Rôle de la membrane plasmique dans les mécanismes de défense des plantes 2013

National audienceLe développement d’une méthode d’imagerie innovante a permis de montrer que la membrane qui entoure les cellules végétales est composée d’une multitude de petits territoires présentant des états physiques variés. L’organisation globale et locale de cette membrane est modifiée de façon très rapide lorsque la cellule détecte des microorganismes, établissant un lien fonctionnel entre cette organisation et la mise en place de mécanismes de défense. 13 10 ans de recherche SPE Les plantes sont confrontées en permanence à des attaques de champignons, bactéries ou autres parasites, et développent des réponses adaptatives qui conditionnent leur survie. Certaines molécules produites par des microorganismes, appelées éliciteurs, sont reconnues par la plante qui mobilise alors ses systèmes de défense inductibles et organise sa résistance. La membrane des cellules végétales est une mosaïque hétérogène de territoires de très petite taille. Certains d’entre eux, enrichis en constituants protéiques et lipidiques particuliers, apparaissent comme plus rigides et ordonnés car ils sont le siège d’interactions fortes entre les différentes molécules, notamment les lipides, qui les constituent. Dans les minutes qui suivent le traitement par un éliciteur de réactions de défense, la cryptogéine, une petite protéine sécrétée par un oomycète, la membrane des cellules de tabac subit deux modifications : elle voit sa fluidité latérale et la proportion des petits domaines ordonnés augmenter. Le traitement par un éliciteur bactérien, la flagelline, provoque uniquement ce second mécanisme. La cryptogéine est, contrairement à la flagelline, un éliciteur nécrosant, provoquant une mort cellulaire locale visant à contenir la progression du microorganisme. Ainsi, l’augmentation de la proportion de domaines ordonnés pourrait être un phénomène générique associé au déclenchement de la signalisation de défense, quand l’augmentation de fluidité latérale serait un effet spécifique à la cryptogéine. Ces travaux ont révélé la première description de l’organisation de la membrane végétale, et son implication dans les réponses de défense. Ils ont ouvert la voie à la caractérisation de la dynamique et de certains nouveaux acteurs de cette cascade cellulaire

Les radeaux membranaires et la signalisation végétale

Face à une fluctuation des paramètres de son milieu ambiant ou à une agression biotique, la cellule végétale met en place une réponse adaptative dont les étapes les plus précoces sont la reconnaissance précise et rapide du stress, capable d’induire le développement d’une cascade de signalisation appropriée. Certains des acteurs de ces voies sont localisés sur la membrane plasmique (MP). En fonction de l’espèce, l’état physiologique… d’une cellule, on trouve au sein de sa MP des lipides, des protéines et des oses de structures et en concentrations variables. Chez les cellules de tabac, par exemple, on compte environ 50 lipides pour une protéine.Bien que moins nombreuses, les protéines ont pourtant depuis tous temps été considérées comme les principales responsables du fonctionnement plasmalemmique, et plus largement membranaire. Dans ce contexte, l’étude du lien entre la perméabilité d’une membrane et l’activité spécifique des canaux qui s’y trouve semblait prometteuse. Ainsi, des expériences de sonde de pression évaluant la conductance hydraulique d’un organe ou d’une cellule entière, et de spectrophotométrie en flux interrompu mesurant la perméabilité de vésicules de membrane purifiée, ont été couplées à des approches d'expression fonctionnelle en ovocyte de xénope caractérisant l’activité d’une protéine isolée. Ces approches, développées pendant ma thèse, ont permis de montrer une excellente analogie entre la haute perméabilité aux solutés, notamment à l’urée, du tonoplaste de cellules de tabac et la sélectivité de l’activité de transport de Nt-TIPa, une nouvelle aquaporine tonoplastique. D’autres données ont confirmé de telles similitudes en rapprochant la régulation par le pH et les cations divalents de la conductivité hydraulique de cellules d'Arabidopsis à la sensibilité aux pH acides et aux concentrations croissantes en calcium de la perméabilité hydrique de vésicules de plasmalemme purifié. Depuis, l’étude de mutations de l’aquaporine plasmalemmique At-PIP2;1 a permis de décrypter les modifications de l’ouverture du pore, en réponse à pH et calcium. La plasticité des membranes biologiques ne s’exprime pas uniquement dans la multitude des régulations de leurs activités de transport, leurs compositions lipidiques peuvent être tout aussi (et localement) modulables. Par exemple, chez le tabac des fractions, montrant des singularités biochimiques et notamment une résistance à la solubilisation par les détergents, sont enrichies en stérols et sphingolipides. L’existence au sein de la MP de différentes fractions aux caractéristiques distinctes laissait entrevoir la possibilité d’une hétérogénéité de cette membrane in vivo. Les propriétés d’une sonde fluorescente sensible à l’état d’ordre de la membrane ont été utilisées pour dépeindre l’organisation spatiale du plasmalemme directement sur cellule végétale. Associées à des techniques d’imagerie telles que la microscopie confocale multispectrale, elles ont permis de localiser, in situ, des domaines plus ordonnés à la surface de cellules de tabac. Des approches pharmacologiques ont établi l’implication des stérols dans la structuration du plasmalemme en domaines ordonnés, en parfait accord avec nos résultats de spectroscopie de fluorescence sur fractions de membrane purifiée. Des vésicules membranaires géantes constituées de mélanges de complexité croissante de molécules telles que des phytostérols, phytosphingolipides et phospholipides ont revisité la vision classique de la communauté scientifique sur l’hétérogénéité latérale du plasmalemme, en déterminant l’implication d’une part de la structure et d’autre part de la concentration locale, de chacune de ces molécules dans l’organisation spatiale de cette membrane. Ces travaux, actuellement complétés par des approches in vivo, fixaient le rôle majeur des interactions sphingolipides/phytostérols et protéines/lipides dans l’organisation latérale de la membrane plasmique. Pour être complète la caractérisation de la MP doit maintenant se tourner vers l’identification des espèces et des mécanismes moléculaires qui gouvernent ces regroupements locaux. Des approches de titration calorimétrique et/ou d’optique fine (microscopie à force atomique) peuvent être envisagées, en collaboration avec des unités maitrisant ces techniques, pour déterminer les partenaires et les interactions impliquées. Simultanément, l’observation d’une augmentation de la densité et de la taille des domaines les plus ordonnés de la MP en réponse à des éliciteurs de réactions de défense propose la formation de plateforme de signalisation, comme celle décrite chez les animaux. Afin de comprendre les fondements sous-jacents à la dynamique de ces plateformes, l’imagerie cellulaire pourrait être couplée à des outils pharmacologiques afin de i) montrer un éventuel adressage au plasmalemme de domaines ordonnées en attente sous forme de vésicules sous-jacentes, et de ii) préciser les points de rencontre entre différentes voies du trafic membranaire induites concomitamment par le stress biotique, à savoir la déstructuration des tubules, la production de vésicules d’endocytose, la régulation de l’architecture du tonoplaste… En lieu et place ou en parallèle de cette arrivée de domaines plus ordonnés, une néo-synthèse par changement des propriétés biophysiques des domaines pré-existants est probable. Dans ce laps de temps, des modifications induites par le burst oxydatif des molécules déjà en place semblent en effet appropriées. Pour tester cette hypothèse, la visualisation in vivo du niveau d’oxydation de la membrane serait pertinente. La mesure, en parallèle, des effets de ces modifications sur l’état d’ordre de la membrane pourrait se faire sur système simplifié par des analyses biophysiques. Enfin, afin d’apporter des éléments de réponse à la question de l’implication des radeaux membranaires dans les différentes étapes de l’interaction plante-microorganismes, une piste, actuellement relativement vierge, à explorer serait l’étude des conséquences d’un enrichissement en domaines ordonnés dans la réponse adaptative. La réquisition de protéine cible dans ces domaines, pour en modifier l’activité via l’interaction avec des co-facteurs enrichis localement, est avancée de façon consensuelle. Ayant, nous, suggéré une forte implication des lipides, quel(s) rôle(s) pourrait alors jouer la régulation de leur concentration d’une part, et de leur organisation locale d’autre part

Les radeaux membranaires et la signalisation végétale

Face à une fluctuation des paramètres de son milieu ambiant ou à une agression biotique, la cellule végétale met en place une réponse adaptative dont les étapes les plus précoces sont la reconnaissance précise et rapide du stress, capable d’induire le développement d’une cascade de signalisation appropriée. Certains des acteurs de ces voies sont localisés sur la membrane plasmique (MP). En fonction de l’espèce, l’état physiologique… d’une cellule, on trouve au sein de sa MP des lipides, des protéines et des oses de structures et en concentrations variables. Chez les cellules de tabac, par exemple, on compte environ 50 lipides pour une protéine.Bien que moins nombreuses, les protéines ont pourtant depuis tous temps été considérées comme les principales responsables du fonctionnement plasmalemmique, et plus largement membranaire. Dans ce contexte, l’étude du lien entre la perméabilité d’une membrane et l’activité spécifique des canaux qui s’y trouve semblait prometteuse. Ainsi, des expériences de sonde de pression évaluant la conductance hydraulique d’un organe ou d’une cellule entière, et de spectrophotométrie en flux interrompu mesurant la perméabilité de vésicules de membrane purifiée, ont été couplées à des approches d'expression fonctionnelle en ovocyte de xénope caractérisant l’activité d’une protéine isolée. Ces approches, développées pendant ma thèse, ont permis de montrer une excellente analogie entre la haute perméabilité aux solutés, notamment à l’urée, du tonoplaste de cellules de tabac et la sélectivité de l’activité de transport de Nt-TIPa, une nouvelle aquaporine tonoplastique. D’autres données ont confirmé de telles similitudes en rapprochant la régulation par le pH et les cations divalents de la conductivité hydraulique de cellules d'Arabidopsis à la sensibilité aux pH acides et aux concentrations croissantes en calcium de la perméabilité hydrique de vésicules de plasmalemme purifié. Depuis, l’étude de mutations de l’aquaporine plasmalemmique At-PIP2;1 a permis de décrypter les modifications de l’ouverture du pore, en réponse à pH et calcium. La plasticité des membranes biologiques ne s’exprime pas uniquement dans la multitude des régulations de leurs activités de transport, leurs compositions lipidiques peuvent être tout aussi (et localement) modulables. Par exemple, chez le tabac des fractions, montrant des singularités biochimiques et notamment une résistance à la solubilisation par les détergents, sont enrichies en stérols et sphingolipides. L’existence au sein de la MP de différentes fractions aux caractéristiques distinctes laissait entrevoir la possibilité d’une hétérogénéité de cette membrane in vivo. Les propriétés d’une sonde fluorescente sensible à l’état d’ordre de la membrane ont été utilisées pour dépeindre l’organisation spatiale du plasmalemme directement sur cellule végétale. Associées à des techniques d’imagerie telles que la microscopie confocale multispectrale, elles ont permis de localiser, in situ, des domaines plus ordonnés à la surface de cellules de tabac. Des approches pharmacologiques ont établi l’implication des stérols dans la structuration du plasmalemme en domaines ordonnés, en parfait accord avec nos résultats de spectroscopie de fluorescence sur fractions de membrane purifiée. Des vésicules membranaires géantes constituées de mélanges de complexité croissante de molécules telles que des phytostérols, phytosphingolipides et phospholipides ont revisité la vision classique de la communauté scientifique sur l’hétérogénéité latérale du plasmalemme, en déterminant l’implication d’une part de la structure et d’autre part de la concentration locale, de chacune de ces molécules dans l’organisation spatiale de cette membrane. Ces travaux, actuellement complétés par des approches in vivo, fixaient le rôle majeur des interactions sphingolipides/phytostérols et protéines/lipides dans l’organisation latérale de la membrane plasmique. Pour être complète la caractérisation de la MP doit maintenant se tourner vers l’identification des espèces et des mécanismes moléculaires qui gouvernent ces regroupements locaux. Des approches de titration calorimétrique et/ou d’optique fine (microscopie à force atomique) peuvent être envisagées, en collaboration avec des unités maitrisant ces techniques, pour déterminer les partenaires et les interactions impliquées. Simultanément, l’observation d’une augmentation de la densité et de la taille des domaines les plus ordonnés de la MP en réponse à des éliciteurs de réactions de défense propose la formation de plateforme de signalisation, comme celle décrite chez les animaux. Afin de comprendre les fondements sous-jacents à la dynamique de ces plateformes, l’imagerie cellulaire pourrait être couplée à des outils pharmacologiques afin de i) montrer un éventuel adressage au plasmalemme de domaines ordonnées en attente sous forme de vésicules sous-jacentes, et de ii) préciser les points de rencontre entre différentes voies du trafic membranaire induites concomitamment par le stress biotique, à savoir la déstructuration des tubules, la production de vésicules d’endocytose, la régulation de l’architecture du tonoplaste… En lieu et place ou en parallèle de cette arrivée de domaines plus ordonnés, une néo-synthèse par changement des propriétés biophysiques des domaines pré-existants est probable. Dans ce laps de temps, des modifications induites par le burst oxydatif des molécules déjà en place semblent en effet appropriées. Pour tester cette hypothèse, la visualisation in vivo du niveau d’oxydation de la membrane serait pertinente. La mesure, en parallèle, des effets de ces modifications sur l’état d’ordre de la membrane pourrait se faire sur système simplifié par des analyses biophysiques. Enfin, afin d’apporter des éléments de réponse à la question de l’implication des radeaux membranaires dans les différentes étapes de l’interaction plante-microorganismes, une piste, actuellement relativement vierge, à explorer serait l’étude des conséquences d’un enrichissement en domaines ordonnés dans la réponse adaptative. La réquisition de protéine cible dans ces domaines, pour en modifier l’activité via l’interaction avec des co-facteurs enrichis localement, est avancée de façon consensuelle. Ayant, nous, suggéré une forte implication des lipides, quel(s) rôle(s) pourrait alors jouer la régulation de leur concentration d’une part, et de leur organisation locale d’autre part

La membrane plasmique des plantes : une clé dans la détection des agresseurs et le processus de défensefra

SPE IPMNational audienceLe développement d’une méthode d’imagerie innovante a permis de montrer que la membrane plasmique des cellules végétales est une mosaïque de territoires présentant des propriétés biophysiques variées. Cette organisation est modifiée de façon très rapide en réponse à certaines molécules provenant de microorganismes, établissant un lien fonctionnel entre cette organisation et la mise en place des mécanismes de défense

Study of lipidic membrane component effect on the membrane order level by using GUVs

National audienc

Effects of lipids on membrane order level by using GUVs

National audienc

Cell stage appears critical for control of plasma membrane order in plant cells

International audienceLipids and proteins modulate both the global order of plasma membrane (PM) and its organization in distinct domains. This raises the question of the influence on PM-ordered domain formation of PM composition, which is finely controlled during cell differentiation. Labeling of plant cell PM with an environment-sensitive probe demonstrated that the level of PM order is regulated during anisotropic expansion observed during both cell regeneration from protoplasts and cell differentiation along the growing root. Indeed, PM order progressively decreased during the polarized growth of regenerated tobacco cells, without observed correlation between this parameter and the kinetics of either cell wall regeneration or cell morphology. This suggests that the dynamics of PM formation and renewal could control the PM organization, maybe by involving the secretory pathway

Building plant membrane domains

SPEIPMUBINRABuilding plant membrane domains . 2. International Meeting "Building the cell

Differential Effect of Plant Lipids on Membrane Organization

SPE IPMInternational audienceThe high diversity of the plant lipid mixture raises the question of their respective involvement in the definition of membrane organization. This is particularly the case for plant plasma membrane, which is enriched in specific lipids, such as free and conjugated forms of phytosterols and typical phytosphingolipids, such as glycosylinositolphosphoceramides. This question was here addressed extensively by characterizing the order level of membrane from vesicles prepared using various plant lipid mixtures and labeled with an environment-sensitive probe. Fluorescence spectroscopy experiments showed that among major phytosterols, campesterol exhibits a stronger ability than β-sitosterol and stigmasterol to order model membranes. Multispectral confocal microscopy, allowing spatial analysis of membrane organization, demonstrated accordingly the strong ability of campesterol to promote ordered domain formation and to organize their spatial distribution at the membrane surface. Conjugated sterol forms, alone and in synergy with free sterols, exhibit a striking ability to order membrane. Plant sphingolipids, particularly glycosylinositolphosphoceramides, enhanced the sterol-induced ordering effect, emphasizing the formation and increasing the size of sterol-dependent ordered domains. Altogether, our results support a differential involvement of free and conjugated phytosterols in the formation of ordered domains and suggest that the diversity of plant lipids, allowing various local combinations of lipid species, could be a major contributor to membrane organization in particular through the formation of sphingolipid-sterol interacting domains