VDR en présence du Calcitriol mais présente une activité transcriptionnelle identique au récepteur sauvage en présence du ligand synthétique à double chaîne latérale Gemini. Mon travail de thèse a consiste à comprendre les bases structurales de cette sélectivité. Les résultats présentés montrent que tout comme les VDR sauvages humain et du poisson-zèbre, les VDR mutés de ces deux espèces se comportent de manière similaire en présence des ligands Calcitriol et Gemini en termes d'affinités de liaison et de transactivation. L'étude structurale a mis en évidence une interaction cruciale pour la stabilisation du ligand naturel. En revanche, la mutation Leu337His a un effet silencieux en présence du Gemini et de deux analogues du Gemini que nous avons étudiés. De plus, les résultats structuraux révèlent que les ligands à deux chaînes latérales sont moins sensibles aux modifications affectant le réseau de contacts entre les résidus de la poche et le ligand. Mes travaux de thèse ont permis d'établir les bases structurales et moléculaires pour la création d'un modèle animal in vivo original (souris génétiquement modifiée exprimant le VDR muté) qui permettra d'éteindre ou d'allumer le VDR nucléaire selon la présence de Calcitriol ou de Gemini, et ainsi de dissocier la voie génomique de la voie non-génomique induite par le Calcitriol. Ce travail de thèse s'inscrit dans une approche pluridisciplinaire, allant de l'atome à l'organisme et l'intégration de l'ensemble des données in vivo permettra une meilleure compréhension de la signalisation induite par l'hormone Calcitriol et le développement de nouveaux traitements hautement spécifiques

Exploitation de la relation structure-fonction du récepteur nucléaire de la vitamine D pour l élucidation des mécanismes de la signalisation de la vitamine D

L expression de l information génétique est régulée par des facteurs de transcription. Parmi ces facteurs, le récepteur de la vitamine D (VDR) appartient à la famille des récepteurs nucléaires, activables par la fixation d un ligand. La forme active de la vitamine D, le Calcitriol, est le ligand naturel du VDR et est impliqué dans de nombreuses fonctions biologiques telles que l homéostasie du calcium et du phosphate, l inflammation, la différenciation et la prolifération cellulaires et l apoptose. Cependant, ses actions intrinsèques génomiques s accompagnent d effets hypercalcémiques non-génomiques qui limitent ses applications thérapeutiques. Dans l objectif de dissocier les actions anti-tumorales du Calcitriol de ses effets hypercalcémiques pour des applications thérapeutiques, le challenge consiste à différencier précisément les acteurs de la voie non-génomique de ceux de la voie génomique. Précédemment, le résidu Leu337 du VDR de poisson-zèbre a été identifié comme jouant un rôle majeur dans l adaptabilité du domaine de fixation du ligand. Une étude classique de mutagenèse a mis en évidence un résultat surprenant : le mutant VDR Leu337His abolit l activité génomique du VDR en présence du Calcitriol mais présente une activité transcriptionnelle identique au récepteur sauvage en présence du ligand synthétique à double chaîne latérale Gemini. Mon travail de thèse a consisté à comprendre les bases structurales de cette sélectivité. Les résultats présentés montrent que tout comme les VDR sauvages humain et du poisson-zèbre, les VDR mutés de ces deux espèces se comportent de manière similaire en présence des ligands Calcitriol et Gemini en termes d affinités de liaison et de transactivation. L étude structurale a mis en évidence une interaction cruciale pour la stabilisation du ligand naturel. En revanche, la mutation Leu337His a un effet silencieux en présence du Gemini et de deux analogues du Gemini que nous avons étudiés. De plus, les résultats structuraux révèlent que les ligands à deux chaînes latérales sont moins sensibles aux modifications affectant le réseau de contacts entre les résidus de la poche et le ligand. Mes travaux de thèse ont permis d établir les bases structurales et moléculaires pour la création d un modèle animal original (souris génétiquement modifiée exprimant le VDR muté) qui permettra d éteindre ou d allumer le VDR nucléaire selon la présence de Calcitriol ou de Gemini, et ainsi de dissocier la voie génomique de la voie nongénomique induite par le Calcitriol. Ce travail de thèse s inscrit dans une approche pluridisciplinaire, allant de l atome à l organisme et l intégration de l ensemble des données in vivo permettra une meilleure compréhension de la signalisation induite par l hormone Calcitriol et le développement de nouveaux traitements hautement spécifiques.Genetic expression is regulated by transcriptional factors. Among them, the Vitamin D receptor (VDR) belongs to the superfamily of nuclear receptors which adopt their active conformation upon ligand binding. The active form of Vitamin D, Calcitriol is the natural ligand of VDR and plays important roles in several biological functions such as calcium and phosphate homeostasis, inflammation, cell differentiation and proliferation and apoptosis. However, its intrinsic genomic actions are accompanied by hypercalemic nongenomic effects which limit the use of Calcitriol in therapeutic treatments. To further dissociate the antitumor actions of Calcitriol from its hypercalcemic effects, the challenge is to decipher the mechanisms involved in the non-genomic pathway from those involved in the genomic one. Previously, we identified the Leu337 of zebrafish VDR as a key residue in the adaptability of the ligand binding domain. Then, a classical mutagenesis study stressed a surprising finding : the VDR Leu337His abolishes the genomic activity of VDR in presence of Calcitriol but not in presence of the synthetic double-chained Gemini ligand. The results of my thesis confirm that as for the wild-type human and zebrafish VDRs, both zebrafish VDR Leu337His and human VDR Leu309His behave similarly in presence of Calcitriol and Gemini in terms of ligand binding and transactivation. The structural study conducted in parallel emphasizes a crucial interaction for the stabilization of Calcitriol. In sharp contrast, the mutation Leu337His has a neutral incidence on the stabilization of Gemini and the two Gemini derivatives studied. Moreover, the structural findings reveal that double-chained ligands are less sensitive to structural modifications targeting the network of ligand/residues interactions. This study relates the structural and molecular basis for the design of an original animal model (knock-in-mice expressing the corresponding mutation Leu337His) which will allows us to switch on/off the nuclear VDR following the presence of Calcitriol or Gemini, and to gain insight into the non-genomic pathway induced by Calcitriol. My work enrolls a multi-disciplinary approach, from atomic structure to the organism and the integration of the in vivo data will provide us with a better understanding of the Calcitriol signalization and with the development of highly specific new treatments.STRASBOURG-Sc. et Techniques (674822102) / SudocSudocFranceF

Steroid Receptor RNA Activator (SRA) Modification by the Human Pseudouridine Synthase 1 (hPus1p): RNA Binding, Activity, and Atomic Model

The most abundant of the modified nucleosides, and once considered as the "fifth" nucleotide in RNA, is pseudouridine, which results from the action of pseudouridine synthases. Recently, the mammalian pseudouridine synthase 1 (hPus1p) has been reported to modulate class I and class II nuclear receptor responses through its ability to modify the Steroid receptor RNA Activator (SRA). These findings highlight a new level of regulation in nuclear receptor (NR)-mediated transcriptional responses. We have characterised the RNA association and activity of the human Pus1p enzyme with its unusual SRA substrate. We validate that the minimal RNA fragment within SRA, named H7, is necessary for both the association and modification by hPus1p. Furthermore, we have determined the crystal structure of the catalytic domain of hPus1p at 2.0 Å resolution, alone and in a complex with several molecules present during crystallisation. This model shows an extended C-terminal helix specifically found in the eukaryotic protein, which may prevent the enzyme from forming a homodimer, both in the crystal lattice and in solution. Our biochemical and structural data help to understand the hPus1p active site architecture, and detail its particular requirements with regard to one of its nuclear substrates, the non-coding RNA SRA

The crystal structure of the Split End protein SHARP adds a new layer of complexity to proteins containing RNA recognition motifs

The Split Ends (SPEN) protein was originally discovered in Drosophila in the late 1990s. Since then, homologous proteins have been identified in eukaryotic species ranging from plants to humans. Every family member contains three predicted RNA recognition motifs (RRMs) in the N-terminal region of the protein. We have determined the crystal structure of the region of the human SPEN homolog that contains these RRMs-the SMRT/HDAC1 Associated Repressor Protein (SHARP), at 2.0 Å resolution. SHARP is a co-regulator of the nuclear receptors. We demonstrate that two of the three RRMs, namely RRM3 and RRM4, interact via a highly conserved interface. Furthermore, we show that the RRM3-RRM4 block is the main platform mediating the stable association with the H12-H13 substructure found in the steroid receptor RNA activator (SRA), a long, non-coding RNA previously shown to play a crucial role in nuclear receptor transcriptional regulation. We determine that SHARP association with SRA relies on both single- and double-stranded RNA sequences. The crystal structure of the SHARP-RRM fragment, together with the associated RNA-binding studies, extend the repertoire of nucleic acid binding properties of RRM domains suggesting a new hypothesis for a better understanding of SPEN protein functions

Pseudouridine incorporation measured with various hPus1p enzymes.

a<p>The activities are in moles ψ/moles RNA with the mean of three separate assays and standard deviation (SD). With all of the substrates the maximum activity should be ∼1.0 moles ψ/moles RNA. Background levels of activity seen with Lac (β-galactosidase) have been subtracted. ND indicates that the combination of D146A ΔhPus1p D146A and the corresponding RNA substrate was not determined.</p

Close view of the active site residues from the ΔhPus1p and the ΔhPus1p D146A crystal structures.

<p>(A) A D-lysine molecule from the crystallisation condition is bound within the active site of molecule A of the ΔhPus1p enzyme. (B) A D-glutamate molecule is bound in the active site of molecule B of the same crystal structure. (C) A HEPES molecule is found in the active site of the inactive ΔhPus1p D146A crystal structure. Amino acids in the active site are shown and coloured as in <a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0094610#pone-0094610-g002" target="_blank">Figure 2B</a>. Bound molecules are shown as sticks and coloured according to atom type (carbon, nitrogen, oxygen, and sulphur are magenta, blue, red, and gold, respectively). Water molecules are shown as red spheres. Hydrogen bonds between the amino acids and the protein atoms are indicated as black dash lines.</p