Genetic and molecular analysis of the std operon of salmonella enterica

Salmonella enterica serovar Typhimurium es una bacteria gram-negativa que causa enfermedades gástricas y sistémicas en una gran variedad de organismos, incluyendo la especie humana. La invasión del epitelio intestinal es un proceso crítico en la infección por Salmonella y requiere funciones codificadas en una región del cromosoma bacteriano adquirida por transferencia horizontal, conocida como isla de patogenicidad 1 (SPI-1). Otro locus que Salmonella ha adquirido por transferencia horizontal es el operón std, implicado en la formación de fimbrias que participan en la colonización del intestino del hospedador. La expresión del operón std se encuentra reprimida en condiciones de laboratorio y se activa en el intestino. Estudios previos han mostrado que esta represión es causada principalmente por la metilación Dam y en menor medida por el represor RosE. La transcripción del operón std en los mutantes Dam– requiere HdfR, un factor de transcripción poco conocido de tipo LysR. Estos mismos estudios han sugerido la posibilidad de que la expresión de std esté sujeta a biestabilidad o cambio de fase. Recientemente se ha visto que el producto de los dos genes distales del operón, stdE y stdF, es responsable de la represión de los genes de SPI-1 en mutantes Dam–, que muestran un fenotipo de baja invasión en células epiteliales. En base a estos antecedentes, esta Tesis se inició con el objetivo de investigar si la expresión del operón std está sujeta a biestabilidad en condiciones de laboratorio. La existencia de heterogeneidad fenotípica en poblaciones clonales es un concepto relativamente reciente, pero cada vez son más los ejemplos encontrados. Para determinar si el operón std mostraba biestabilidad se construyeron fusiones GFP en stdA y se usó citometría de flujo para analizar su expresión en células individuales. De estos experimentos se ha podido concluir que existe una expresión bimodal del operón std en condiciones de laboratorio. La expresión de std tiene lugar en un 0,3-3% de la población, generando dos subpoblaciones: StdON y StdOFF. Otro objetivo de esta Tesis era entender el mecanismo molecular que controla la transcripción de std generando una expresión bimodal del mismo. Se ha puesto de manifiesto el papel esencial de HdfR para la expresión de std, no solo en fondo Dam– como ya se había descrito sino también en fondo silvestre. La subpoblación StdON desaparece en ausencia de HdfR y aumenta de tamaño si hdfR se expresa constitutivamente. Además, igual que ocurre en otros factores transcripcionales de tipo LysR, hemos demostrado la existencia de un proceso de autorregulación (represión) que mantiene la transcripción de hdfR en niveles constantes. La metilación Dam es el principal represor de la expresión del operón std, pero existen otros represores previamente descritos como RosE o SeqA. En colaboración con el grupo de la Dr. Delgado del Instituto Superior de Investigaciones Biológicas (INSIBIO) CONICET-UNT en Argentina, se ha identificado un nuevo represor de la expresión de std, RcsB. La expresión constitutiva de rcsB reprime la expresión de std en fondo Dam– y también en fondo silvestre. Se han realizado ensayos de retardo en gel para corroborar la unión de RcsB a la región promotora de std. El análisis bioinformático identifica un posible sitio de unión de RcsB en la región -35 del promotor de std. Con el fin de identificar otros posibles reguladores de la transcripción del operón std, se realizaron escrutinios genéticos. Los resultados obtenidos mostraron una autorregulación positiva del operón std, de la que son responsables los genes distales del operón std: stdE y stdF. Ensayos realizados mediante citometría de flujo corroboran los resultados del escrutinio. La expresión de stdE y stdF mantiene la subpoblación StdON y una expresión constitutiva de stdE y stdF aumenta el tamaño de dicha subpoblación. La expresión bimodal del operón std en fondo silvestre nos llevó a pensar en la existencia de patrones de metilación distintos para cada una de las subpoblaciones. Para demostrar la existencia de dichos patrones de metilación se han realizados ensayos de Southern Blot tras digestión del DNA con isosquizómeros de enzimas de restricción que reconocen la misma secuencia en el DNA (GATC) pero difieren en su sensibilidad al estado de metilación de la diana. Los tres sitios GATC de la región reguladora se hallan metilados cuando el promotor está inactivo (la subpoblación StdOFF es mayoritaria en un fondo silvestre). Resultados de citometría de flujo sugieren un patrón de metilación distinto para la subpoblación StdON, ya que la hipermetilación disminuye dicha subpoblación. Anteriormente se había descrito que StdE y StdF controlan la expresión de hilD a nivel postranscripcional. Teniendo en cuenta que nuestros resultados indican que StdE y StdF son reguladores autógenos de la transcripción de std, nos planteamos la posibilidad de que estas proteínas tuvieran un papel regulador. Con objeto de identificar posibles dianas de regulación del regulón StdEF se realizó un análisis transcriptómico usando un microarray de S. enterica serovar Typhimurium. Los datos obtenidos nos han permitido identificar a StdE y StdF como reguladores globales de la transcripción en Salmonella, ya que no sólo reprimen la isla de patogenicidad 1 (SPI-1) sino también genes flagelares y de quimiotaxis. Por otra parte, StdEy StdF activan la expresión de genes del plásmido de virulencia y del gen hdfR, que codifica el factor de transcripción esencial para la expresión del operón std. Para tratar de determinar el mecanismo regulador de estas proteínas, hemos realizado un ensayo de ChIP-seq (inmunoprecipitación de cromatina seguida de secuenciación masiva), que permite identificar sitios de unión al DNA de las proteínas analizadas. Los resultados obtenidos confirman el papel de StdE y StdF como reguladores transcripcionales de la expresión en Salmonella. StdE parece tener un papel principal, uniéndose a regiones promotoras del DNA. Por otro lado, los resultados del ChIP-seq sugieren un papel secundario o accesorio de StdF en la regulación, quizá favoreciendo la actuación de StdE. El análisis global de la unión de StdE y StdF al genoma de Salmonella ha proporcionado información acerca de la autorregulación del operón std. Como ya se ha mencionado, StdE y StdF favorecen la expresión de std, aumentando el tamaño de la subpoblación StdON. Según los datos del ChIP-seq, es StdF quien se encuentra en la región promotora, favoreciendo la expresión de std. Queda por determinar si StdF tiene un papel principal en la regulación de std o, como en otros sitios de regulación, actúa de modo auxiliar, tal vez favoreciendo la unión de HdfR o impidiendo la actividad de la metilasa Dam. Todo parece indicar que nos encontramos frente a un sistema de regulación global pero con expresión bimodal. La expresión del operón std, con la consiguiente formación de fimbrias, tiene lugar en una pequeña fracción de la población en condiciones de laboratorio, y mayoritariamente en condiciones de adherencia al epitelio intestinal. En dichas condiciones, la bacteria mantiene reprimidos los genes implicados en virulencia, expresión del flagelo o quimiotaxis, y los genes reguladores del operón std son los encargados de coordinar estos procesos. Por otro lado la expresión del operón std favorece la activación del sistema conjugativo del plásmido de virulencia y garantiza el mantenimiento del mecanismo autorregulador de expresión del propio operón std al activar el factor de transcripción HdfR y al ejercer de reguladores transcripcionales uniéndose a la región promotora del propio operón std

Regulation of bistability in the std fimbrial operon of Salmonella enterica by DNA adenine methylation and transcription factors HdfR, StdE and StdF

Bistable expression of the Salmonella enterica std operon is controlled by an AND logic gate involving three transcriptional activators: the LysR-type factor HdfR and the StdE and StdF regulators encoded by the std operon itself. StdE activates transcription of the hdfR gene, and StdF activates std transcription together with HdfR. Binding of HdfR upstream of the std promoter is hindered by methylation of GATC sites located within the upstream activating sequence (UAS). Epigenetic control by Dam methylation thus antagonizes formation of the StdE-StdF-HdfR loop and tilts the std switch toward the StdOFF state. In turn, HdfR binding hinders methylation of the UAS, permitting activation of the StdE-StdF-HdfR loop and concomitant formation of StdON cells. Bistability is thus the outcome of competition between DNA adenine methylation and the StdE-StdF-HdfR activator loop.Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades [BIO2016–75235-P

Valorización energética de la glicerina como subproducto del biodiésel

Se estudian los métodos de valorización de la glicerina obtenida como subproducto del biodiésel para analizar los rendimientos energéticos que se obtienen y el mejor método a emplear. Los métodos estudiados son el reformado con vapor de agua y el reformado en fase acuosa (APR)

Energy Taxis toward Host-Derived Nitrate Supports a Salmonella Pathogenicity Island 1-Independent Mechanism of Invasion

Salmonella enterica serovar Typhimurium can cross the epithelial barrier using either the invasion-associated type III secretion system (T3SS-1) or a T3SS-1-independent mechanism that remains poorly characterized. Here we show that flagellum-mediated motility supported a T3SS-1-independent pathway for entering ileal Peyer’s patches in the mouse model. Flagellum-dependent invasion of Peyer’s patches required energy taxis toward nitrate, which was mediated by the methyl-accepting chemotaxis protein (MCP) Tsr. Generation of nitrate in the intestinal lumen required inducible nitric oxide synthase (iNOS), which was synthesized constitutively in the mucosa of the terminal ileum but not in the jejunum, duodenum, or cecum. Tsr-mediated invasion of ileal Peyer’s patches was abrogated in mice deficient for Nos2, the gene encoding iNOS. We conclude that Tsr-mediated energy taxis enables S. Typhimurium to migrate toward the intestinal epithelium by sensing host-derived nitrate, thereby contributing to invasion of Peyer’s patches

Formation of phenotypic lineages in Salmonella enterica by a pleiotropic fimbrial switch

The std locus of Salmonella enterica, an operon acquired by horizontal transfer, encodes fimbriae that permit adhesion to epithelial cells in the large intestine. Expression of the std operon is bistable, yielding a major subpopulation of StdOFF cells (99.7%) and a minor subpopulation of StdON cells (0.3%). In addition to fimbrial proteins, the std operon encodes two proteins, StdE and StdF, that have DNA binding capacity and control transcription of loci involved in flagellar synthesis, chemotaxis, virulence, conjugal transfer, biofilm formation, and other cellular functions. As a consequence of StdEF pleiotropic transcriptional control, StdON and StdOFF subpopulations may differ not only in the presence or absence of Std fimbriae but also in additional phenotypic traits. Separation of StdOFF and StdON lineages by cell sorting confirms the occurrence of lineage-specific features. Formation of StdOFF and StdON lineages may thus be viewed as a rudimentary bacterial differentiation program

Structural and Proton Conductivity Studies of Fibrous π-Ti2O(PO4)2·2H2O: Application in Chitosan- Based Composite Membranes

Although the fibrous polymorphic modification of titanium phosphate, π-Ti2O(PO4)2·2H2O (π-TiP) is known for decades, its crystal structure has remained unsolved. Herewith we report the crystal structure of π-TiP at a room temperature, determined from the synchrotron radiation powder X-ray diffraction, and corroborated by 31P solid state NMR and the accurate density functional theory calculations. In contrast to the previously reported ρ-TiP polymorph, the as-synthesized hydrated phase crystallizes in the monoclinic system (P21/c, a = 5.1121(2) Å, b = 14.4921(9) Å, c = 12.0450(11), β = 115.31(1)°, Z=4) and is composed of corner-sharing titanium octahedra and phosphate units arranged in a pattern distinct of ρ-TiP polymorph. The unit cell was confirmed by SAED, while the formation of planar packing imperfections and stacking faults along the [101] was revealed by HRTEM analysis. In situ dehydration study of π-TiP, monitored by high-temperature powder X-ray diffraction, led to a new anhydrous monoclinic [P21/c, a = 5.1187(13) Å, b = 11.0600(21) Å, c = 14.4556(26), β = 107.65(2)°, Z=4) phase that crystallizes at 500°C. The latter resembles the packing fashion of the parental π-TiP, albeit titanium atoms are present both in distorted tetrahedral and octahedral coordination environments. Anhydrous π-TiP was found to partially rehydrate at room temperature adopting reversibly the structure of the initial phase. The studies carried out under different conditions of leaching and impregnation with H3PO4 showed that π-TiP exhibits an extrinsic proton conductivity (1.3·10−3 S·cm−1 at 90 °C and 95% RH) due to the presence of protonated phosphate species bounded on the particles surface, as revealed by 31P MAS-NMR spectroscopy data. The composite membranes of Chitosan (CS) matrices filled with H3PO4-impregnated π-TiP solid show an increment of proton conductivity up to 4.5·10–3 S·cm–1, at 80 °C and 95% RH, 1.8-fold higher than those of bare CS membranesMAT2016-77648-R and PID2019-110249RB-I00), Junta deAndalucía (FQM-113) M. Bazaga-García thanks Junta de Andalucía for her Postdoc PAIDI grant and R. M. P. Colodrero thanks UMA Research Plan for her financial support

Mejora de las Metodologías Docentes para el área de la Electrónica

Fac. de Ciencias FísicasFALSEsubmitte

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The prestige of the objects: Ivory handles in the Iberian world

El estudio se centra en una serie de mangos de marfil de características morfotécnicas similares, recuperados en espacios de hábitat y funerarios ibéricos y datados entre el s. IV y el s. II a. C. Se trata de objetos de prestigio al alcance de una élite aristocrática, que han sido elaborados con materias primas exóticas (marfil) y técnicas decorativas inusuales que indican una especialización. A través de análisis de composición por infrarrojo cercano por Transformada de Fourier (FT-NIR) y de fluorescencia de rayos X (pXRF) se ha podido documentar la presencia de incrustaciones de ámbar adheridas a la superficie de los mangos mediante el uso del estaño como soldadura blanda y el empleo de apliques metálicos de bronce y plata. Se debate sobre la procedencia de estas piezas y sobre el conocimiento técnico artesanal necesario para fabricarlas.This work focuses on ivory handles with similar morphotecnic characteristics recovered in both habitat and funerary spaces, dated between the 4th and 2nd century BC. These are prestigious objects only accessible to the aristocratic elite, and have been manufactured with exotic materials (ivory) and unusual decorative techniques that show a specialization Trough Fourier transform near-infrared (FT-NIR) and portable X-ray fluorescence (pXRF) analysis, it has been possible to document amber inlays adhered to the surface of the handles by using tin as a soft solder. Likewise, some of these objects are decorated with bronze overlays and, exceptionally in one of those, the handle is covered on its sides with a silver sheet. The origin and necessary craft technical knowledge to make these objects is discussed