Identifizierung eines Gens von Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis für die Kolonisation von Solanum lycopersicum

Gräfen I. Identifizierung eines Gens von Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis für die Kolonisation von Solanum lycopersicum. Bielefeld (Germany): Bielefeld University; 2005.Der Wildtypstamm Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis NCPPB382 besitzt zwei Plasmide, pCM1 und pCM2, die jeweils eine der Pathogenitätsdeterminanten, celA und pat-1, tragen. Weitere Homologe zu pat-1, die plasmidkodierten Gene phpA, phpB und das chromosomale chpA, wurden durch Kreuzhybridisierung mit einer pat-1-Sonde gefunden. Southern Hybridisierungen verschiedener Isolate gegen eine pat-1-Sonde zeigten jedoch ein vom Wildtyp Cmm NCPPB382 abweichendes Bandenmuster. Aus den avirulenten Cmm-Isolaten I-62, I-63, ZUM3036 und ZUM3121 wurde die jeweilige Pathogenitätsdeterminante pat-1 kloniert und sequenziert. Die offenen Leserahmen wiesen allerdings keinerlei Unterschiede zu pat-1 aus Cmm NCPPB382 auf, jedoch variieren die Poly-G-Region sowie die Anzahl der "direct repeats" im 3'-Bereich, ohne mit der Virulenz oder Avirulenz der Stämme zu korrelieren. Über partielle Sequenzierung des Cosmids 7-72, der Transposonmutante CMM101[beta]370-45 und aus Daten des Cmm-Genomprojektes wurden benachbart zu chpA sechs weitere homologe Gene identifiziert (chpB-chpG), die in der 80 kb großen sogenannten chp-Region liegen. In Southern Hybridisierungen mit spezifischen Sonden für jedes einzelne chp-Gen konnten bei den avirulenten Stämmen I-62, ZUM3036 und ZUM3121 sowie der Deletionsmutante CMM101[beta]330-18, die eine 130 kb große chromosomale Deletion trägt, keins bzw. bei I-63 nur eins der chp-Gene nachgewiesen werden, während die untersuchten virulenten Stämme alle chp-Gene besitzen. Die avirulenten Stämme sind in ihrer Kolonisationsfähigkeit eingeschränkt, es werden nur Titer von bis zu 10 hoch 7 cfu/g Pflanzenhomogenat erreicht, während bei virulenten Stämmen ein Titer von 10 hoch 9 cfu/g Pflanzenhomogenat auftritt. Somit scheint es eine Korrelation zwischen der hochtitrigen Kolonisation der Tomatenpflanze durch Cmm und der Anwesenheit der chp-Gene zu geben. In der chp-Region sind zudem weitere Gene lokalisiert, die für extrazelluläre Enzyme (die [beta]-N-Acetylglukosaminidase NagA, die Pektat-Lyasen PelA und PelC) kodieren, die eine Rolle in der Bakterien-Interaktion spielen könnten, da sie für eine Mazeration der Mittellamelle der Pflanzenzellwand benötigt werden könnten. Die Pat-1 Proteinfamilie, zu der Pat-1, PhpA, PhpB und ChpA-ChpG zählen, weist Homologien zu Serinproteasen der Subfamilie S1A auf. Sie besitzen die charakteristische katalytische Triade, die aus dem Serin- und Histidinmotiv sowie einem konservierten Aspartat besteht. Die gezielte Mutagenese der chp-Gene und der Exoenzyme sollte Aufschluss über ihre Funktion bringen. Inaktivierungen der Gene chpG, nagA und pelC führten nicht zu Veränderungen des pathogenen Phänotyps im Pflanzentest mit der Tomate. Dagegen zeigte die chpC-Mutante eine Reduzierung des Titers um einen Faktor von etwa 500 und verursachte nur bei 7 von 64 Pflanzen sehr schwache Welkesymptome. Durch Komplementation dieser Mutante mit dem Wildtyp chpC-Gen konnte der ursprüngliche pathogene Phänotyp wiederhergestellt werden, wodurch bestätigt wurde, dass die Mutation im chpC-Gen für den veränderten Phänotyp verantwortlich ist. Der avirulenten Deletionsmutante CMM101[beta]330-18 fehlt die komplette chp-Region. Eine Wiederherstellung des Welke-Phänotyps und eine Erhöhung des Titers in der Tomatenpflanze konnte weder durch das Einbringen der einzelnen Gene chpC, ppaA und ppaC in die Deletionsmutante CMM101[beta]330-18 noch die Kombination aller drei Gene erreicht werden. Die Transposonmutanten der Gene ppaA und ppaC, die auch für putative Serinproteasen einer anderen Familie kodieren, sind ebenfalls nur zu einer verringerten Kolonisation der Tomatenpflanze befähigt. Es ist daher wahrscheinlich, dass noch weitere Gene in der chp-Region eine Rolle in der Besiedlung der Wirtspflanze spielen. Pflanzentests auf Induktion einer hypersensitiven Reaktion (HR) bei der Nicht-Wirtspflanze Mirabilis jalapa zeigten, dass die avirulenten Stämme I-62, I-63, ZUM3036, ZUM3121, CMM101[beta]330-18 und der virulente Stamm CMM101chpG[beta] keine Nekrosen auf dem Blattgewebe induzieren können. Offenbar fehlt diesen Stämmen der Elicitor für eine HR