TOWARDS THE DISCOVERY OF OLIGONUCLEOTIDE CROSS-LINKING AGENTS

Oligonucleotide cross-linking agents are expected to become a new class of antisense drugs. They function by first hybridizing with a complementary mRNA and then form a covalent bond to permanently link the mRNA to the oligonucleotide agent. Because of covalent cross-linking, this new class of antisense drugs are expected to have much higher potency than existing ones. Some oligonucleotide cross-linking agents have appeared in the literature, but they have various drawbacks, which include slow cross-linking rate and reversible cross-linking. To address these problems, we designed a series of new cross-linking oligonucleotides with a range of different reactivities. These oligonucleotides were expected to react with complementary mRNA with higher rates and selectivity. To synthesize this new class of cross-linking agents, we used the Dmoc oligonucleotide synthesis technology recently developed in our laboratory. Using this new technology, oligonucleotide deprotection and cleavage were achieved under mild conditions, under which the cross-linking functions in our agents were kept intact. In contrast, if known oligonucleotide synthesis technologies had been used, the cross-linking functions would not have survived. After successful synthesis of the new class of cross-linking oligonucleotides, they were subjected to hybridization with complementary oligonucleotides under various conditions. The progress of the hybridizations was monitored and analyzed with RP-HPLC and MALDI-TOF. At the current stage of the project, the properties of the cross-linking oligonucleotides were found to be less than ideal. However, successful synthesis of potential cross-liking oligonucleotides, development of key procedures and protocols for cross-linking experiments and development of analytical techniques to detect cross-linked products have paved the foundation for us to design and screen a series of similar oligonucleotides. Because as long as we can place the cross-linking function at proximity to a reactive site of complementary oligonucleotide, the two oligonucleotides will be forced to react, we believe that screening a series of oligonucleotides will provide desired cross-linking agents

Antibacterial potential components of Bacillus species and antibiotics residues in branded and unbranded honey samples from Nigeria

Honey is a sweet viscous liquid produced by honey bee, Apis mellifera from the nectar of plants. Honey is a natural product that has been used from ancient times till now as food and for medicinal purpose. This study was carried out to determine the mode of action of Bacillus species and antibiotics residues in branded and unbranded honey samples from Nigeria. Bacilli spp. count was carried out by initially heating diluted honey samples in water bath set at 80°C for 15 min, while total bacterial count was carried out using the pour plate method. Antibacterial activity of identified Bacillus spp on Micrococcus was determined using well-in agar method while the mode of action was carried out by reporter assay method. Detection of tetracycline, gentamycin and streptomycin was analyzed using high performance liquid chromatography (HPLC) column oven L-2300 and Column intensil ODS-3C18 (250 x 4.6 mm). Honey samples (2 g) were extracted for HPLC by deprotenizing using acetonitrile and methanol with flow rate of 1 mL/min and RID detector was used to detect antibiotic residue. Bacilli from honey were characterized physiologically, morphologically and biochemically, they were tentatively identified as Bacilli licheniformis, Bacilli subtilis, Bacilli coagulans, Bacilli cirulans, Bacilli pumilis and Bacilli badius. The most prevalent Bacillus spp. were B. licheniformis and B. subtilis. Total bacteria count for branded honey ranged from 2.2 x 102 to 5.5 x 103 cfu/g, while Bacilli count ranged from nil to 6.2 x 102 cfu/g. For unbranded honey samples, total bacteria count ranged from 7.0 x 103 to 3.5 x 102 cfu/g, while Bacilli count ranged from 5 x 101 to 1.6 x 103 cfu/g. Four of the isolates representing branded (SF2 and RW2) and unbranded honey samples (EH2 and TC2) exhibited antibacterial activity against Micrococcus; one isolate (SF2) showed cell wall causing antibacterial activity. Tetracycline was detected more in the unbranded honey samples while gentamycin and streptomycin were detected in just two unbranded honey samples, indicating that tetracycline is used frequently for the treatment of bee diseases that is why it is detected as residue in the finished honey product.Key words: Antibiotics, Bacillus, health benefit honey, high performance liquid chromatography (HPLC), residues

Heterologous expression, purification and refolding of an anti-listerial peptide produced by Pediococcus acidilactici K7

The fusion protein, 6XHis-Xpress-PedA was constructed and expressed in Escherichia coli BL21 (DE3). The presence of a 12.8 kDa recombinant protein, localized in inclusion bodies (IBs) at high concentration, was confirmed by SDS-PAGE analysis and by western blotting using anti-His antibody. The rec-pediocin was purified by Nickel-nitrilotriacetic acid beads and refolded using 5 mM of \u3b2-mercaptoethanol along with 1 M glycine. Results indicated that the refolded rec-pediocin had an early elution profile in the RP-HPLC when compared to the unfolded protein and it exhibited biological activity against Listeria monocytogenes V7 which was approximately 25 times less active compared to native counterpart. The final yield of purified rec-pediocin was 3 mg/l of the culture and is estimated to be 8-10 times higher than the purification by conventional methods

Electrophilic oligodeoxynucleotide synthesis using dM-Dmoc for amino protection

Solid-phase synthesis of electrophilic oligodeoxynucleotides (ODNs) was achieved using dimethyl-Dmoc (dM-Dmoc) as amino protecting group. Due to the high steric hindrance of the 2-(propan-2-ylidene)-1,3-dithiane side product from deprotection, the use of excess nucleophilic scavengers such as aniline to prevent Michael addition of the side product to the deprotected ODN during ODN cleavage and deprotection was no longer needed. The improved technology was demonstrated by the synthesis and characterization of five ODNs including three modified ones. The modified ODNs contained the electrophilic groups ethyl ester, α-chloroamide, and thioester. Using the technology, the sensitive groups can be installed at any location within the ODN sequences without using any sequence- or functionality-specific conditions and procedures

Circovirus Infection in Cattle

Circoviren sind kleine, unbehüllte Viren mit einem einzelsträngigen zirkulären DNA Genom mit eine Größe von 1,7 bis 2,4 kb. Das Porcine Circovirus Typ 2 (PCV2), welches zum Genus Circovirus gehört, ist mit einer Anzahl von Krankheitsmanifestationen verbunden worden, die heute als Porcine Circovirus Assoziierte Krankheiten (PCVAD) zusammengefasst sind. Die PCV2-Infektion bei Rindern ist bis zum jetzigen Zeitpunkt marginal erforscht worden. Serologische Untersuchungen auf Circovirus spezifische Antikörperführten zu widersprüchlichen Ergebnissen. Im Jahr 2007 wurde von der Bovinen Neonatalen Panzytopenie (BNP) in Europa mit unklarer Genese berichtet. Das klinisch - pathologische Bild der Hämorrhagien ähnelte dem Krankheitsbild der Infektiösen Anämie, welche durch ein Circovirus bei Hühnern verursacht wird. Deshalb wurde in dieser Studie eine Breitspektrum PCR zum Nachweis von Cirocvirus-Genomen durchgeführt. In 5 von 25 BNP betroffenen Kälbern konnte circovirale DNA nachgewiesen werden. Das komplette Genom wurde nachfolgend amplifiziert, kloniert und sequenziert. Das nachgewiesene Genom (PCV2-Ha08) hat eine Länge von 1768 Nukleotiden und zeigte eine hohe Homologie (bis zu 99%) mit PCV2-Genotyp b (siehe Publikation 1). Als Ursache der BNP ist vor kurzen die Übertragung von Alloantikörpern über das Kolostrum beschrieben wurden, welche die Zerstörungen von Leukozyten und Thrombozyten sowie deren Vorläuferzellen bewirken. Ungeachtet dessen war es wichtig, die Empfänglichkeit und Immunantwort von Kälbern nach experimenteller Infektion mit PCV2 zu studieren. Für diesen Zweck wurden weitere 181 Proben von BNP-Kälbern aus Deutschland mit Hilfe einer Breitspektrum-PCR getestet. In zwei von 181 Proben wurde PCV2 DNA nachgewiesen. Die vollständigen Sequenzen konnten amplifiziert werden. Während das erste Genom aus einer Blutprobe eines Kalbs in Bayern stammte (PCV2-Ha09), stammte das zweite nachgewiesene Genom aus Lunge und Gehirn von einem Kalb in Sachsen (PCV2-Ha10). Das Genom (PCV2-Ha09) besteht aus 1768 nt, währenddessen das Genom (PCV2-Ha10) aus 1767 nt aufgebaut ist (siehe Publikation 2). Weiterhin wurden die PCV2 Empfänglichkeit und die Immunantwort von Kälbern durch experimentellen PCV2 Inokulation sowie die Möglichkeit, eine Serokonversion nach Impfung mit einer kommerziellen PCV2 Vakzin zu entwickeln, untersucht. PCV2-spezifische Antikörper wurden in den PCV2-infizierten Tieren und in den PCV2-immunisierten Tieren im Tag 11 und 7 nach Inokulation (p.i.) nachgewiesen. PCV2-Genome wurden durch quantitative Realtime-PCR zwischen Tag 4 und Tag 46 p.i. nur in den Blutproben sowie in verschiedenen Geweben (z.B. Milz, Lymphknoten, Thymus) der PCV2-infizierten Tiere nachgewiesen. Das Genom, welches von den Lymphknoten der PCV2-infizierten Kälber erneut isoliert wurde, zeigt eine Identität von 99,9% gegenüber dem Inokulum. Dies weist möglicherweise auf adaptierte Mutationen im PCV2 Genom hin. Die Mutationen C1708T und G365C sind während der Infektionen aufgetreten. Die Sequenzanalyse zeigt eine mögliche adaptierte Mutation an der Aminosäure Nr. 105 in Replikationsgen (Met zu Ile) (siehe Publikation 3). Zusammenfassend kann geschlussfolgert werden, dass der Nachweis der PCV2 Genomen und eine experimentell induzierte Serokonversion möglich war. Es konnte gezeigt werden, dass die Empfänglichkeit von PCV2 nicht allein auf Schweine begrenzt ist und eine Übertragung von PCV2 auf Rinder möglich ist

Circovirus Infection in Cattle

Circoviren sind kleine, unbehüllte Viren mit einem einzelsträngigen zirkulären DNA Genom mit eine Größe von 1,7 bis 2,4 kb. Das Porcine Circovirus Typ 2 (PCV2), welches zum Genus Circovirus gehört, ist mit einer Anzahl von Krankheitsmanifestationen verbunden worden, die heute als Porcine Circovirus Assoziierte Krankheiten (PCVAD) zusammengefasst sind. Die PCV2-Infektion bei Rindern ist bis zum jetzigen Zeitpunkt marginal erforscht worden. Serologische Untersuchungen auf Circovirus spezifische Antikörperführten zu widersprüchlichen Ergebnissen. Im Jahr 2007 wurde von der Bovinen Neonatalen Panzytopenie (BNP) in Europa mit unklarer Genese berichtet. Das klinisch - pathologische Bild der Hämorrhagien ähnelte dem Krankheitsbild der Infektiösen Anämie, welche durch ein Circovirus bei Hühnern verursacht wird. Deshalb wurde in dieser Studie eine Breitspektrum PCR zum Nachweis von Cirocvirus-Genomen durchgeführt. In 5 von 25 BNP betroffenen Kälbern konnte circovirale DNA nachgewiesen werden. Das komplette Genom wurde nachfolgend amplifiziert, kloniert und sequenziert. Das nachgewiesene Genom (PCV2-Ha08) hat eine Länge von 1768 Nukleotiden und zeigte eine hohe Homologie (bis zu 99%) mit PCV2-Genotyp b (siehe Publikation 1). Als Ursache der BNP ist vor kurzen die Übertragung von Alloantikörpern über das Kolostrum beschrieben wurden, welche die Zerstörungen von Leukozyten und Thrombozyten sowie deren Vorläuferzellen bewirken. Ungeachtet dessen war es wichtig, die Empfänglichkeit und Immunantwort von Kälbern nach experimenteller Infektion mit PCV2 zu studieren. Für diesen Zweck wurden weitere 181 Proben von BNP-Kälbern aus Deutschland mit Hilfe einer Breitspektrum-PCR getestet. In zwei von 181 Proben wurde PCV2 DNA nachgewiesen. Die vollständigen Sequenzen konnten amplifiziert werden. Während das erste Genom aus einer Blutprobe eines Kalbs in Bayern stammte (PCV2-Ha09), stammte das zweite nachgewiesene Genom aus Lunge und Gehirn von einem Kalb in Sachsen (PCV2-Ha10). Das Genom (PCV2-Ha09) besteht aus 1768 nt, währenddessen das Genom (PCV2-Ha10) aus 1767 nt aufgebaut ist (siehe Publikation 2). Weiterhin wurden die PCV2 Empfänglichkeit und die Immunantwort von Kälbern durch experimentellen PCV2 Inokulation sowie die Möglichkeit, eine Serokonversion nach Impfung mit einer kommerziellen PCV2 Vakzin zu entwickeln, untersucht. PCV2-spezifische Antikörper wurden in den PCV2-infizierten Tieren und in den PCV2-immunisierten Tieren im Tag 11 und 7 nach Inokulation (p.i.) nachgewiesen. PCV2-Genome wurden durch quantitative Realtime-PCR zwischen Tag 4 und Tag 46 p.i. nur in den Blutproben sowie in verschiedenen Geweben (z.B. Milz, Lymphknoten, Thymus) der PCV2-infizierten Tiere nachgewiesen. Das Genom, welches von den Lymphknoten der PCV2-infizierten Kälber erneut isoliert wurde, zeigt eine Identität von 99,9% gegenüber dem Inokulum. Dies weist möglicherweise auf adaptierte Mutationen im PCV2 Genom hin. Die Mutationen C1708T und G365C sind während der Infektionen aufgetreten. Die Sequenzanalyse zeigt eine mögliche adaptierte Mutation an der Aminosäure Nr. 105 in Replikationsgen (Met zu Ile) (siehe Publikation 3). Zusammenfassend kann geschlussfolgert werden, dass der Nachweis der PCV2 Genomen und eine experimentell induzierte Serokonversion möglich war. Es konnte gezeigt werden, dass die Empfänglichkeit von PCV2 nicht allein auf Schweine begrenzt ist und eine Übertragung von PCV2 auf Rinder möglich ist