Gliotransmitterfunktion in der Volumenregulation von Müllerschen Gliazellen der Netzhaut

Die vorliegende kumulative Habilitationsschrift von Dr. rer. nat. Antje Grosche umfasst neben einer Einführung in die Physiologie der dominierenden Gliazellen der Netzhaut – der Müllerschen Gliazellen - zehn Originalarbeiten zur Bedeutung von Gliotransmittern für die Volumenregulation der Müllerzellen. Eine effiziente Volumenregulation gilt als Voraussetzung dafür, dass Müllerzellen ihrer Rolle als stabilisierendes Element hinsichtlich des Ionen- und Wasserhaushaltes in der Netzhaut gerecht werden können. Aus Vorarbeiten war bekannt, dass Müllerzellen typische Eigenschaften, wie die hohe Kaliumleitfähigkeit ihrer Membranen und damit einhergehend eine ausgeprägte Fähigkeit zur Volumenregulation, in der pathologisch veränderten Netzhaut verlieren (Pannicke et al., 2004; Wurm et al., 2006b). Diese Reaktion der Müllerzellen auf Netzhautschädigungen wird als gliotische Aktivierung bezeichnet und konnte in der soeben beschriebenen Ausprägung im ersten Abschnitt der vorliegenden Arbeit an Netzhäuten von Patienten mit uvealem Melanom bestätigt werden (Grosche et al., 2012). Weiterhin wurde die Relevanz einer in früheren Arbeiten identifizierten glutamaterg-purinergen Signalkaskade für die Funktion von gliotischen Müllerzellen detailliert untersucht. Im ersten Abschnitt dieser Habilitationsschrift wird nachgewiesen, dass sowohl im Modell für eine akute Schädigung der Netzhaut (Netzhautablösung im Schwein, Wurm et al., 2011), als auch bei einer chronischen Erkrankung (Streptozotocin-induzierter Diabetes in der Ratte, Wurm et al., 2008c) durch Aktivierung besagter Kaskade trotz verminderter Kaliumströme die Volumenregulation der Zellen wieder hergestellt werden kann. Ein zweiter Schwerpunkt der Untersuchungen war die umfassende Analyse der Expressions-muster und Funktion der an der Volumenregulation beteiligten Rezeptoren (insbesondere P2Y-Rezeptoren) in juvenilen und adulten Müllerzellen. Daten über die Differenzierung von Müllerzellen der Ratte während der ersten drei Postnatalwochen unterstreichen die herausragende Bedeutung von P2Y-Rezeptoren bzw. belegen deren Beteiligung an verschiedenen Müllerzellfunktionen (Volumenregulation, kalziumabhängige Signalwege). Interessanterweise wurden die meisten Effekte von ATP über die Aktivierung von P2Y1-Rezeptoren vermittelt (Wurm et al., 2009a, 2010). Zudem konnte durch Einsatz von P2Y1-Rezeptor-, IP3 Rezeptorsubtyp 2- und A1-Rezeptor-defizienten Mäusen belegt werden, dass ein störungsfreies Wirken der glutamaterg-purinergen Signalkaskade (neben der hohen Kaliumleitfähigkeit der Membranen) auch in unbehandelten Müllerzellen essentiell für deren Volumenregulation ist (Wurm et al., 2009b, 2010; Lipp et al., 2009). Im dritten Themenkomplex wurde der Frage nachgegangen, welche Mechanismen bei der Freisetzung der in die Volumenregulation involvierten Gliotransmitter eine Rolle spielen. So konnte eine exozytotische Ausschüttung von Glutamat bestätigt werden, während die Freisetzung von ATP primär durch Hemichannels (Linnertz et al., 2011; Brückner et al., 2012; Slezak et al., 2012) und die von Adenosin durch Nukleosidtransporter sowie extrazelluläre Degradation von ATP/ADP vermittelt wird (Wurm et al., 2010). Abschließend ordnet das Kapitel „Zusammenfassung und Ausblick“ die neu gewonnenen Erkenntnisse dieser Habilitationsschrift über die Rolle von Gliotransmittern für die Funktionen von Müllerzellen (einschließlich unveröffentlichter Daten aus weiterführenden Experimenten) für zukünftige Forschungsvorhaben ein

The agonistic TSPO ligand XBD173 attenuates the glial response thereby protecting inner retinal neurons in a murine model of retinal ischemia

Peer reviewedPublisher PD

Complement Components Showed a Time-Dependent Local Expression Pattern in Constant and Acute White Light-Induced Photoreceptor Damage

Background: Photoreceptor cell death due to extensive light exposure and induced oxidative-stress are associated with retinal degeneration. A correlated dysregulation of the complement system amplifies the damaging effects, but the local and time-dependent progression of this mechanism is not thoroughly understood. Methods: Light-induced photoreceptor damage (LD) was induced in Balb/c mice with white light illumination either for 24 h with 1000 lux (constant model) or 0.5 h with 5000 lux (acute model). Complement protein and mRNA expression levels were compared at 1 and 3 days post-LD for C1s, complement factor B (CFB), mannose binding lectin A, mannose-binding protein-associated serine protease 1 (MASP-1), C3, C4, C9, and complement factor P in retina and RPE/choroid. Histological analyses visualized apoptosis, microglia/macrophage migration, gliosis and deposition of the complement activation marker C3d. Systemic anaphylatoxin serum concentrations were determined using an ELISA. Results: Apoptosis, gliosis and microglia/macrophage migration into the outer nuclear layer showed similar patterns in both models. Local complement factor expression revealed an early upregulation of complement factor mRNA in the acute and constant light regimen at 1 day post-treatment for c1s, cfb, masp-1, c3, c4 and c9 in the RPE/choroid. However, intraretinal complement mRNA expression for c1s, cfb, c3 and c4 was increased at 1 day in the constant and at 3 days in the acute model. A corresponding regulation on protein level in the retina following both LD models was observed for C3, which was upregulated at 1 day and correlated with increased C3d staining in the ganglion cell layer and at the RPE. In the RPE/choroid C1s-complex protein detection was increased at 3 days after LD irrespectively of the light intensities used. Conclusion: LD in mouse eyes is correlated with local complement activity. The time-dependent local progression of complement regulation on mRNA and protein levels were equivalent in the acute and constant LD model, except for the intraretinal, time-dependent mRNA expression. Knowing the relative time courses of local complement expression and cellular activity can help to elucidate novel therapeutic options in retinal degeneration indicating at which time point of disease complement has to be rebalanced

Disruption of Endogenous Purinergic Signaling Inhibits Vascular Endothelial Growth Factor- and Glutamate-Induced Osmotic Volume Regulation of Muller Glial Cells in Knockout Mice

Background/Aims: Osmotic swelling of Müller cells is a common phenomenon in animal models of ischemic and diabetic retinopathies. Müller cells possess a swelling-inhibitory purinergic signaling cascade which can be activated by various receptor ligands including vascular endothelial growth factor (VEGF) and glutamate. Here, we investigated whether deletion of P2Y1 (P2Y1R) and adenosine A1 receptors (A1AR), and of inositol-1,4,5-trisphosphate-receptor type 2 (IP3R2), in mice affects the inhibitory action of VEGF and glutamate on Müller cell swelling. Methods: The cross-sectional area of Müller cell somata was recorded after a 4-min superfusion of retinal slices with a hypoosmotic solution. Results: Hypoosmolarity induced a swelling of Müller cells from P2Y1R-/-, A1AR-/- and IP3R2-/- mice, but not from wild-type mice. Swelling of wild-type Müller cells was induced by hypoosmotic solution containing barium chloride. Whereas VEGF inhibited the swelling of wild-type Müller cells, it had no swelling-inhibitory effect in cells from A1AR-/- and IP3R2-/- mice. Glutamate inhibited the swelling of wild-type Müller cells but not of cells from P2Y1R-/-, A1AR-/- and IP3R2-/- animals. Conclusion: The swelling-inhibitory effects of VEGF and glutamate in murine Müller cells is mediated by transactivation of P2Y1R and A1AR, as well as by intracellular calcium signaling via activation of IP3R2

Sodium Iodate-Induced Degeneration Results in Local Complement Changes and Inflammatory Processes in Murine Retina

Age-related macular degeneration (AMD), one of the leading causes of blindness worldwide, causes personal suffering and high socioeconomic costs. While there has been progress in the treatments for the neovascular form of AMD, no therapy is yet available for the more common dry form, also known as geographic atrophy. We analysed the retinal tissue in a mouse model of retinal degeneration caused by sodium iodate (NaIO3)-induced retinal pigment epithelium (RPE) atrophy to understand the underlying pathology. RNA sequencing (RNA-seq), qRT-PCR, Western blot, immunohistochemistry of the retinas and multiplex ELISA of the mouse serum were applied to find the pathways involved in the degeneration. NaIO3 caused patchy RPE loss and thinning of the photoreceptor layer. This was accompanied by the increased retinal expression of complement components c1s, c3, c4, cfb and cfh. C1s, C3, CFH and CFB were complement proteins, with enhanced deposition at day 3. C4 was upregulated in retinal degeneration at day 10. Consistently, the transcript levels of proinflammatory ccl-2, -3, -5, il-1β, il-33 and tgf-β were increased in the retinas of NaIO3 mice, but vegf-a mRNA was reduced. Macrophages, microglia and gliotic Müller cells could be a cellular source for local retinal inflammatory changes in the NaIO3 retina. Systemic complement and cytokines/chemokines remained unaltered in this model of NaIO3-dependent retinal degeneration. In conclusion, systemically administered NaIO3 promotes degenerative and inflammatory processes in the retina, which can mimic the hallmarks of geographic atrophy

Retinal regions shape human and murine Müller cell proteome profile and functionality

The human macula is a highly specialized retinal region with pit‐like morphology and rich in cones. How Müller cells, the principal glial cell type in the retina, are adapted to this environment is still poorly understood. We compared proteomic data from cone‐ and rod‐rich retinae from human and mice and identified different expression profiles of cone‐ and rod‐associated Müller cells that converged on pathways representing extracellular matrix and cell adhesion. In particular, epiplakin (EPPK1), which is thought to play a role in intermediate filament organization, was highly expressed in macular Müller cells. Furthermore, EPPK1 knockout in a human Müller cell‐derived cell line led to a decrease in traction forces as well as to changes in cell size, shape, and filopodia characteristics. We here identified EPPK1 as a central molecular player in the region‐specific architecture of the human retina, which likely enables specific functions under the immense mechanical loads in vivo

Cell-Type-Specific Complement Expression in the Healthy and Diseased Retina

Complement dysregulation is a feature of many retinal diseases, yet mechanistic understanding at the cellular level is limited. Given this knowledge gap about which retinal cells express complement, we performed single-cell RNA sequencing on similar to 92,000 mouse retinal cells and validated our results in five major purified retinal cell types. We found evidence for a distributed cell-type-specific complement expression across 11 cell types. Notably, Muller cells are the major contributor of complement activators c1s, c3, c4, and cfb. Retinal pigment epithelium (RPE) mainly expresses cfh and the terminal complement components, whereas cfi and cfp transcripts are most abundant in neurons. Aging enhances c1s, cfb, cfp, and cfi expression, while cfh expression decreases. Transient retinal ischemia increases complement expression in microglia, Muller cells, and RPE. In summary, we report a unique complement expression signature for murine retinal cell types suggesting a well-orchestrated regulation of local complement expression in the retinal microenvironment

As in Real Estate, Location Matters: Cellular Expression of Complement Varies Between Macular and Peripheral Regions of the Retina and Supporting Tissues.

The cellular events that dictate the initiation of the complement pathway in ocular degeneration, such as age-related macular degeneration (AMD), is poorly understood. Using gene expression analysis (single cell and bulk), mass spectrometry, and immunohistochemistry, we dissected the role of multiple retinal and choroidal cell types in determining the complement homeostasis. Our scRNA-seq data show that the cellular response to early AMD is more robust in the choroid, particularly in fibroblasts, pericytes and endothelial cells. In late AMD, complement changes were more prominent in the retina especially with the expression of the classical pathway initiators. Notably, we found a spatial preference for these differences. Overall, this study provides insights into the heterogeneity of cellular responses for complement expression and the cooperation of neighboring cells to complete the pathway in healthy and AMD eyes. Further, our findings provide new cellular targets for therapies directed at complement

Gliotransmitterfunktion in der Volumenregulation von Müllerschen Gliazellen der Netzhaut

Die vorliegende kumulative Habilitationsschrift von Dr. rer. nat. Antje Grosche umfasst neben einer Einführung in die Physiologie der dominierenden Gliazellen der Netzhaut – der Müllerschen Gliazellen - zehn Originalarbeiten zur Bedeutung von Gliotransmittern für die Volumenregulation der Müllerzellen. Eine effiziente Volumenregulation gilt als Voraussetzung dafür, dass Müllerzellen ihrer Rolle als stabilisierendes Element hinsichtlich des Ionen- und Wasserhaushaltes in der Netzhaut gerecht werden können. Aus Vorarbeiten war bekannt, dass Müllerzellen typische Eigenschaften, wie die hohe Kaliumleitfähigkeit ihrer Membranen und damit einhergehend eine ausgeprägte Fähigkeit zur Volumenregulation, in der pathologisch veränderten Netzhaut verlieren (Pannicke et al., 2004; Wurm et al., 2006b). Diese Reaktion der Müllerzellen auf Netzhautschädigungen wird als gliotische Aktivierung bezeichnet und konnte in der soeben beschriebenen Ausprägung im ersten Abschnitt der vorliegenden Arbeit an Netzhäuten von Patienten mit uvealem Melanom bestätigt werden (Grosche et al., 2012). Weiterhin wurde die Relevanz einer in früheren Arbeiten identifizierten glutamaterg-purinergen Signalkaskade für die Funktion von gliotischen Müllerzellen detailliert untersucht. Im ersten Abschnitt dieser Habilitationsschrift wird nachgewiesen, dass sowohl im Modell für eine akute Schädigung der Netzhaut (Netzhautablösung im Schwein, Wurm et al., 2011), als auch bei einer chronischen Erkrankung (Streptozotocin-induzierter Diabetes in der Ratte, Wurm et al., 2008c) durch Aktivierung besagter Kaskade trotz verminderter Kaliumströme die Volumenregulation der Zellen wieder hergestellt werden kann. Ein zweiter Schwerpunkt der Untersuchungen war die umfassende Analyse der Expressions-muster und Funktion der an der Volumenregulation beteiligten Rezeptoren (insbesondere P2Y-Rezeptoren) in juvenilen und adulten Müllerzellen. Daten über die Differenzierung von Müllerzellen der Ratte während der ersten drei Postnatalwochen unterstreichen die herausragende Bedeutung von P2Y-Rezeptoren bzw. belegen deren Beteiligung an verschiedenen Müllerzellfunktionen (Volumenregulation, kalziumabhängige Signalwege). Interessanterweise wurden die meisten Effekte von ATP über die Aktivierung von P2Y1-Rezeptoren vermittelt (Wurm et al., 2009a, 2010). Zudem konnte durch Einsatz von P2Y1-Rezeptor-, IP3 Rezeptorsubtyp 2- und A1-Rezeptor-defizienten Mäusen belegt werden, dass ein störungsfreies Wirken der glutamaterg-purinergen Signalkaskade (neben der hohen Kaliumleitfähigkeit der Membranen) auch in unbehandelten Müllerzellen essentiell für deren Volumenregulation ist (Wurm et al., 2009b, 2010; Lipp et al., 2009). Im dritten Themenkomplex wurde der Frage nachgegangen, welche Mechanismen bei der Freisetzung der in die Volumenregulation involvierten Gliotransmitter eine Rolle spielen. So konnte eine exozytotische Ausschüttung von Glutamat bestätigt werden, während die Freisetzung von ATP primär durch Hemichannels (Linnertz et al., 2011; Brückner et al., 2012; Slezak et al., 2012) und die von Adenosin durch Nukleosidtransporter sowie extrazelluläre Degradation von ATP/ADP vermittelt wird (Wurm et al., 2010). Abschließend ordnet das Kapitel „Zusammenfassung und Ausblick“ die neu gewonnenen Erkenntnisse dieser Habilitationsschrift über die Rolle von Gliotransmittern für die Funktionen von Müllerzellen (einschließlich unveröffentlichter Daten aus weiterführenden Experimenten) für zukünftige Forschungsvorhaben ein