Expressão relativa de fator semelhante a insulina (IGFI) e receptor do homômonio folículo estimulante (FSHR) em folículos e tecido ovariano de Bos primigenius (Nelore)

The improvement of techniques to maximize reproductive potential of females needs the whole comprehension of the controlling mechanisms of follicular development. An alternative for this purpose is the quantification of relative gene expression from those genes involved in recruitment, selection and follicular development, using reverse transcriptase - polymerase chain reaction (RT - PCR). The present study aimed to quantify relative gene expression from insulin-like growth factor I (IGF-I) and follicle stimulating hormone receptor (FSHR) in cattle (Bos primigenius indicus), using as internal control the gliceraldheyde 3 phosphate dehydrogenase (GAPDH) gene. Ovaries in different estral cycle stages were obtained from slaughtered animals. Total RNA from follicles and ovarian tissue was purified and the RT-PCR conditions were standardized. PCR products were analyzed in ethydium bromide agarose gels and the bands submitted to densitometric analysis. Exponential amplification curves were constructed and the method's validation was performed using regression analysis to determine the amplification coefficient (E) for each of the three genes. Relative expression for each gene was calculated using the formula described by Prelle et al.12. In every sample there was gene expression detected for each gene showing differences related to cycle temperature. Amplification coefficient (E) was similar between control gene (GAPDH) and IGFI, independently of the class analyzed. IGFI linear amplification could be related to the constitutive characteristic of this protein since the transcripts are not dependents of FSH levels. It was observed difference in FSHR mRNA expression between the classes analyzed. It could be due to the variation of the receptor number in granulosa cells for each different phase of estral cycle. Semi-quantitative RT-PCR has a large application in biotechnology since it is useful to help us the better understanding of follicular dynamics. However these studies must be conducted using other genes in order to provide new clues for the physiology of folliculogenesis.O aperfeiçoamento das técnicas que objetivam a exploração do potencial reprodutivo das fêmeas requer a compreensão mais ampla dos mecanismos de controle de desenvolvimento folicular. Uma alternativa de estudo nesta esfera, é a quantificação da expressão relativa de genes envolvidos nos processos de recrutamento, seleção e desenvolvimento folicular, pelo emprego da técnica de transcrição - reversa associado a reação em cadeia pela polimerase (RT - PCR). O presente trabalho objetivou quantificar a expressão relativa dos genes insulin-like growth factor I (IGF-I) e do receptor do hormônio folículo estimulante (FSHR), tendo como controle interno o gene da gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH). Foram utilizados ovários bovinos de animais de matadouro em diferentes fases do ciclo estral. O RNA total dos folículos e tecido ovarianos foi purificado por TRIZOL. As reações de RT-PCR foram realizadas com o "kit" SuperScriptTM First-Strand. Os produtos de PCR foram analisados em gel de agarose e as bandas submetidas à análise densitométrica. Todos os genes foram amplificados observando-se a curva exponencial de amplificação, a validação do método foi realizada através de análise de regressão, sendo estabelecido o coeficiente de amplificação (E). A expressão relativa de mRNA para cada gene de interesse foi calculada pela fórmula estabelecida por Prelle et al.12. Em todos os tecidos analisados, todos os genes foram expressos, sobressaltando-se diferenças nos diferentes ciclos estudados. Com relação os dados referentes ao coeficiente de amplificação (E), observou-se tanto para gene controle (GAPDH), como para o gene IGF-I concordância nos valores encontrados para as diferentes classes analisadas. Quanto ao gene IGF-I, a interpretação dos achados para a expressão relativa de mRNA pode está relacionada ao caráter constitutivo dessa proteína ou devido os transcritos não serem dependentes dos níveis de FSH. Observou-se diferenças na expressão relativa de mRNA de FSHR entre as classes de tecidos analisados, o que pode ser explicado pela variação do número de receptores nas células da granulosa nas diferentes fases do ciclo estral. Pode-se perceber a partir desse estudo que a técnica de RT-PCR semi quantitativo é de grande importância biotecnológica, possibilitando auxílio na compreensão da dinâmica folicular. Entretanto esses estudos devem ser ampliados com outros genes para melhor compreensão das etapas fisiológicas envolvidas na foliculogênese

Design, synthesis and pharmacological profile of new lead compounds of vasorelaxant drugs

Submitted by Luanna Matias ([email protected]) on 2015-03-25T18:13:46Z No. of bitstreams: 2 Tese - Francine Pazini - 2012.pdf: 20275833 bytes, checksum: 0e4126574caefa2cc2e136569a5f75bb (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5)Approved for entry into archive by Luanna Matias ([email protected]) on 2015-03-26T12:43:19Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Francine Pazini - 2012.pdf: 20275833 bytes, checksum: 0e4126574caefa2cc2e136569a5f75bb (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5)Made available in DSpace on 2015-03-26T12:43:19Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Francine Pazini - 2012.pdf: 20275833 bytes, checksum: 0e4126574caefa2cc2e136569a5f75bb (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2012-08-24Cardiovascular diseases are the leading cause of death worldwide, so the search for cardiotonic drugs more effective, safer and with lower side effects compared to currently available therapy, is of fundamental importance. Thus, we used in our design the phosphodiesterase 3 inhibitors, milrinone (13) and cilostazol (4), which show positive inotropic activity, relaxation effect and vasodilators. The new heterocyclic compounds (20a-20o) were originally designed by applying molecular hybridization strategy from these lead-compounds. The synthetic route to obtain the compounds 20a-20o resulted in overall yields ranging from 16.2 and 73.4%. During the synthesis, we used the Duff reaction conditions to formylation of N-phenylpyrazoles (1-phenyl-1H-pyrazole) (9a-o), which was an alternative synthetic methodology to classic Vilsmeier-Haack conditions. All the synthesized compounds were characterized by infrared and NMR spectroscopy combining the 1H, 13C, HSQC and HMBC correlation spectra. The compounds 20c, 20d, 20e, 20f and 20g, were evaluated for their relaxation profile of vascular smooth muscle. From this preliminary test, the 20d compound was selected to be further evaluated in pharmacological models, as provided better relaxation among this series of compounds in order to investigate the action mechanism. In these assays, 20d compound showed a relaxing activity in isolated arteries, potentiate by the presence of endothelium, with the participation of routes GCs/GMPc and AC/AMPc and where the flows of K+ and Ca2+through the membrane and the uptake of Ca2+ by the sarcoplasmic reticulum are important. Given the promising pharmacological profile of 20d compound, it was subjected to safety testing in preclinical in vitro model of the neutral red incorporation by cultures of 3T3 cells and acute oral toxicity tests. According to the International Organization for Economic Cooperation and Development (OECD) 423, the 20d compound was classified in 4 class, which shows that the compound was tolerated at a dose of 2000mg/kg orally. At the end of this work, we conclude that the design strategy employed has been validated, as the 20d compound showed a similar pharmacological profile to lead-compounds milrinone (13) and cilostazol (4). The pharmacological evaluation of all synthesized compounds in this work, will serve as a guide to establish the structure activity relationship of the series, and in turn, lead future changes on the chemical structures of the compounds for the activity cardiotonic optimization.As doenças cardiovasculares são a principal causa de morte no mundo, logo a busca de candidatos a protótipos de fármacos cardiotônicos que sejam mais efetivos, seguros e que apresentem menos efeitos colaterais quando comparados aos já disponíveis na terapêutica, é de fundamental importância. Neste contexto, foram empregados em nosso planejamento os protótipos inibidores de fosfodiesterase 3, milrinona (13) e cilostazol (4), que mostram atividade inotrópica e efeito vasodilatador. Os novos compostos heterociclos 5-(1-fenil-1H-pirazola-4-il)-2H-tetrazolas (20a-20o) foram originalmente desenhados através da estratégia de hibridação molecular a partir destes protótipos. A rota sintética eleita, composta por quatro etapas, para a obtenção dos compostos 5-(1- fenil-1H-pirazola-4-il)-2H-tetrazolas (20a-20o) resultou em rendimentos globais que variaram entre 16 e 73%. Inicialmente ocorreu uma reação de condensação entre as fenilhidrazinas 14a- 14o e 1,1,3,3 tetrametoxipropano, catalisada por ácido clorídrico, com formação dos intermediários 1-fenil-1H-pirazolas (16a-16o). Na sequência, os compostos 16a-16o foram submetidos a uma reação de formilação quimio e regioespecífica na posição 4 do anel pirazola. Os intermediários 1-fenil-1H-pirazola-4-carbaldeído (18a-18o) foram então submetidos a uma reação de condensação com cloridrato de hidroxilamina que desidratou in sito na presença de iodeto de potássio aos intermediários 1-fenil-1H-pirazola-4-carbonitrilas (19a-19o). Ao final, os compostos 19a-19o, através de um processo de cicloadição 1,3 bipolar, reagiram com azida de sódio formando os compostos desejados 20a-20o. A utilização das condições da reação Duff para a formilação de N-fenilpirazóis (1-fenil- 1H-pirazol) (9a-o), se mostrou uma metodologia sintética alternativa às condições clássicas de Vilsmeier-Haack. Todos os compostos sintetizados tiveram suas estruturas químicas elucidadas através das espectroscopias na região do infravermelho e ressonância magnética nuclear de 1H, 13C, HSQC e HMBC. Os compostos 5-[1-(4-fluorfenil)-1H-pirazola-4-il]-2H-tetrazola (20c), 5-[1-(3- fluorfenil)-1H-pirazola-4-il]-2H-tetrazola (20d), 5-[1-(4-clorofenil)-1H-pirazola-4-il]-2Htetrazola (20e), 5-[1-(3-nitrofenil)-1H-pirazola-4-il]-2H-tetrazola (20f) e 5-[1-(3-clorofenil)-1H-pirazola-4-il]-2H-tetrazola (20g), foram avaliados quanto ao seu perfil de relaxamento do músculo liso vascular. A partir deste ensaio preliminar, o composto 5-[1-(3-fluorfenil)-1Hpirazola- 4-il]-2H-tetrazola (20d) foi selecionado para ser avaliado em modelos farmacológicos complementares, uma vez que apresentou melhor perfil de relaxamento dentre esta série de compostos, a fim de investigar seu mecanismo de ação. Nestes ensaios, o composto 20d mostrou uma ação relaxante em artérias isoladas, potencializada pelo endotélio, com participação das vias GCs/GMPc e AC/AMPc e onde os fluxos de K+ e Ca2+ através da membrana e a captação de Ca2+ pelo retículo sarcoplasmático são importantes. Face ao perfil farmacológico promissor do composto 5-[1-(3-fluorfenil)-1H-pirazola-4- il]-2H-tetrazola (20d), o mesmo foi submetido aos ensaios de segurança pré-clínica no modelo in vitro de incorporação do vermelho neutro com culturas de células 3T3 e a toxicidade oral aguda em modelo in vivo. Segundo o protocolo internacional Organization for Economic Cooperation and Development (OECD) 423 o composto 20d foi classificado na classe 4, que mostra que o composto foi bem tolerado na dose de 2000 mg/kg por via oral. Ao término deste trabalho, podemos concluir que a estratégia de planejamento empregada no mesmo foi validada, uma vez que o composto 5-[1-(3-fluorfenil)-1H-pirazola- 4-il]-2H-tetrazola (20d) apresentou um perfil farmacológico vasodilatador com prováveis ações cardioativas. A avaliação farmacológica completa, incluindo experimentos com a enzima fosfodiesterase 3, de todos os compostos sintetizados neste trabalho servirá de guia para se estabelecer a relação estrutura atividade da série, e por sua vez, conduzir as futuras modificações sobre as estruturas químicas dos compostos visando à otimização da atividade cardiotônica

AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES ANTINOCICEPTIVA E ANTI-INFLAMATÓRIA DE LQFM-012

Introdução e objetivos: A alta utilização de analgésicos e anti-inflamatórios pela população justifica a busca por novos fármacos que possuam melhor eficácia e menores reações adversas. O objetivo deste trabalho foi avaliar a ação anti-inflamatória e antinociceptiva de LQFM-012. Metodologia: Avaliação farmacológica: contorções abdominais induzidas por ácido acético1, dor induzida pela formalina2,3, edema de pata induzido por carragenina4 e avaliação da inibição da enzima fosfolipase A2 in vitro 5. Os resultados foram expressos em média ± erro padrão da média relativos ao grupo controle. As diferenças foram detectadas por Anova com Student-Newman-Keuls ou Bonferroni. Trabalho aprovado pelo CEP/UFG (017/13). Resultados e discussões: Os tratamentos com LQFM-012 (35, 70 e 140μmol/Kg) reduziram as contorções de 81,56±2,20 para 75,70±2,07, 67,36±3,68 e 52,78±2,10. A Indometacina 28μmol/Kg reduziu para 58,43±4,84; Na primeira fase do teste da formalina, LQFM-012 140μmol/Kg e Morfina 36μmol/Kg reduziram o tempo de lambida (segundos) de 70,92±3,14s para 51,89±4,43s e 3,0±2,51s. Na segunda fase, LQFM-012, Indometacina e Morfina reduziram o tempo de lambida de 224,80±17,25s para 123,90±15,75s, 121,30±15,85s e 8,40±8,40s; Duas horas após a aplicação da carragenina, LQFM-012 70μmol/Kg e Indometacina reduziram o edema de 66,46±7,24 para 42,56±2,90 e 31,53±3,02. Após três horas, a redução foi de 64,66±4,64 para 40,68±3,93 e 30,63±4,46. Após quatro horas, a redução foi de 59,00±8,45 para 36,83±4,46 e 23,21±4,02, respectivamente. Duas concentrações de LQFM-012 (6,24 e 12,48 μmol/mL) promoveram redução de 25,80% e 47,90% na atividade da fosfolipase A2 após cinco minutos. Após sete minutos e meio, essa redução foi de 22,40% e 50%. Conclusão: O composto LQFM-012 apresentou atividade anti-inflamatória, e também, ação antinociceptiva com envolvimento de mecanismos centrais e periféricos. Agradecimentos: a UEG pelo auxílio financeiro e a UFG pelo auxílio nos procedimentos experimentais

Relative expression of insulin like growth factor I (IGFI) and follicle stimulating hormone receptor (FSHR) in follicles and ovarian tissue from Bos primigenius indicus (Nelore)

O aperfeiçoamento das técnicas que objetivam a exploração do potencial reprodutivo das fêmeas requer a compreensão mais ampla dos mecanismos de controle de desenvolvimento folicular. Uma alternativa de estudo nesta esfera, é a quantificação da expressão relativa de genes envolvidos nos processos de recrutamento, seleção e desenvolvimento folicular, pelo emprego da técnica de transcrição - reversa associado a reação em cadeia pela polimerase (RT - PCR). O presente trabalho objetivou quantificar a expressão relativa dos genes insulin-like growth factor I (IGF-I) e do receptor do hormônio folículo estimulante (FSHR), tendo como controle interno o gene da gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH). Foram utilizados ovários bovinos de animais de matadouro em diferentes fases do ciclo estral. O RNA total dos folículos e tecido ovarianos foi purificado por TRIZOL. As reações de RT-PCR foram realizadas com o kit SuperScriptTM First-Strand. Os produtos de PCR foram analisados em gel de agarose e as bandas submetidas à análise densitométrica. Todos os genes foram amplificados observando-se a curva exponencial de amplificação, a validação do método foi realizada através de análise de regressão, sendo estabelecido o coeficiente de amplificação (E). A expressão relativa de mRNA para cada gene de interesse foi calculada pela fórmula estabelecida por Prelle et al.12. em todos os tecidos analisados, todos os genes foram expressos, sobressaltando-se diferenças nos diferentes ciclos estudados. Com relação os dados referentes ao coeficiente de amplificação (E), observou-se tanto para gene controle (GAPDH), como para o gene IGF-I concordância nos valores encontrados para as diferentes classes analisadas. Quanto ao gene IGF-I, a interpretação dos achados para a expressão relativa de mRNA pode está relacionada ao caráter constitutivo dessa proteína ou devido os transcritos não serem dependentes dos níveis de FSH. Observou-se diferenças na expressão relativa de mRNA de FSHR entre as classes de tecidos analisados, o que pode ser explicado pela variação do número de receptores nas células da granulosa nas diferentes fases do ciclo estral. Pode-se perceber a partir desse estudo que a técnica de RT-PCR semi quantitativo é de grande importância biotecnológica, possibilitando auxílio na compreensão da dinâmica folicular. Entretanto esses estudos devem ser ampliados com outros genes para melhor compreensão das etapas fisiológicas envolvidas na foliculogênese.The improvement of techniques to maximize reproductive potential of females needs the whole comprehension of the controlling mechanisms of follicular development. An alternative for this purpose is the quantification of relative gene expression from those genes involved in recruitment, selection and follicular development, using reverse transcriptase - polymerase chain reaction (RT - PCR). The present study aimed to quantify relative gene expression from insulin-like growth factor I (IGF-I) and follicle stimulating hormone receptor (FSHR) in cattle (Bos primigenius indicus), using as internal control the gliceraldheyde 3 phosphate dehydrogenase (GAPDH) gene. Ovaries in different estral cycle stages were obtained from slaughtered animals. Total RNA from follicles and ovarian tissue was purified and the RT-PCR conditions were standardized. PCR products were analyzed in ethydium bromide agarose gels and the bands submitted to densitometric analysis. Exponential amplification curves were constructed and the method's validation was performed using regression analysis to determine the amplification coefficient (E) for each of the three genes. Relative expression for each gene was calculated using the formula described by Prelle et al.12. In every sample there was gene expression detected for each gene showing differences related to cycle temperature. Amplification coefficient (E) was similar between control gene (GAPDH) and IGFI, independently of the class analyzed. IGFI linear amplification could be related to the constitutive characteristic of this protein since the transcripts are not dependents of FSH levels. It was observed difference in FSHR mRNA expression between the classes analyzed. It could be due to the variation of the receptor number in granulosa cells for each different phase of estral cycle. Semi-quantitative RT-PCR has a large application in biotechnology since it is useful to help us the better understanding of follicular dynamics. However these studies must be conducted using other genes in order to provide new clues for the physiology of folliculogenesis.Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP

Synthesis, docking studies, pharmacological activity and toxicity of a novel pyrazole derivative (LQFM 021) - possible effects on phosphodiesterase

Submitted by Liliane Ferreira ([email protected]) on 2018-08-23T13:40:13Z No. of bitstreams: 2 Artigo - Daniella Ramos Martins - 2013.pdf: 1568399 bytes, checksum: 5c6f84859e286fa8622ce63354ca2ed5 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5)Rejected by Luciana Ferreira ([email protected]), reason: Olhe a citação: MARTINS, Daniella Ramos et al. Synthesis, docking studies, pharmacological activity and toxicity of a novel pyrazole derivative (LQFM 021)-possible effects on phosphodiesterase. Chemical and Pharmaceutical Bulletin, Tokyo, v. 61, n. 5, p. 524-531, May, 2013. Não há vírgula depois do mês. on 2018-08-24T12:44:20Z (GMT)Submitted by Liliane Ferreira ([email protected]) on 2018-08-24T14:14:42Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 9 bytes, checksum: 42dd12a06de379d3ffa39b67dc9c7aff (MD5) Artigo - Daniella Ramos Martins - 2013.pdf: 1568399 bytes, checksum: 5c6f84859e286fa8622ce63354ca2ed5 (MD5)Approved for entry into archive by Luciana Ferreira ([email protected]) on 2018-08-27T11:23:32Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 9 bytes, checksum: 42dd12a06de379d3ffa39b67dc9c7aff (MD5) Artigo - Daniella Ramos Martins - 2013.pdf: 1568399 bytes, checksum: 5c6f84859e286fa8622ce63354ca2ed5 (MD5)Made available in DSpace on 2018-08-27T11:23:32Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 9 bytes, checksum: 42dd12a06de379d3ffa39b67dc9c7aff (MD5) Artigo - Daniella Ramos Martins - 2013.pdf: 1568399 bytes, checksum: 5c6f84859e286fa8622ce63354ca2ed5 (MD5) Previous issue date: 2013-05This study describes the synthetic route and molecular computational docking of LQFM 021, as well as examines its biological effects and toxicity. The docking studies revealed strong interaction of LQFM 021 to phosphodiesterase-3 (PDE-3). In isolated arteries, the presence of endothelium potentiates the relaxation for LQFM 021 and the inhibition cyclic nucleotides reduced the relaxation. Pre-contraction with KCl (45 mm), the treatment with tetraethylammonium (TEA) (5 mm) and inhibition of reticular Ca2+-ATPase showed an inhibitory effect on relaxation. Moreover, the compound reduced the contraction evoked by the Ca2+ influx. Acute toxicity tests revealed that the compound was practically nontoxic. In conclusion, this study showed that a new synthetic derivative of pyrazole is a possible PDE-3 inhibitor and has vasorelaxant activity and low toxicit