Development of a universal alignment medium for the extraction of RDCs and structure elucidation with tensorial constraints

In der hochauflösenden Kernresonanzspektroskopie liefern rest-anisotrope Parameter wie dipolare Restkopplungen (RDcs), restliche chemische Verschiebungsanisotropien (RCSAs) und quadrupolare Restkopplungen (RQCs) wertvolle Informationen, die zu den unter isotropen (standard-) Bedingungen gemessenen NMR-Parametern für die Strukturverfeinerung und -aufklärung komplementär sind. Daher ist ein homogenes und ausreichend schwaches sogenanntes "Alignment" in sogenannten Alignmentmedien erforderlich, um eine geringe Anisotropie in der Probe zu induzieren. Obwohl eine Vielzahl unterschiedlicher Alignmentmedien und -methoden existiert, werden sie recht selten genutzt, da die derzeit verfügbaren üblichen Alignmentmedien entweder speziell für die Anwendung mit kleinen organischen Molekülen oder für große (Bio-) Makromoleküle entwickelt wurden und ihre Verwendung auf bestimmte Lösungsmittel beschränkt ist. Neben flüssigkristallinen Phasen werden mechanisch gestreckte oder gestauchte Polymergele zur adäquaten Ausrichtung von gelösten Stoffen eingesetzt. Oft kann die Präparation von Proben bis zum Äquilibrieren bis zu Wochen und Monaten dauern, was die Nutzung dieser Methoden im kommerziellen Bereich eher erschwert. Frühere Untersuchungen mit vernetzten Polyethylenoxid-Hydrogelen (PEO) zeigten eine erhebliche Quellung in einer Vielzahl von Lösungsmitteln. Leider erforderte die Vernetzung die Verwendung von $\beta$- oder $\gamma$-Strahlung oder wochenlange Bestrahlung mit ultraviolettem Licht. In dieser Arbeit wird ein schneller Syntheseweg optimiert und vorgestellt, um homogene Gelstäbchen auf Basis von PEO als Alignmentmedien herzustellen, der mit den in jedem modernen Labor verfügbaren Mitteln nachvollzogen werden kann. Darüberhinaus wird das Quellverhalten in einer Vielzahl von reinen Lösungsmitteln und Gemischen aufgezeigt und der Einfluss des Massengehalts während der Vernetzung untersucht. Durch Verwendung eines Ausgangsmaterials mit geringer Dispersität wird Kontrolle über die Verteilung der Kettenlängen zwischen den Vernetzungspunkten ermöglicht, wodurch homogene Gele mit schmalen Linienbreiten erhalten werden. Gequollene Poly(ethylen oxid) diacrylat (PEODA) Gele, die mit unterschiedlichem Massenanteil vernetzt wurden, werden zusätzlich mit Doppelquanten NMR (DQ-NMR) untersucht, um das Verhältnis von vernetztem Anteil und der Solfraktion inklusive der Defekte im Netzwerk zu ermitteln. Die Anwendbarkeit von PEODA in skalierbaren Streck- und Kompressionsapparaturen wird präsentiert und erfolgreich mit reinen Lösungsmitteln und Gemischen demonstriert. Hierbei wird eine Methode eingeführt, die ein schnelles externes Äquilibrieren und Übertragen in die Probenröhrchen ermöglicht. Es wird gezeigt, dass durch Feinabstimmung verschiedener Parameter, vernetztes PEODA als universelles Alignmentmedium für gelöste Substanzen, die von kleinen Naturstoffen bis zu Proteinen reichen, geeignet ist. Die bisher angewandte Methode der manuellen Extraktion von Kopplungen ist zeitaufwändig und subjektiv. Es wird ein Verfahren zur halbautomatischen Extraktion von Kopplungen vorgestellt, welches mathematisch auf der Anwendung von Kreuz- bzw. Autokorrelationen beruht. Für die Auswertung von RDCs an kleinen organischen Molekülen, wurden Moleküldynamiksimulationen mit orientierenden Randbedingungen evaluiert und angewandt (engl.: molecular dynamics with orientational constraints, MDOC), einer Molekülmechanik-Methode, die ohne Annahmen über die Ausgangskonformation auskommt. Die Methode ermöglicht die Bestimmung des Konformationsraums anhand experimenteller anisotroper Daten, die als tensoriell orientierende Bedingungen in das Kraftfeld einfließen. Wenn gelöste Moleküle flexibel sind und in unterschiedlichen Konformationen auftreten, ist die Interpretation der Daten mit bisherigen Methoden aufgrund der gemittelten Natur der extrahierten Daten schwierig und Annahmen über auftretende Konformere müssen getroffen werden, die unter Umständen nicht gerechtfertigt sind. In diesen Fällen ist der MDOC Ansatz vorzuziehen, da die Interpretation der RDCs nicht durch die Wahl der Modellierung beeinflusst wird

Macrocyclic tetramers—structural investigation of peptide-peptoid hybrids

Outstanding affinity and specificity are the main characteristics of peptides, rendering them interesting compounds for basic and medicinal research. However, their biological applicability is limited due to fast proteolytic degradation. The use of mimetic peptoids overcomes this disadvantage, though they lack stereochemical information at the α-carbon. Hybrids composed of amino acids and peptoid monomers combine the unique properties of both parent classes. Rigidification of the backbone increases the affinity towards various targets. However, only little is known about the spatial structure of such constrained hybrids. The determination of the three-dimensional structure is a key step for the identification of new targets as well as the rational design of bioactive compounds. Herein, we report the synthesis and the structural elucidation of novel tetrameric macrocycles. Measurements were taken in solid and solution states with the help of X-ray scattering and NMR spectroscopy. The investigations made will help to find diverse applications for this new, promising compound class

Macrocyclic Tetramers—Structural Investigation of Peptide-Peptoid Hybrids

Outstanding affinity and specificity are the main characteristics of peptides, rendering them interesting compounds for basic and medicinal research. However, their biological applicability is limited due to fast proteolytic degradation. The use of mimetic peptoids overcomes this disadvantage, though they lack stereochemical information at the α-carbon. Hybrids composed of amino acids and peptoid monomers combine the unique properties of both parent classes. Rigidification of the backbone increases the affinity towards various targets. However, only little is known about the spatial structure of such constrained hybrids. The determination of the three-dimensional structure is a key step for the identification of new targets as well as the rational design of bioactive compounds. Herein, we report the synthesis and the structural elucidation of novel tetrameric macrocycles. Measurements were taken in solid and solution states with the help of X-ray scattering and NMR spectroscopy. The investigations made will help to find diverse applications for this new, promising compound class

Configuration determination by residual dipolar couplings: accessing the full conformational space by molecular dynamics with tensorial constraints

Residual dipolar couplings (RDCs) and other residual anisotropic NMR parameters provide valuable structural information of high quality and quantity, bringing detailed structural models of flexible molecules in solution in reach. The corresponding data interpretation so far is directly or indirectly based on the concept of a molecular alignment tensor, which, however, is ill-defined for flexible molecules. The concept is typically applied to a single or a small set of lowest energy structures, ignoring the effect of vibrational averaging. Here, we introduce an entirely different approach based on time averaged molecular dynamics with dipolar couplings as tensorial orientational restraints that can be used to solve structural problems in molecules of any size without the need of introducing an explicit molecular alignment tensor into the computation. RDC restraints are represented by their full 3D interaction tensor in the laboratory frame, for which pseudo forces are calculated using a secular dipolar Hamiltonian as the target. The resulting rotational averaging of each individual tensorial restraint leads to structural ensembles that best fulfil the experimental data. Using one-bond RDCs, the approach has been implemented in the force field procedures of the program COSMOS and extensively tested. A concise theoretical introduction, including the special treatment of force fields for stable and fast MD simulations, as well as applications regarding configurational analyses of small to medium-sized organic molecules with different degrees of flexibility, is given. The observed results are discussed in detail

A double-tracer technique to characterize absorption, distribution, metabolism and excretion (ADME) of [¹⁴C]-basimglurant and absolute bioavailability after oral administration and concomitant intravenous microdose administration of [¹³C₆]-labeled basimglurant in humans

<p>1. The emerging technique of employing intravenous microdose administration of an isotope tracer concomitantly with an [¹⁴C]-labeled oral dose was used to characterize the disposition and absolute bioavailability of a novel metabotropic glutamate 5 (mGlu5) receptor antagonist under clinical development for major depressive disorder (MDD).</p> <p>2. Six healthy volunteers received a single 1 mg [¹²C/¹⁴C]-basimglurant (2.22 MBq) oral dose and a concomitant i.v. tracer dose of 100 μg of [¹³C₆]-basimglurant. Concentrations of [¹²C]-basimglurant and the stable isotope [¹³C₆]-basimglurant were determined in plasma by a specific LC/MS-MS method. Total [¹⁴C] radioactivity was determined in whole blood, plasma, urine and feces by liquid scintillation counting. Metabolic profiling was conducted in plasma, urine, blood cell pellet and feces samples.</p> <p>3. The mean absolute bioavailability after oral administration (F) of basimglurant was ∼67% (range 45.7–77.7%). The major route of [¹⁴C]-radioactivity excretion, primarily in form of metabolites, was in urine (mean recovery 73.4%), with the remainder excreted in feces (mean recovery 26.5%). The median t_max for [¹²C]-basimglurant after the oral administration was 0.71 h (range 0.58–1.00) and the mean terminal half-life was 77.2 ± 38.5 h. Terminal half-life for the [¹⁴C]-basimglurant was 178 h indicating presence of metabolites with a longer terminal half-life. Five metabolites were identified with M1-Glucuronide as major and the others in trace amounts. There was minimal binding of drug to RBCs. IV pharmacokinetics was characterized with a mean ± SD CL of 11.8 ± 7.4 mL/h and a Vss of 677 ± 229 L.</p> <p>4. The double-tracer technique used in this study allowed to simultaneously characterize the absolute bioavailability and disposition characteristics of the new oral molecular entity in a single study.</p