Ecr, une protéine potentiellement impliquée dans la résistance hétérogène à la colistine des clusters I et IV du complexe Enterobacter cloacae

International audienceObjectif - Introduction : La colistine (COS), antibiotique longtemps délaissé, est devenue une alternative de dernier recours pour le traitement des infections à entérobactéries multirésistantes, notamment productrices de carbapénémases. Le complexe Enterobacter cloacae (CEC) comprend plusieurs clusters étroitement liés et non différenciables phénotypiquement, dont certains présentent un phénotype d’hétérorésistance (HR) à la COS. Même si plusieurs gènes ont été identifiés (ex. tolC, phoP et soxS-soxR) dans cette HR, les mécanismes restent en grande partie inconnus. En 2019, Huang et al. ont décrit le gène ecr qui serait également impliqué dans l’HR en régulant positivement l’expression de phoP et de l’opéron arnBCADTEF. Le but de ce travail a été de rechercher la présence du gène ecr par PCR en temps réel dans une collection de souches de CEC déjà caractérisées et par une approche in silico à partir des séquences génomiques disponibles.Matériels et méthodes : Une collection de 100 souches cliniques uniques représentatives des différents clusters du CEC (C-I à C-XIV) a été étudiée. Les souches identifiées par séquençage partiel du gène hsp60 ont été caractérisées pour l’HR à la COS par CMI par microdilution et analyse de population. Après le design d’amorces spécifiques, une technique de PCR en temps réel a été développée. Parallèlement, le gène ecr a été recherché par une analyse in silico sur 1560 souches du CEC.Résultats : Sur les 100 souches, 48 présentaient une HR à la COS et appartenaient aux clusters hsp60suivants : C-I (7/8), C-II (16/16), C-III (1/14), C-IV (8/9), CVII (2/4), C-IX (3/3), C-X (1/2), C-XI (8/9), C-XII (2/2). Le gène ecr a été retrouvé uniquement pour les clusters C-I (7/7, 100%), C-IV (7/8, 87,5%), C-VII (1/2) et C-X (1/1) par PCR. L’analyse in silico des 1560 génomes a montré la présence du gène ecr uniquement pour les clusters C-I (87/87, 100%) et C-IV (86/92, 93,5%). Conclusion : Dans cette étude, nous avons pu montrer que le gène ecr semble particulièrement présent chez les clusters C-I et C-IV. Ces résultats montrent l’importance de la détermination précise du cluster en matière d’interprétation de la sensibilité à la COS. L’analyse génomique doit être étendue aux 100 souches cliniques de ce panel pour confirmer cette association exclusive à certains clusters et redéfinir ainsi précisément le cluster des 2 souches ecr positif non C-I ou C-IV

Génomique des bactéries multirésistantes aux antibiotiques en Normandie : investigations épidémiques, études populationnelles, mécanismes de résistance aux antibiotiques

Antibiotic resistance is a major public health burden responsible for the death of over one million people per year worldwide. The aim of this thesis was to develop a surveillance system for the circulation of multidrug-resistant enterobacterales based on phenotypic and genomic characterization. Different epidemics were investigated for which the contribution of comparative genomic analyses was crucial. The role of the ramAR operon in the long-term adaptation of an Enterobacter hormaechei strain was demonstrated. This operon was very frequently mutated among ESBL-producing enterobacterales (ESBL-E) subject to strong selection pressure. Finally, the dynamics of ESBL-E circulation and transmission were specific to the species but also related to the nature of the clinical department. Escherichia coli had a community origin and were rarely responsible for outbreaks. In contrast, more than 80% of Klebsiella pneumoniae and Enterobacter cloacae complex strains had a nosocomial origin and were frequently associated with cross-transmission. The covid-19 pandemic profoundly altered the circulation and populations of K. pneumoniae, while the same endemic clones of Ecc still persisted in hospitals. Whole genome sequencing has acquired a central place in the surveillance of the circulation of multidrug-resistant enterobacterales in the Teaching Hospital of Caen and in Normandy. Combined with phenotypic approaches, these data provide a better understanding of long-term bacterial adaptation.La résistance aux antibiotiques est un problème majeur de santé publique responsable du décès de plus d’un million de personnes par an à travers le monde. Ce travail de thèse avait pour but de développer un système de surveillance de la circulation des entérobactérales multi-résistantes basé sur une caractérisation phénotypique et génomique. Différentes épidémies ont été investiguées pour lesquelles l’apport des analyses de génomiques comparatives s’est révélé crucial. Il a été démontré le rôle de l’opéron ramAR dans l’adaptation au long cours d’une souche d’Enterobacter hormaechei. Cet opéron été très fréquemment muté au sein des souches d’enterobactérales productrices de BLSE (E-BLSE) soumises à une forte pression de sélection. Enfin, les dynamiques de circulation et de transmission des E-BLSE étaient propres à l’espèce considérée mais aussi liées à la nature du service clinique. Escherichia coli avait une origine communautaire et était rarement responsable d’épidémies. A l’inverse, plus de 80% des souches de Klebsiella pneumoniae et de Enterobacter cloacae complexe étaient d’origine nosocomiales et très fréquemment associées à des phénomènes de transmissions croisées. La pandémie de covid-19 a profondément modifié la circulation et les populations de K. pneumoniae, tandis que les mêmes clones endémiques de Ecc persistaient toujours à l’hôpital. Le séquençage du génome complet a acquis une place centrale dans la surveillance de la circulation des entérobactérales multi-résistantes à l’échelle du CHU de Caen et de la région Normandie. Associées aux approches phénotypiques, ces données permettent de mieux comprendre l’adaptation bactérienne au long cours

Génomique des bactéries multirésistantes aux antibiotiques en Normandie : investigations épidémiques, études populationnelles, mécanismes de résistance aux antibiotiques

Antibiotic resistance is a major public health burden responsible for the death of over one million people per year worldwide. The aim of this thesis was to develop a surveillance system for the circulation of multidrug-resistant enterobacterales based on phenotypic and genomic characterization. Different epidemics were investigated for which the contribution of comparative genomic analyses was crucial. The role of the ramAR operon in the long-term adaptation of an Enterobacter hormaechei strain was demonstrated. This operon was very frequently mutated among ESBL-producing enterobacterales (ESBL-E) subject to strong selection pressure. Finally, the dynamics of ESBL-E circulation and transmission were specific to the species but also related to the nature of the clinical department. Escherichia coli had a community origin and were rarely responsible for outbreaks. In contrast, more than 80% of Klebsiella pneumoniae and Enterobacter cloacae complex strains had a nosocomial origin and were frequently associated with cross-transmission. The covid-19 pandemic profoundly altered the circulation and populations of K. pneumoniae, while the same endemic clones of Ecc still persisted in hospitals. Whole genome sequencing has acquired a central place in the surveillance of the circulation of multidrug-resistant enterobacterales in the Teaching Hospital of Caen and in Normandy. Combined with phenotypic approaches, these data provide a better understanding of long-term bacterial adaptation.La résistance aux antibiotiques est un problème majeur de santé publique responsable du décès de plus d’un million de personnes par an à travers le monde. Ce travail de thèse avait pour but de développer un système de surveillance de la circulation des entérobactérales multi-résistantes basé sur une caractérisation phénotypique et génomique. Différentes épidémies ont été investiguées pour lesquelles l’apport des analyses de génomiques comparatives s’est révélé crucial. Il a été démontré le rôle de l’opéron ramAR dans l’adaptation au long cours d’une souche d’Enterobacter hormaechei. Cet opéron été très fréquemment muté au sein des souches d’enterobactérales productrices de BLSE (E-BLSE) soumises à une forte pression de sélection. Enfin, les dynamiques de circulation et de transmission des E-BLSE étaient propres à l’espèce considérée mais aussi liées à la nature du service clinique. Escherichia coli avait une origine communautaire et était rarement responsable d’épidémies. A l’inverse, plus de 80% des souches de Klebsiella pneumoniae et de Enterobacter cloacae complexe étaient d’origine nosocomiales et très fréquemment associées à des phénomènes de transmissions croisées. La pandémie de covid-19 a profondément modifié la circulation et les populations de K. pneumoniae, tandis que les mêmes clones endémiques de Ecc persistaient toujours à l’hôpital. Le séquençage du génome complet a acquis une place centrale dans la surveillance de la circulation des entérobactérales multi-résistantes à l’échelle du CHU de Caen et de la région Normandie. Associées aux approches phénotypiques, ces données permettent de mieux comprendre l’adaptation bactérienne au long cours

Genomics of multi-resistant bacteria in Normandy : epidemic investigations, population studies, mechanisms of antibiotic resistance

La résistance aux antibiotiques est un problème majeur de santé publique responsable du décès de plus d’un million de personnes par an à travers le monde. Ce travail de thèse avait pour but de développer un système de surveillance de la circulation des entérobactérales multi-résistantes basé sur une caractérisation phénotypique et génomique. Différentes épidémies ont été investiguées pour lesquelles l’apport des analyses de génomiques comparatives s’est révélé crucial. Il a été démontré le rôle de l’opéron ramAR dans l’adaptation au long cours d’une souche d’Enterobacter hormaechei. Cet opéron été très fréquemment muté au sein des souches d’enterobactérales productrices de BLSE (E-BLSE) soumises à une forte pression de sélection. Enfin, les dynamiques de circulation et de transmission des E-BLSE étaient propres à l’espèce considérée mais aussi liées à la nature du service clinique. Escherichia coli avait une origine communautaire et était rarement responsable d’épidémies. A l’inverse, plus de 80% des souches de Klebsiella pneumoniae et de Enterobacter cloacae complexe étaient d’origine nosocomiales et très fréquemment associées à des phénomènes de transmissions croisées. La pandémie de covid-19 a profondément modifié la circulation et les populations de K. pneumoniae, tandis que les mêmes clones endémiques de Ecc persistaient toujours à l’hôpital. Le séquençage du génome complet a acquis une place centrale dans la surveillance de la circulation des entérobactérales multi-résistantes à l’échelle du CHU de Caen et de la région Normandie. Associées aux approches phénotypiques, ces données permettent de mieux comprendre l’adaptation bactérienne au long cours.Antibiotic resistance is a major public health burden responsible for the death of over one million people per year worldwide. The aim of this thesis was to develop a surveillance system for the circulation of multidrug-resistant enterobacterales based on phenotypic and genomic characterization. Different epidemics were investigated for which the contribution of comparative genomic analyses was crucial. The role of the ramAR operon in the long-term adaptation of an Enterobacter hormaechei strain was demonstrated. This operon was very frequently mutated among ESBL-producing enterobacterales (ESBL-E) subject to strong selection pressure. Finally, the dynamics of ESBL-E circulation and transmission were specific to the species but also related to the nature of the clinical department. Escherichia coli had a community origin and were rarely responsible for outbreaks. In contrast, more than 80% of Klebsiella pneumoniae and Enterobacter cloacae complex strains had a nosocomial origin and were frequently associated with cross-transmission. The covid-19 pandemic profoundly altered the circulation and populations of K. pneumoniae, while the same endemic clones of Ecc still persisted in hospitals. Whole genome sequencing has acquired a central place in the surveillance of the circulation of multidrug-resistant enterobacterales in the Teaching Hospital of Caen and in Normandy. Combined with phenotypic approaches, these data provide a better understanding of long-term bacterial adaptation

Génomique des bactéries multirésistantes aux antibiotiques en Normandie : investigations épidémiques, études populationnelles, mécanismes de résistance aux antibiotiques

Antibiotic resistance is a major public health burden responsible for the death of over one million people per year worldwide. The aim of this thesis was to develop a surveillance system for the circulation of multidrug-resistant enterobacterales based on phenotypic and genomic characterization. Different epidemics were investigated for which the contribution of comparative genomic analyses was crucial. The role of the ramAR operon in the long-term adaptation of an Enterobacter hormaechei strain was demonstrated. This operon was very frequently mutated among ESBL-producing enterobacterales (ESBL-E) subject to strong selection pressure. Finally, the dynamics of ESBL-E circulation and transmission were specific to the species but also related to the nature of the clinical department. Escherichia coli had a community origin and were rarely responsible for outbreaks. In contrast, more than 80% of Klebsiella pneumoniae and Enterobacter cloacae complex strains had a nosocomial origin and were frequently associated with cross-transmission. The covid-19 pandemic profoundly altered the circulation and populations of K. pneumoniae, while the same endemic clones of Ecc still persisted in hospitals. Whole genome sequencing has acquired a central place in the surveillance of the circulation of multidrug-resistant enterobacterales in the Teaching Hospital of Caen and in Normandy. Combined with phenotypic approaches, these data provide a better understanding of long-term bacterial adaptation.La résistance aux antibiotiques est un problème majeur de santé publique responsable du décès de plus d’un million de personnes par an à travers le monde. Ce travail de thèse avait pour but de développer un système de surveillance de la circulation des entérobactérales multi-résistantes basé sur une caractérisation phénotypique et génomique. Différentes épidémies ont été investiguées pour lesquelles l’apport des analyses de génomiques comparatives s’est révélé crucial. Il a été démontré le rôle de l’opéron ramAR dans l’adaptation au long cours d’une souche d’Enterobacter hormaechei. Cet opéron été très fréquemment muté au sein des souches d’enterobactérales productrices de BLSE (E-BLSE) soumises à une forte pression de sélection. Enfin, les dynamiques de circulation et de transmission des E-BLSE étaient propres à l’espèce considérée mais aussi liées à la nature du service clinique. Escherichia coli avait une origine communautaire et était rarement responsable d’épidémies. A l’inverse, plus de 80% des souches de Klebsiella pneumoniae et de Enterobacter cloacae complexe étaient d’origine nosocomiales et très fréquemment associées à des phénomènes de transmissions croisées. La pandémie de covid-19 a profondément modifié la circulation et les populations de K. pneumoniae, tandis que les mêmes clones endémiques de Ecc persistaient toujours à l’hôpital. Le séquençage du génome complet a acquis une place centrale dans la surveillance de la circulation des entérobactérales multi-résistantes à l’échelle du CHU de Caen et de la région Normandie. Associées aux approches phénotypiques, ces données permettent de mieux comprendre l’adaptation bactérienne au long cours

Comparaison des séquences génomiques pour la surveillance épidémiologique et l’investigation d’épidémies : 3 approches complémentaires

Société Française de Microbiologi

Ecr, une protéine potentiellement impliquée dans la résistance hétérogène à la colistine des clusters I et IV du complexe Enterobacter cloacae

International audienceObjectif - Introduction : La colistine (COS), antibiotique longtemps délaissé, est devenue une alternative de dernier recours pour le traitement des infections à entérobactéries multirésistantes, notamment productrices de carbapénémases. Le complexe Enterobacter cloacae (CEC) comprend plusieurs clusters étroitement liés et non différenciables phénotypiquement, dont certains présentent un phénotype d’hétérorésistance (HR) à la COS. Même si plusieurs gènes ont été identifiés (ex. tolC, phoP et soxS-soxR) dans cette HR, les mécanismes restent en grande partie inconnus. En 2019, Huang et al. ont décrit le gène ecr qui serait également impliqué dans l’HR en régulant positivement l’expression de phoP et de l’opéron arnBCADTEF. Le but de ce travail a été de rechercher la présence du gène ecr par PCR en temps réel dans une collection de souches de CEC déjà caractérisées et par une approche in silico à partir des séquences génomiques disponibles.Matériels et méthodes : Une collection de 100 souches cliniques uniques représentatives des différents clusters du CEC (C-I à C-XIV) a été étudiée. Les souches identifiées par séquençage partiel du gène hsp60 ont été caractérisées pour l’HR à la COS par CMI par microdilution et analyse de population. Après le design d’amorces spécifiques, une technique de PCR en temps réel a été développée. Parallèlement, le gène ecr a été recherché par une analyse in silico sur 1560 souches du CEC.Résultats : Sur les 100 souches, 48 présentaient une HR à la COS et appartenaient aux clusters hsp60suivants : C-I (7/8), C-II (16/16), C-III (1/14), C-IV (8/9), CVII (2/4), C-IX (3/3), C-X (1/2), C-XI (8/9), C-XII (2/2). Le gène ecr a été retrouvé uniquement pour les clusters C-I (7/7, 100%), C-IV (7/8, 87,5%), C-VII (1/2) et C-X (1/1) par PCR. L’analyse in silico des 1560 génomes a montré la présence du gène ecr uniquement pour les clusters C-I (87/87, 100%) et C-IV (86/92, 93,5%). Conclusion : Dans cette étude, nous avons pu montrer que le gène ecr semble particulièrement présent chez les clusters C-I et C-IV. Ces résultats montrent l’importance de la détermination précise du cluster en matière d’interprétation de la sensibilité à la COS. L’analyse génomique doit être étendue aux 100 souches cliniques de ce panel pour confirmer cette association exclusive à certains clusters et redéfinir ainsi précisément le cluster des 2 souches ecr positif non C-I ou C-IV

Temocillin Resistance in the Enterobacter cloacae Complex Is Conferred by a Single Point Mutation in BaeS, Leading to Overexpression of the AcrD Efflux Pump

International audienceThe Enterobacter cloacae complex (ECC) has become a major opportunistic pathogen with antimicrobial resistance issues. Temocillin, an "old" carboxypenicillin that is remarkably stable toward beta-lactamases, has been used as an alternative for the treatment of multidrug-resistant ECC infections. Here, we aimed at deciphering the never-investigated mechanisms of temocillin resistance acquisition in Enterobacterales. By comparative genomic analysis of two clonally related ECC clinical isolates, one susceptible (Temo_S [MIC of 4 mg/L]) and the other resistant (Temo_R [MIC of 32 mg/L]), we found that they differed by only 14 single-nucleotide polymorphisms, including one nonsynonymous mutation (Thr175Pro) in the two-component system (TCS) sensor histidine kinase BaeS. By site-directed mutagenesis in Escherichia coli CFT073, we demonstrated that this unique change in BaeS was responsible for a significant (16-fold) increase in temocillin MIC. Since the BaeSR TCS regulates the expression of two resistance-nodulation-cell division (RND)-type efflux pumps (namely, AcrD and MdtABCD) in E. coli and Salmonella, we demonstrated by quantitative reverse transcription-PCR that mdtB, baeS, and acrD genes were significantly overexpressed (15-, 11-, and 3-fold, respectively) in Temo_R. To confirm the role of each efflux pump in this mechanism, multicopy plasmids harboring mdtABCD or acrD were introduced into either Temo_S or the reference strain E. cloacae subsp. cloacae ATCC 13047. Interestingly, only the overexpression of acrD conferred a significant increase (from 8- to 16-fold) of the temocillin MIC. Altogether, we have shown that temocillin resistance in the ECC can result from a single BaeS alteration, likely resulting in the permanent phosphorylation of BaeR and leading to AcrD overexpression and temocillin resistance through enhanced active efflux. The Enterobacter cloacae complex (ECC) has become a major opportunistic pathogen with antimicrobial resistance issues. Temocillin, an "old" carboxypenicillin that is remarkably stable toward beta-lactamases, has been used as an alternative for the treatment of multidrug-resistant ECC infections

The transcriptional repressor SmvR is important for chlorhexidine decreased susceptibility in Enterobacter cloacae complex

International audienceMajor Facilitator Superfamily (MFS) efflux pumps have been shown to be important for bacterial cells to cope with biocides such as chlorhexidine (CHX), a widely used molecule in hospital settings. In this work, we evaluated the role of two genes smvA and smvR in CHX resistance in Enterobacter cloacae complex (ECC). smvA encodes an MFS pump whereas smvR, located upstream of smvA, codes for a TetR-type transcriptional repressor. To this aim, we constructed corresponding deletion mutants from the ATCC 13047 strain (MIC = 2 mg/L) as well as strains overexpressing smvA or smvR both in ATCC 13047 and three clinical isolates exhibiting elevated MICs of CHX (16-32 mg/L). Determination of MICs revealed that smvA played a modest role in CHX resistance, contrarily to smvR that modulated the ability of ECC to survive in the presence of CHX. In clinical isolates, the overexpression of smvR significantly reduced MICs of CHX (2-8 mg/L). Sequences analyses of smvR and promotor regions pointed out substitutions in conserved regions. Moreover, transcriptional studies revealed that SmvR acted as a repressor of smvA expression even if no quantitative correlation between the level of smvA mRNA and MICs of CHX could be observed. On the other hand, overproduction of smvA was able to complement the lack of the major resistance-nodulation-cell division (RND) superfamily efflux pump AcrB and restored resistance to ethidium bromide and acriflavine. Although SmvA could efflux biocides such as CHX, other actors, of which the expression is under SmvR control, should play critical role in ECC