Estudo de novos peptídeos preditos in silico visando a indução de resposta imune protetora contra a infecção experimental de camundongos C57BL/6 por Toxoplasma gondii

Toxoplasmosis is a parasitic disease caused by Toxoplasma gondii, an intracellular protozoan capable of infecting a wide range of hosts. The infection usually causes no disease in healthy individuals, but it is especially severe for immunocompromised patients or during pregnancy, situations when the parasite could have an environment more favorable for its multiplication. Several species of animals also are infected by this parasite, causing abortion and livestock economic losses as well. The existing treatment consists of drugs with high toxicity to patient, being not appropriate particularly for the fetuses. Therefore, a vaccine capable of prevent the disease or reducing the consequences would be extremely beneficial, both from medical and veterinary point of view. So far, there is no vaccine available to prevent the disease and only one vaccine capable of reducing abortion induced by this parasite is used currently only in sheeps. Considering these points, we proposed to evaluate in the present study the immune response induced by synthetic peptides derived from immunodominant proteins (SRS, ROP, MIC and GRA) of this parasite. First, 22 peptides were selected considering the highest scores for B cell epitope prediction by analysis in silico. All of them were screened, it was selected 11 of them, according with their higher reactivity against serum samples from infected animals, based on their organelle location and used to immunize C57Bl/6 mice. Afterwards, animals immunized were infected with a sublethal dose of 10 cysts of ME49 strain 45 days after the first step of immunization, blood and brains from immunized animals were collected, being posteriorly used to measure cytokines production, antibody titers and to quantify the parasite. Cytokines analysis showed that all experimental groups had IL-10, IL-4, IL-6, IL-2, IFN-ɣ and IL-17 levels lower than non-immunized group. Also, the cytokines levels from SRS and MIC immunized groups were similar to soluble Toxoplasma antigen (STAg) group. The immunized group with peptides from surface antigen proteins related sequences (SRS) and micronemes (MIC) had significant lower parasite DNA than non-immunized group (PBS), similarly to the results obtained from STAg immunized group. Another groups of immunized animals were immunized with the same peptide groups and submitted to challenge with 40 cysts. The group SRS had the longest survival time, but the results were not statistically different from PBS group. In summary, peptides from SRS and MIC proteins showed promising results as vaccine antigens in a murine model and further studies are needed to confirm their potential.Mestre em Imunologia e Parasitologia AplicadasA toxoplasmose é uma doença parasitária causado por Toxoplasma gondii, um protozoário intracelular obrigatório capaz de infectar uma grande variedade de hospedeiros. A infecção normalmente não apresenta sintomas em indivíduos saudáveis, mas é especialmente severa em pacientes imunocomprometidos ou durante a gestação, situações nas quais o hospedeiro é mais permissivo à multiplicação do parasito. Diversas espécies de animais também podem ser infectadas por esse parasito, causando abortos e perdas econômicas em rebanhos. Os tratamentos existentes consistem de drogas com alta toxicidade para o paciente, não sendo apropriado para gestantes e fetos. Considerando essa dificuldade de tratamento, uma vacina capaz de prevenir a doença ou reduzir as sequelas causadas por ela seria extremamente benéfico, tanto do ponto de visto médico como do veterinário. Até hoje, no entanto, não existem nenhuma vacina, disponível comercialmente, capaz de evitar a infecção pelo T. gondii, exceto por uma vacina capaz de reduzir abortos causados por esse parasito em rebanhos de ovinos. Considerando estes pontos, no presente estudo nós propusemos avaliar a resposta imunológica induzida por peptídeos sintéticos derivados de proteínas imunodominantes (SRS, ROP, MIC e GRA) deste parasito. Primeiramente, 22 peptídeos foram selecionados, considerando os valores de predição para epítopos de células B obtidos por análise in silico. Todos foram triados utilizando o soro de animais infectados, sendo que 11 peptídeos foram selecionados de acordo com vários critérios, entre eles a localização da organela da qual se originaram e a sororreatividade alcançada na triagem. Os peptídeos selecionados foram divididos em grupos e usados para imunizar camundongos C57Bl/6. Os animais imunizados foram infectados 45 dias após a primeira imunização com uma dose subletal de 10 cistos da cepa ME49. Sangue e cérebro desses animais foram coletados, sendo posteriormente utilizados para mensurar a produção de citocinas, títulos de anticorpos a quantificar a carga parasitária. A análise de citocinas mostrou que todos grupos experimentais tiveram níveis de IL-10, IL-4, IL-6, IL-2, IFN-ɣ e IL-17 menores que o grupo não imunizado. Além disso, os níveis de citocinas dos grupos SRS e MIC foram similares aos do grupo imunizado com antígeno solúbel de T. gondii (STAg). Os grupos imunizados com sequências relacionadas aos antígenos de superfície (SRS) e micronemas (MIC) tiveram significativamente menos DNA parasitário que o grupo não imunizado (PBS), similar aos resultados obtidos do grupo imunizado com STAg. Outros grupos de animais foram imunizados como descritos nesse trabalho e submetidos a desafio com 40 cistos. O grupo SRS teve o maior tempo de sobrevivência, mas os resultados não foram estatisticamente diferentes do grupo PBS. No presente trabalho, verificamos que peptídeos derivados das proteínas SRS e MIC demonstraram resultados promissores como antígenos vacinais no modelo murinho C57Bl/6, sendo que estudos adicionais são necessários para confirmar seus potenciais

Evaluation of epitopes derived from microneme MIC8 and surface antigen SRS52A from Toxoplasma gondii, associated with different adjuvants, as possible vaccine antigens against toxoplasmosis

Toxoplasmosis, a zoonosis caused by the mandatory intracellular protozoan Toxoplasma gondii, is a disease virtually capable of infecting any homeothermic host, with cases recorded in several species of birds and mammals, including humans. This disease is relevant not only for humans, since infection with this protozoan is associated with substantial financial losses in livestock, especially in sheep and goats. Infected humans can be asymptomatic or have several different symptoms, the most serious of which are usually seen in individuals who belong to the groups at risk for this disease, such as immunocompromised patients or pregnant women whose concepts can be infected. In the hypothesis of vertical transmission from the pregnant woman to the fetus, toxoplasmosis can cause several symptoms, which can be less severe, such as cases of mild chorioretinitis, even the most severe manifestations, characterized by malformations of the central nervous system from fetus and even intrauterine death and abortion. For immunocompromised individuals, toxoplasmosis also constitutes significant risks, since latent parasitic cysts in the central nervous system can reactivate the inflammatory process, causing neurotoxoplasmosis, which can be fatal. Although it is capable of causing great damage to the host, possibly leading to death or causing sequelae that impair the quality of life of the affected person for the rest of his life, this disease continues to be neglected. As a result of the lack of vigilance and awareness about this disease, both by health professionals and the population in general, several outbreaks occur annually in our country and around the world, always being characterized by the delay in reaching the correct diagnosis. In the present work, we studied an alternative that can mitigate the effects of this disease through the principle of immunoprophylaxis. To achieve this goal, three peptides were predicted containing 15 amino acid residues each, using available prediction tools with the potential to act as epitopes for B cells. The regions were analyzed looking for the two most immunodominant sequences of the secreted protein 8 by the Micronema organelle (MIC8) and one of the sequences related to 52A surface antigens (SRS52A). The synthesized peptides were added immunoadjuvant compounds, such as aluminum hydroxide, or lectin derived from Synadenium carinatum (ScLL), or propranolol, which were used to immunize mice. Tests were carried out to quantify the levels of antibodies and cytokines produced, in addition to the parameters of survival and parasitic load after 30 days of infection. It was observed that all animals immunized with peptides produced specific antibodies to the original protein, except for groups immunized with propranolol. Regarding the analysis of produced cytokines, the groups immunized with ScLL had lower concentrations of cytokines than the non-immunized group, however the ratio of cytokines of the Th1 profile to Th2 was higher. In addition, the animals immunized with peptides and ScLL survived longer than those not immunized, although the difference was not statistically significant. Finally, the parasitic load, when the ScLL group was present, was significantly lower, being around 25% of the load observed in the non-immunized animals. In summary, the results obtained demonstrate that the predicted peptides retained their immunodominant characteristics and, together with ScLL, were able to induce a more effective response against infection, particularly in relation to the chronic phase, thus presenting itself as a potential tool in future prevention studies in the epidemiological chain of toxoplasmosis.CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível SuperiorTese (Doutorado)A toxoplasmose, zoonose causada pelo protozoário intracelular obrigatório Toxoplasma gondii, é um parasita virtualmente capaz de infectar qualquer hospedeiro homeotérmico, possuindo casos registrados em diversas espécies de aves e mamíferos, incluindo humanos. Essa doença apresenta relevância não somente para os seres humanos, uma vez que a infecção por este protozoário está associada a perdas financeiras substanciais na pecuária, principalmente na ovina e caprina. Humanos infectados podem ser assintomáticos ou apresentar diversos sintomas diferentes, sendo que os mais graves usualmente são observados em indivíduos que pertencem aos grupos de risco para essa doença, como os pacientes imunocomprometidos ou gestantes cujos conceptos podem ser infectados. Na hipótese da transmissão vertical da gestante para o concepto, a toxoplasmose pode causar diversos sintomas, que podem ser menos graves, como casos de coriorretinite brandas, até as manisfestações mais severas, caracterizados por mal-formações do sistema nervoso central do feto e até mesmo morte intra-uterina e aborto. Para indivíduos imunocomprometidos, a toxoplasmose também representa riscos significativos, uma vez que os cistos parasitários latentes no sistema nervoso central podem reativar o processo inflamatório, causando neurotoxoplasmose, que pode ser fatal. Ainda que seja capaz de causar grande dano ao hospedeiro, possivelmente levando a óbito ou causando sequelas que prejudiquem a qualidade de vida do indivíduo afetado pelo restante de sua vida, essa doença continua a ser negligenciada. Fruto da falta de vigilância e conscientização sobre essa doença, tanto por parte de profissionais da saúde como da população em geral, acontecem anualmente diversos surtos em nosso país e em todo o mundo, sendo sempre caracterizada pela demora em chegar ao diagnóstico correto. No presente trabalho, estudamos uma alternativa que possa amenizar os efeitos dessa doença por meio do princípio da imunoprofilaxia. Para atingir esse objetivo, foi realizada a predição de três peptídeos contendo 15 resíduos de aminoácidos cada, por meio de ferramentas de predição disponíveis com potencial para atuarem como epitopos para células B. Os trechos foram analisados a partir de duas sequências mais imunodominantes da proteína 8 secretada pela organela Micronema (MIC8) e 1 da sequência relacionada a antígenos de superfície 52A (SRS52A). Aos peptídeos sintetizados foram adicionados compostos imunoadjuvantes, como hidróxido de alumínio, ou lectina derivada de Synadenium carinatum (ScLL), ou propranolol, os quais foram utilizados para imunizar camundongos. Foram realizados ensaios para quantificar os níveis de anticorpos e de citocinas produzidos, em adição aos parâmetros de sobrevivência e da carga parasitária após 30 dias de infecção. Observou-se que todos os animais imunizados com peptídeos produziram anticorpos específicos à proteína original, exceto pelos grupos imunizados com propranolol. Em relação à análise de citocinas produzidas, os grupos imunizados com peptídeos + ScLL tiveram menores concentrações de citocinas, comparados ao grupo não imunizado, porém a razão de citocinas do perfil Th1 por Th2 foi mais alta nos grupos em que o ScLL esteve presente como adjuvante. Além disso, os animais imunizados com peptídeos e ScLL sobreviveram um tempo maior do que os não imunizados, ainda que a diferença não tenha sido estatisticamente significativa. Por fim, a carga parasitária, nos grupos de animais imunizados com formulação na qual ScLL esteve presente, foi significativamente menor, ficando em cerca de 25% da carga observada nos animais não imunizados. Em síntese, os resultados obtidos demonstram que os peptídeos preditos conservaram suas características imunodominantes e juntamente com ScLL, foram capazes de induzir uma resposta de maior eficácia contra a infecção, particularmente em relação à fase crônica, apresentando-se, portanto, como uma ferramenta potencial em estudos futuros de prevenção na cadeia epidemiológica da toxoplasmose

CCp5A protein from Toxoplasma gondii as a serological marker of oocyst-driven infections in humans and domestic animals.

Considering that the current immunoassays are not able to distinguish the infective forms that cause Toxoplasma gondii infection, the present study was carried out to evaluate the reactivity of two recombinant proteins (CCp5A and OWP1) from oocyst/sporozoite, in order to differentiate infections occurring by ingestion of oocysts or tissue cysts. The reactivity of the recombinant proteins was assessed against panels of serum samples from animals (chickens, pigs and mice) that were naturally or experimentally infected by different infective stages of the parasite. Also, we tested sera from humans who have been infected by oocysts during a well-characterized toxoplasmosis outbreak, as well as sera from pregnant women tested IgM+/IgG+ for T. gondii, which source of infection was unknown. Only the sporozoite-specific CCp5A protein was able to differentiate the parasite stage that infected chickens, pigs and mice, with specific reactivity for oocyst-infected animals. Furthermore, the CCp5A showed preferential reactivity for recent infection by oocyst/sporozoite in pigs and mice. In humans, CCp5A showed higher reactivity with serum samples from the outbreak, compared with serum from pregnant women. Altogether, these findings demonstrate the usefulness of the CCp5A protein as a new tool to identify the parasite state of T. gondii infection, allowing its application for diagnosis and epidemiological investigations in animals and humans. The identification of parasite infective stage can help to design effective strategies to minimize severe complications in immunocompromised people and, particularly, in pregnant women to prevent congenital infection