Hepatic Lysosomal Acid Lipase and lipophagy in the progression of NAFLD

Lysosomal Acid Lipase (LAL) is an acidic enzyme that degrades cholesterol-ester and triglyceride inside lysosomes. Both genetic LAL deficiency and non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) are featured by lipid accumulation in hepatocyte leading to steatosis and eventually liver failure. Recently, a deficit in blood LAL activity was found in NAFLD patient (1). Lipophagy plays a pivotal role in degradation of lipids in the liver and consists in autophagic sequestration of lipid droplets and their degradation inside lysosomes by LAL (2). p62 serves as an autophagy/lipophagy receptor for selective autophagy and accumulates when the autophagy is blocked. We aimed to evaluate the hepatic expression of LAL in NAFLD patients and healthy subjects and to verify its association with histopathological features. Furthermore, we aimed to compare LAL levels with autophagic flux and lysosomal compartment status (LAMP1-positive vesicles). LAL expression was reduced in NAFLD patients with respect to healthy subjects (

BC1-FMRP interaction is modulated by 2′-O-methylation: RNA-binding activity of the tudor domain and translational regulation at synapses

The brain cytoplasmic RNA, BC1, is a small non-coding RNA that is found in different RNP particles, some of which are involved in translational control. One component of BC1-containing RNP complexes is the fragile X mental retardation protein (FMRP) that is implicated in translational repression. Peptide mapping and computational simulations show that the tudor domain of FMRP makes specific contacts to BC1 RNA. Endogenous BC1 RNA is 2′-O-methylated in nucleotides that contact the FMRP interface, and methylation can affect this interaction. In the cell body BC1 2′-O-methylations are present in both the nucleus and the cytoplasm, but they are virtually absent at synapses where the FMRP–BC1–mRNA complex exerts its function. These results strongly suggest that subcellular region-specific modifications of BC1 affect the binding to FMRP and the interaction with its mRNA targets. We finally show that BC1 RNA has an important role in translation of certain mRNAs associated to FMRP. All together these findings provide further insights into the translational regulation by the FMRP–BC1 complex at synapses

Molecular and histological traits of reduced lysosomal acid lipase activity in the fatty liver

Recent studies demonstrated reduced blood lysosomal acid lipase (LAL) activity in patients with nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD). We aimed to verify hepatic LAL protein content and activity in in vitro and in vivo models of fat overload and in NAFLD patients. LAL protein content and activity were firstly evaluated in Huh7 cells exposed to high-glucose/high-lipid (HGHL) medium and in the liver of C57BL/6 mice fed with high-fat diet (HFD) for 4 and 8 months. LAL protein was also evaluated by immunohistochemistry in liver biopsies from 87 NAFLD patients and 10 controls, and correlated with hepatic histology. Huh7 cells treated with HGHL medium showed a significant reduction of LAL activity, which was consistent with reduced LAL protein levels by western blotting using an antibody towards the N-term of the enzyme. Conversely, antibodies towards the C-term of the enzyme evidenced LAL accumulation, suggesting a post-translational modification that masks the LAL N-term epitope and affects enzymatic activity. Indeed, we found a high rate of ubiquitination and extra-lysosomal localization of LAL protein in cells treated with HGHL medium. Consistent with these findings, inhibition of proteasome triggered dysfunctional LAL accumulation and affected LAL activity. Accumulation of ubiquitinated/dysfunctional LAL was also found in the liver of HFD fed mice. In NAFLD patients, hepatic levels of non-ubiquitinated/functional LAL were lower than in controls and inversely correlated with disease activity and some of the hallmarks of reduced LAL. Fat overload leads to LAL ubiquitination and impairs its function, possibly reducing hepatic fat disposal and promoting NAFLD activity

Human neural stem cell transplantation in ALS: initial results from a phase I trial

We report the initial results from a phase I clinical trial for ALS. We transplanted GMP-grade, fetal human neural stem cells from natural in utero death (hNSCs) into the anterior horns of the spinal cord to test for the safety of both cells and neurosurgical procedures in these patients. The trial was approved by the Istituto Superiore di Sanit\ue0 and the competent Ethics Committees and was monitored by an external Safety Board

Clinical, pathological and PAM50 gene expression features of HER2-low breast cancer

Novel antibody-drug conjugates against HER2 are showing high activity in HER2-negative breast cancer (BC) with low HER2 expression (i.e., 1+ or 2+ and lack of ERBB2 amplification). However, the clinical and molecular features of HER2-low BC are yet to be elucidated. Here, we collected retrospective clinicopathological and PAM50 data from 3,689 patients with HER2-negative disease and made the following observations. First, the proportion of HER2-low was higher in HR-positive disease (65.4%) than triple-negative BC (TNBC, 36.6%). Second, within HR-positive disease, ERBB2 and luminal-related genes were more expressed in HER2-low than HER2 0. In contrast, no gene was found differentially expressed in TNBC according to HER2 expression. Third, within HER2-low, ERBB2 levels were higher in HR-positive disease than TNBC. Fourth, HER2-low was not associated with overall survival in HR-positive disease and TNBC. Finally, the reproducibility of HER2-low among pathologists was suboptimal. This study emphasizes the large biological heterogeneity of HER2-low BC, and the need to implement reproducible and sensitive assays to measure low HER2 expression

Limitations in predicting PAM50 intrinsic subtype and risk of relapse score with Ki67 in estrogen receptor-positive HER2-negative breast cancer

PAM50/Prosigna gene expression-based assay identifies three categorical risk of relapse groups (ROR-low, ROR-intermediate and ROR-high) in post-menopausal patients with estrogen receptor estrogen receptor-positive (ER+)/ HER2-negative (HER2-) early breast cancer. Low risk patients might not need adjuvant chemotherapy since their risk of distant relapse at 10-years is below 10% with endocrine therapy only. In this study, 517 consecutive patients with ER+/HER2- and node-negative disease were evaluated for Ki67 and Prosigna. Most of Luminal A tumors (65.6%) and ROR-low tumors (70.9%) had low Ki67 values (0-10%); however, the percentage of patients with ROR-medium or ROR-high disease within the Ki67 0-10% group was 42.7% (with tumor sizes ≤2 cm) and 33.9% (with tumor sizes > 2 cm). Finally, we found that the optimal Ki67 cutoff for identifying Luminal A or ROR-low tumors was 14%. Ki67 as a surrogate biomarker in identifying Prosigna low-risk outcome patients or Luminal A disease in the clinical setting is unreliable. In the absence of a well-validated prognostic gene expression-based assay, the optimal Ki67 cutoff for identifying low-risk outcome patients or Luminal A disease remains at 14%

Dendritic LSm1/CBP80-mRNPs mark the early steps of transport commitment and translational control

Messenger RNA (mRNA) transport to neuronal dendrites is crucial for synaptic plasticity, but little is known of assembly or translational regulation of dendritic messenger ribonucleoproteins (mRNPs). Here we characterize a novel mRNP complex that is found in neuronal dendrites throughout the central nervous system and in some axonal processes of the spinal cord. The complex is characterized by the LSm1 protein, which so far has been implicated in mRNA degradation in nonneuronal cells. In brain, it associates with intact mRNAs. Interestingly, the LSm1-mRNPs contain the cap-binding protein CBP80 that associates with (pre)mRNAs in the nucleus, suggesting that the dendritic LSm1 complex has been assembled in the nucleus. In support of this notion, neuronal LSm1 is partially nuclear and inhibition of mRNA synthesis increases its nuclear localization. Importantly, CBP80 is also present in the dendrites and both LSm1 and CBP80 shift significantly into the spines upon stimulation of glutamergic receptors, suggesting that these mRNPs are translationally activated and contribute to the regulated local protein synthesis

A new mechanism for regulating mRNA translation in the mammalian CNS:

Abstract tesi PhD Dr. Zalfa Francesca A new mechanism for regulating mRNA translation in the mammalian CNS: a role for the Fragile X Mental Retardation Protein FMRP (Fragile X Mental Retardation Protein) è una proteina che lega gli RNA altamente espressa nel cervello. L’assenza o la mutazione di FMRP causa la sindrome dell’X fragile, una disfunzione dominante legata al cromosoma X e la più frequente causa di ritardo mentale ereditario (con un’incidenza di 1 su 4000 maschi e di 1 su 6000 femmine). Utilizzando il modello murino della sindrome dell’X Fragile (il topo FMR1 knock-out), ho mostrato che FMRP è un repressore della traduzione in vivo e regola la traduzione di specifici mRNA dendritici e sinaptici, inclusi quelli codificanti le proteine del citoscheletro Arc/Arg3.1, MAP1B e la subunità alfa della chinasi calcio-calmodulina dipendente di tipo II (a-CaMKII). FMRP si associa non solo con questi mRNA bersaglio ma anche con il piccolo RNA dendritico e non tradotto BC1. Il blocco di BC1 inibisce l’interazione di FMRP con i suoi mRNA bersaglio. Inoltre, BC1 si lega direttamente a FMRP e può anche associarsi, in assenza di altre proteine, con gli mRNA regolati traduzionalmente da FMRP. Questo suggerisce un meccanismo di azione in cui la specificità della repressione traduzionale di FMRP è determinata dall’interazione diretta per appaiamento di basi tra BC1 a e gli mRNA da essa regolati. Quindi, quando FMRP non è presente, l’assenza della repressione traduzionale di specifici mRNA alle sinapsi può risultare nelle disfunzioni sinaptiche osservate nei pazienti affetti dalla sindrome dell’X Fragile. Una fine analisi dell’interazione tra la proteina FMRP e l’RNA BC1, condotta tramite esperimenti EMSA, ha permesso di definire che il dominio N-terminale di FMRP si lega direttamente e specificamente all’RNA BC1 (Kdapp= 260 nM). È interessante notare che questo dominio non contiene nessun motivo precedentemente identificato di legame all’RNA, per cui rappresenta a tutti gli effetti un nuovo motivo di legame all’RNA. Inoltre, è stato dimostrato che il legame tra FMRP e BC1 coinvolge la forcina all’estremità 5’ di BC1, una regione che mostra interessanti complementarietà di sequenza con diversi mRNA target di FMRP. Questi risultati dimostrano che il dominio N-terminale di FMRP contiene un nuovo motivo capace di legare specificamente l’RNA e suggerisce che questa regione possa essere coinvolta nella formazione e/o nella stabilizzazione dei duplex BC1-mRNA. Infine, anche l’analogo umano di BC1, chiamato BC200, fa parte del complesso ribonucleoproteico di FMRP umana ed è in grado di legarsi direttamente e specificamente a FMRP in corrispondenza del dominio N-terminale (Kdapp = 360 nM). Questo suggerisce che i due piccoli RNA abbiano lo stesso significato funzionale nelle cellule neuronali, contribuendo ad un più alto livello di regolazione di importanti processi biologici come la regolazione della traduzione dipendente da FMRP a livello delle sinapsi.Abstract PhD thesis Dr. Zalfa Francesca A new mechanism for regulating mRNA translation in the mammalian CNS: a role for the Fragile X Mental Retardation Protein FMRP (Fragile X Mental Retardation Protein) is an RNA binding protein highly expressed in the brain. Absence or mutation of FMRP leads to the Fragile X syndrome, an X-linked dominant disorder and the most frequent cause of inherited mental retardation (with an incidence of 1:4000 male and 1:6000 female). Using the mouse model of Fragile X syndrome (the FMR1 knock-out mouse), I showed that FMRP is a repressor of translation in vivo and regulates translation of specific dendritic and synaptic mRNAs, including those encoding the cytoskeletal proteins Arc/Arg3.1 and MAP1B and the kinase alpha-CaMKII. Interestingly, FMRP associates not only with these target mRNAs, but also with the dendritic, non-translatable small RNA BC1. Blocking of BC1 inhibits the interaction of FMRP with its target mRNAs. Furthermore, BC1 binds directly to FMRP and can also associate, in the absence of any protein, with the mRNAs regulated by FMRP. This suggests a mechanism where the specificity of FMRP translational repression is defined through base-pairing interactions of the associated BC1 with the mRNAs by linking the regulated mRNAs and FMRP. Thus, when FMRP is not present, loss of translational repression of specific mRNAs at synapses could result in synaptic dysfunction phenotype of Fragile X patients. A fine analysis of the BC1-FMRP interaction by EMSA experiments have pointed out that the N-terminal domain of FMRP binds directly and specifically to the BC1 RNA (Kdapp = 260 nM). Interestingly, the N-terminus of FMRP contains no previously identified motifs for specific RNA recognition, thus constitutes a new RNA binding motif to all intents and purposes. We further demonstrate that FMRP recognition involves the 5' stem-loop of BC1, a region which exhibits complementarity to several FMRP target mRNAs. These results demonstrate that the N-terminus contains a new motif capable of specific RNA binding and suggest that this region of FMRP may be involved in formation and/or stabilization of the BC1-mRNA duplex. Finally, also the human analogue of BC1 RNA, named BC200, is part of hFMRP complex and is able to bind directly and specifically to human FMRP (Kdapp = 360 nM) via the N-terminal domain, strengthening the idea that the two BC RNAs have the same functional significance in neuronal cells contributing to higher level of regulation of key biological processes like the FMRP-dependent local regulation of translation at synapses.Abstract dettagliato tesi PhD Dr. Francesca Zalfa A new mechanism for regulating mRNA translation in the mammalian CNS: a role for the Fragile X Mental Retardation Protein La proteina FMRP (Fragile X Mental Retardation Protein) codificata dal gene FMR1 è una proteina che lega gli RNA, altamente espressa nel cervello e nelle gonadi. L’assenza di FMRP porta alla sindrome dell’X Fragile, una malattia dominante legata all’X e la più frequente causa di ritardo mentale ereditario. Oltre al ritardo mentale la sindrome è anche caratterizzata da macroorchidismo nei maschi in età post-pubertale, dismorfie del volto, anomalie del tessuto connettivo e, dal punto di vista comportamentale, anche da iperattività e comportamento simil-autistico. Nella maggior parte dei casi (99%) l’assenza di FMRP è causata dall’espansione di una tripletta CGG polimorfica posta nella regione 5’UTR del gene FMR1. L’espansione oltre le 200 volte di questa tripletta (condizione detta di “mutazione piena” o “full mutation”) porta all’iper-metilazione della isole CG a monte del promotore con successivo silenziamento trascrizionale del gene FMR1 e assenza della proteina FMRP (per una recente review vedi Zalfa and Bagni, 2004). FMRP è in grado di legare il 4% degli mRNAs neuronali e nel citoplasma neuronale forma un esteso network di interazioni con alcune proteine note e con i suoi mRNAs target formando un grande complesso ribonucleoproteico che è in grado di agire come repressore traduzionale in vitro (Li et al., 2001; Laggerbauer et al., 2001). Questi dati in vitro hanno fatto ipotizzare che FMRP nei neuroni (le cellule che esprimono a più alti livelli la proteina e anche quelle più direttamente colpite dalla sua assenza) svolgesse un importante ruolo nella regolazione di una classe di mRNAs che vengono trasportati dal corpo cellulare dei neuroni fino alle sinapsi e qui localmente tradotti. La sintesi proteica di questi RNA messaggeri alle sinapsi è un meccanismo molecolare molto importante che sta alla base di importanti processi quali la sinaptogenesi (la formazione delle sinapsi) e la plasticità sinaptica e che contribuisce ad orchestrare i processi di apprendimento e di memorizzazione (per una recente review, vedi Wang and Tiedge, 2004). A conferma di questo putativo ruolo di FMRP alle sinapsi, l’unica anomalia morfologica presente nel cervello di pazienti affetti dalla Sindrome dell’X Fragile, come anche nel cervello di topi mancanti del gene FMR1 (FMR1 knockout; Bakker et al., 1994), è la presenza di un alto numero di spine dendritiche molto allungate e sottili con una morfologia tipicamente immatura (Irwin et al., 2001; Nimchinsky et al., 2001). Comunque, fino a pochi anni fa non era ancora noto quale ruolo svolgesse la proteina FMRP dei neuroni del CNS di mammifero e lo specifico meccanismo molecolare attraverso il quale FMRP riconoscesse i propri mRNAs bersaglio. Nella prima fase del mio lavoro di dottorato, utilizzando la tecnica dell’analisi polisomiale su estratti citoplasmatici di cervello di topo, è stata valutata l’efficienza traduzionale di alcuni RNA messaggeri neuronali, importanti per la struttura e la funzione delle sinapsi, in presenza o in assenza di FMRP (cioè in topi wildtype o knockout per il gene FMR1). In questo modo è stato dimostrato che FMRP è un repressore della traduzione anche in vivo e che regola la traduzione di specifici mRNA neuronali (Zalfa et al., 2003). Allo scopo di studiare la funzione di FMRP alle sinapsi, la stessa tecnica è stata applicata a preparazioni di terminali sinaptici purificati (chiamati sinaptoneurosomi; Bagni et al., 2000). Anche alle sinapsi FMRP è un repressore traduzionale la cui azione è più forte e più marcata rispetto al cervello totale. E’ interessante notare che la repressione traduzionale di FMRP agisce specificamente solo su un gruppo di mRNAs dendritici codificanti proteine regolatorie chiave per la sinapsi come Arc/Arg3.1, MAP1B and a-CaMKII. Questo spiega come la mancanza di FMRP può avere effetto sulle funzioni sinaptiche. Anche il meccanismo con cui FMRP inibisce la traduzione dei sui RNA messaggeri bersaglio è completamente nuovo: FMRP è stata trovata far parte di un complesso ribonucleoproteico che contiene un piccolo RNA dendritico, non tradotto chiamato BC1 (Zalfa et al., 2003). Noi abbiamo dimostrato tramite le tecniche dell’immunoprecipitazione e dell’Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA), che l’RNA BC1 è in grado di legarsi direttamente e specificamente sia a FMRP che ad alcuni RNA messaggeri regolati traduzionalmente da FMRP. Il blocco di BC1 tramite oligonucleotidi competitori inibisce l’interazione di FMRP con i suoi mRNA bersaglio. Questo suggerisce che la specificità della repressione traduzionale di FMRP sia definita attraverso diretto appaiamento di basi tra l’RNA BC1 e gli RNA regolati da FMRP (Zalfa et al., 2003). In accordo con i nostri dati, recentemente è stato dimostrato che BC1 è un repressore della traduzione in lisati di reticolociti di coniglio che è in grado di inibire la formazione del complesso di preinizio 48S (Wang et al., 2002) associandosi con due proteine chiave per la regolazione traduzionale, la Poly(A) Binding Protein (PABP) ed il fattore di inizio della traduzione eIF4A (Muddashetty et al., 2002; Wang et al., 2002). In questo senso, BC1 potrebbe agire in maniera simile ai micro RNAs (miRNAs) una classe di RNA non-codificanti molto piccoli (22 nt in media) che si appaiano in maniera non perfetta ai loro mRNA target e ne inibiscono la traduzione. A conferma di ciò, recentemente si è visto che FMRP in mammifero (come il suo omologo in Drosophila, dFXR; Caudy et al., 2002; Ishizuka et al., 2002) può legare micro-RNAs ed interagire con alcune proteine coinvolte nella biogenesi dei micro-RNAs come la esonucleasi DICER ed eIF2C2 (Jin et al., 2004). Durante la seconda fase del mio progetto di Dottorato ho condotto una analisi fine dell’interazione tra l’RNA BC1 e la proteina FMRP, allo scopo di comprendere meglio il significato funzionale di questo complesso nelle cellule neuronali di mammifero. Determinando la costante di dissociazione apparente (Kdapp) in esperimenti EMSA è stato possibile stimare che l’interazione tra BC1 e FMRP rientra in un range di interazioni proteina-RNA mediamente forti (Kdapp ~ 170 nM). Allo scopo di mappare il dominio di FMRP responsabile del legame a BC1 sono stati utilizzati in esperimenti EMSA diversi domini strutturati di FMRP prodotti in E. coli. In particolare ho testato l’intero dominio N-terminale (aa 1-217), due frammenti più piccoli dell’N-terminale (aa 1-134 e aa 1-180), il dominio KH1 (aa 205-280), il dominio KH2 (aa 281-422) e l’intero dominio C-terminale (aa 516-632). Questi esperimenti hanno permesso di evidenziare che l’RNA BC1 si lega fortemente (Kdapp ~ 260 nM) e specificamente alla regione N-terminale di FMRP. Questa regione non contiene nessun dominio canonico di legame all’RNA, ma in un recente articolo è stato dimostrato che questa regione di FMRP è in grado di legare specificamente omopolimeri di RNA in vitro (Adinolfi et al., 2003). Inoltre, utilizzando costrutti di delezione per BC1, abbiamo osservato che il riconoscimento di FMRP coinvolge l’estremità 5’ di questo RNA che si struttura come una lunga forcina. Un dato molto interessante è che questa regione di BC1 è la stessa regione che mostra complementarietà con gli mRNAs target di FMRP (Zalfa et al., 2003), suggerendo quindi che FMRP possa giocare un ruolo diretto nell’appaiamento BC1/mRNAs (Zalfa et al., submitted). In accordo con questi dati è stato recentemente dimostrato che FMRP ha molte caratteristiche proprie di uno chaperone degli acidi nucleici che è in grado di favorire e stabilizzare le interazioni RNA-RNA (Gabus et al., 2004). L’RNA BC1 è specifico dei roditori, ma nei primati e nell’uomo esiste un potenziale analogo di BC1, chiamato BC200. L’RNA BC200 è molto simile a BC1 per pattern di espressione, per distribuzione intra-neuronale e per putativa struttura secondaria, suggerendo un ruolo di questo piccolo RNA non-codificante nel trasporto e/o nella traduzione degli mRNAs dendritici. Noi abbiamo dimostrato che BC200, il quale presenta forti complementarità di sequenza con gli mRNA umani Arc, a-CaMKII e MAP1B (Zalfa et al., 2003), fa parte del complesso di FMRP in cellule neuronali umane ed è in grado di legarsi fortemente e direttamente al dominio N-terminale di FMRP umana (Kdapp ~ 360 nM). Questo suggerisce che questi due piccoli RNA non codificanti svolgano lo stesso ruolo funzionale nelle cellule neuronali murine e di mammifero rispettivamente, contribuendo ad un livello di regolazione di importanti processi biologici più alto, come la regolazione della traduzione dipendente da FMRP alle sinapsi. In conclusione, quando FMRP non è presente, la mancanza di repressione traduzionale di importanti proteine sinaptiche mediata dal complesso FMRP/BC200 può portare al fenotipo neuronale osservato nei pazienti affetti dalla sindrome dell’X Fragile. Inoltre, poiché le funzioni cerebrali come la capacità di apprendimento e la memoria dipendono dalla funzionalità sinaptica, i nostri dati suggeriscono fortemente che mutazioni nel dominio N-terminale di FMRP o nella forcina 5’ dell’RNA BC200 possano essere la causa di casi di Sindrome dell’X Fragile in cui la proteina FMRP è normalmente espressa (Clarke et al., 2004)

A new mechanism for regulating mRNA translation in the mammalian CNS:

Abstract tesi PhD Dr. Zalfa Francesca A new mechanism for regulating mRNA translation in the mammalian CNS: a role for the Fragile X Mental Retardation Protein FMRP (Fragile X Mental Retardation Protein) è una proteina che lega gli RNA altamente espressa nel cervello. L’assenza o la mutazione di FMRP causa la sindrome dell’X fragile, una disfunzione dominante legata al cromosoma X e la più frequente causa di ritardo mentale ereditario (con un’incidenza di 1 su 4000 maschi e di 1 su 6000 femmine). Utilizzando il modello murino della sindrome dell’X Fragile (il topo FMR1 knock-out), ho mostrato che FMRP è un repressore della traduzione in vivo e regola la traduzione di specifici mRNA dendritici e sinaptici, inclusi quelli codificanti le proteine del citoscheletro Arc/Arg3.1, MAP1B e la subunità alfa della chinasi calcio-calmodulina dipendente di tipo II (a-CaMKII). FMRP si associa non solo con questi mRNA bersaglio ma anche con il piccolo RNA dendritico e non tradotto BC1. Il blocco di BC1 inibisce l’interazione di FMRP con i suoi mRNA bersaglio. Inoltre, BC1 si lega direttamente a FMRP e può anche associarsi, in assenza di altre proteine, con gli mRNA regolati traduzionalmente da FMRP. Questo suggerisce un meccanismo di azione in cui la specificità della repressione traduzionale di FMRP è determinata dall’interazione diretta per appaiamento di basi tra BC1 a e gli mRNA da essa regolati. Quindi, quando FMRP non è presente, l’assenza della repressione traduzionale di specifici mRNA alle sinapsi può risultare nelle disfunzioni sinaptiche osservate nei pazienti affetti dalla sindrome dell’X Fragile. Una fine analisi dell’interazione tra la proteina FMRP e l’RNA BC1, condotta tramite esperimenti EMSA, ha permesso di definire che il dominio N-terminale di FMRP si lega direttamente e specificamente all’RNA BC1 (Kdapp= 260 nM). È interessante notare che questo dominio non contiene nessun motivo precedentemente identificato di legame all’RNA, per cui rappresenta a tutti gli effetti un nuovo motivo di legame all’RNA. Inoltre, è stato dimostrato che il legame tra FMRP e BC1 coinvolge la forcina all’estremità 5’ di BC1, una regione che mostra interessanti complementarietà di sequenza con diversi mRNA target di FMRP. Questi risultati dimostrano che il dominio N-terminale di FMRP contiene un nuovo motivo capace di legare specificamente l’RNA e suggerisce che questa regione possa essere coinvolta nella formazione e/o nella stabilizzazione dei duplex BC1-mRNA. Infine, anche l’analogo umano di BC1, chiamato BC200, fa parte del complesso ribonucleoproteico di FMRP umana ed è in grado di legarsi direttamente e specificamente a FMRP in corrispondenza del dominio N-terminale (Kdapp = 360 nM). Questo suggerisce che i due piccoli RNA abbiano lo stesso significato funzionale nelle cellule neuronali, contribuendo ad un più alto livello di regolazione di importanti processi biologici come la regolazione della traduzione dipendente da FMRP a livello delle sinapsi.Abstract PhD thesis Dr. Zalfa Francesca A new mechanism for regulating mRNA translation in the mammalian CNS: a role for the Fragile X Mental Retardation Protein FMRP (Fragile X Mental Retardation Protein) is an RNA binding protein highly expressed in the brain. Absence or mutation of FMRP leads to the Fragile X syndrome, an X-linked dominant disorder and the most frequent cause of inherited mental retardation (with an incidence of 1:4000 male and 1:6000 female). Using the mouse model of Fragile X syndrome (the FMR1 knock-out mouse), I showed that FMRP is a repressor of translation in vivo and regulates translation of specific dendritic and synaptic mRNAs, including those encoding the cytoskeletal proteins Arc/Arg3.1 and MAP1B and the kinase alpha-CaMKII. Interestingly, FMRP associates not only with these target mRNAs, but also with the dendritic, non-translatable small RNA BC1. Blocking of BC1 inhibits the interaction of FMRP with its target mRNAs. Furthermore, BC1 binds directly to FMRP and can also associate, in the absence of any protein, with the mRNAs regulated by FMRP. This suggests a mechanism where the specificity of FMRP translational repression is defined through base-pairing interactions of the associated BC1 with the mRNAs by linking the regulated mRNAs and FMRP. Thus, when FMRP is not present, loss of translational repression of specific mRNAs at synapses could result in synaptic dysfunction phenotype of Fragile X patients. A fine analysis of the BC1-FMRP interaction by EMSA experiments have pointed out that the N-terminal domain of FMRP binds directly and specifically to the BC1 RNA (Kdapp = 260 nM). Interestingly, the N-terminus of FMRP contains no previously identified motifs for specific RNA recognition, thus constitutes a new RNA binding motif to all intents and purposes. We further demonstrate that FMRP recognition involves the 5' stem-loop of BC1, a region which exhibits complementarity to several FMRP target mRNAs. These results demonstrate that the N-terminus contains a new motif capable of specific RNA binding and suggest that this region of FMRP may be involved in formation and/or stabilization of the BC1-mRNA duplex. Finally, also the human analogue of BC1 RNA, named BC200, is part of hFMRP complex and is able to bind directly and specifically to human FMRP (Kdapp = 360 nM) via the N-terminal domain, strengthening the idea that the two BC RNAs have the same functional significance in neuronal cells contributing to higher level of regulation of key biological processes like the FMRP-dependent local regulation of translation at synapses.Abstract dettagliato tesi PhD Dr. Francesca Zalfa A new mechanism for regulating mRNA translation in the mammalian CNS: a role for the Fragile X Mental Retardation Protein La proteina FMRP (Fragile X Mental Retardation Protein) codificata dal gene FMR1 è una proteina che lega gli RNA, altamente espressa nel cervello e nelle gonadi. L’assenza di FMRP porta alla sindrome dell’X Fragile, una malattia dominante legata all’X e la più frequente causa di ritardo mentale ereditario. Oltre al ritardo mentale la sindrome è anche caratterizzata da macroorchidismo nei maschi in età post-pubertale, dismorfie del volto, anomalie del tessuto connettivo e, dal punto di vista comportamentale, anche da iperattività e comportamento simil-autistico. Nella maggior parte dei casi (99%) l’assenza di FMRP è causata dall’espansione di una tripletta CGG polimorfica posta nella regione 5’UTR del gene FMR1. L’espansione oltre le 200 volte di questa tripletta (condizione detta di “mutazione piena” o “full mutation”) porta all’iper-metilazione della isole CG a monte del promotore con successivo silenziamento trascrizionale del gene FMR1 e assenza della proteina FMRP (per una recente review vedi Zalfa and Bagni, 2004). FMRP è in grado di legare il 4% degli mRNAs neuronali e nel citoplasma neuronale forma un esteso network di interazioni con alcune proteine note e con i suoi mRNAs target formando un grande complesso ribonucleoproteico che è in grado di agire come repressore traduzionale in vitro (Li et al., 2001; Laggerbauer et al., 2001). Questi dati in vitro hanno fatto ipotizzare che FMRP nei neuroni (le cellule che esprimono a più alti livelli la proteina e anche quelle più direttamente colpite dalla sua assenza) svolgesse un importante ruolo nella regolazione di una classe di mRNAs che vengono trasportati dal corpo cellulare dei neuroni fino alle sinapsi e qui localmente tradotti. La sintesi proteica di questi RNA messaggeri alle sinapsi è un meccanismo molecolare molto importante che sta alla base di importanti processi quali la sinaptogenesi (la formazione delle sinapsi) e la plasticità sinaptica e che contribuisce ad orchestrare i processi di apprendimento e di memorizzazione (per una recente review, vedi Wang and Tiedge, 2004). A conferma di questo putativo ruolo di FMRP alle sinapsi, l’unica anomalia morfologica presente nel cervello di pazienti affetti dalla Sindrome dell’X Fragile, come anche nel cervello di topi mancanti del gene FMR1 (FMR1 knockout; Bakker et al., 1994), è la presenza di un alto numero di spine dendritiche molto allungate e sottili con una morfologia tipicamente immatura (Irwin et al., 2001; Nimchinsky et al., 2001). Comunque, fino a pochi anni fa non era ancora noto quale ruolo svolgesse la proteina FMRP dei neuroni del CNS di mammifero e lo specifico meccanismo molecolare attraverso il quale FMRP riconoscesse i propri mRNAs bersaglio. Nella prima fase del mio lavoro di dottorato, utilizzando la tecnica dell’analisi polisomiale su estratti citoplasmatici di cervello di topo, è stata valutata l’efficienza traduzionale di alcuni RNA messaggeri neuronali, importanti per la struttura e la funzione delle sinapsi, in presenza o in assenza di FMRP (cioè in topi wildtype o knockout per il gene FMR1). In questo modo è stato dimostrato che FMRP è un repressore della traduzione anche in vivo e che regola la traduzione di specifici mRNA neuronali (Zalfa et al., 2003). Allo scopo di studiare la funzione di FMRP alle sinapsi, la stessa tecnica è stata applicata a preparazioni di terminali sinaptici purificati (chiamati sinaptoneurosomi; Bagni et al., 2000). Anche alle sinapsi FMRP è un repressore traduzionale la cui azione è più forte e più marcata rispetto al cervello totale. E’ interessante notare che la repressione traduzionale di FMRP agisce specificamente solo su un gruppo di mRNAs dendritici codificanti proteine regolatorie chiave per la sinapsi come Arc/Arg3.1, MAP1B and a-CaMKII. Questo spiega come la mancanza di FMRP può avere effetto sulle funzioni sinaptiche. Anche il meccanismo con cui FMRP inibisce la traduzione dei sui RNA messaggeri bersaglio è completamente nuovo: FMRP è stata trovata far parte di un complesso ribonucleoproteico che contiene un piccolo RNA dendritico, non tradotto chiamato BC1 (Zalfa et al., 2003). Noi abbiamo dimostrato tramite le tecniche dell’immunoprecipitazione e dell’Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA), che l’RNA BC1 è in grado di legarsi direttamente e specificamente sia a FMRP che ad alcuni RNA messaggeri regolati traduzionalmente da FMRP. Il blocco di BC1 tramite oligonucleotidi competitori inibisce l’interazione di FMRP con i suoi mRNA bersaglio. Questo suggerisce che la specificità della repressione traduzionale di FMRP sia definita attraverso diretto appaiamento di basi tra l’RNA BC1 e gli RNA regolati da FMRP (Zalfa et al., 2003). In accordo con i nostri dati, recentemente è stato dimostrato che BC1 è un repressore della traduzione in lisati di reticolociti di coniglio che è in grado di inibire la formazione del complesso di preinizio 48S (Wang et al., 2002) associandosi con due proteine chiave per la regolazione traduzionale, la Poly(A) Binding Protein (PABP) ed il fattore di inizio della traduzione eIF4A (Muddashetty et al., 2002; Wang et al., 2002). In questo senso, BC1 potrebbe agire in maniera simile ai micro RNAs (miRNAs) una classe di RNA non-codificanti molto piccoli (22 nt in media) che si appaiano in maniera non perfetta ai loro mRNA target e ne inibiscono la traduzione. A conferma di ciò, recentemente si è visto che FMRP in mammifero (come il suo omologo in Drosophila, dFXR; Caudy et al., 2002; Ishizuka et al., 2002) può legare micro-RNAs ed interagire con alcune proteine coinvolte nella biogenesi dei micro-RNAs come la esonucleasi DICER ed eIF2C2 (Jin et al., 2004). Durante la seconda fase del mio progetto di Dottorato ho condotto una analisi fine dell’interazione tra l’RNA BC1 e la proteina FMRP, allo scopo di comprendere meglio il significato funzionale di questo complesso nelle cellule neuronali di mammifero. Determinando la costante di dissociazione apparente (Kdapp) in esperimenti EMSA è stato possibile stimare che l’interazione tra BC1 e FMRP rientra in un range di interazioni proteina-RNA mediamente forti (Kdapp ~ 170 nM). Allo scopo di mappare il dominio di FMRP responsabile del legame a BC1 sono stati utilizzati in esperimenti EMSA diversi domini strutturati di FMRP prodotti in E. coli. In particolare ho testato l’intero dominio N-terminale (aa 1-217), due frammenti più piccoli dell’N-terminale (aa 1-134 e aa 1-180), il dominio KH1 (aa 205-280), il dominio KH2 (aa 281-422) e l’intero dominio C-terminale (aa 516-632). Questi esperimenti hanno permesso di evidenziare che l’RNA BC1 si lega fortemente (Kdapp ~ 260 nM) e specificamente alla regione N-terminale di FMRP. Questa regione non contiene nessun dominio canonico di legame all’RNA, ma in un recente articolo è stato dimostrato che questa regione di FMRP è in grado di legare specificamente omopolimeri di RNA in vitro (Adinolfi et al., 2003). Inoltre, utilizzando costrutti di delezione per BC1, abbiamo osservato che il riconoscimento di FMRP coinvolge l’estremità 5’ di questo RNA che si struttura come una lunga forcina. Un dato molto interessante è che questa regione di BC1 è la stessa regione che mostra complementarietà con gli mRNAs target di FMRP (Zalfa et al., 2003), suggerendo quindi che FMRP possa giocare un ruolo diretto nell’appaiamento BC1/mRNAs (Zalfa et al., submitted). In accordo con questi dati è stato recentemente dimostrato che FMRP ha molte caratteristiche proprie di uno chaperone degli acidi nucleici che è in grado di favorire e stabilizzare le interazioni RNA-RNA (Gabus et al., 2004). L’RNA BC1 è specifico dei roditori, ma nei primati e nell’uomo esiste un potenziale analogo di BC1, chiamato BC200. L’RNA BC200 è molto simile a BC1 per pattern di espressione, per distribuzione intra-neuronale e per putativa struttura secondaria, suggerendo un ruolo di questo piccolo RNA non-codificante nel trasporto e/o nella traduzione degli mRNAs dendritici. Noi abbiamo dimostrato che BC200, il quale presenta forti complementarità di sequenza con gli mRNA umani Arc, a-CaMKII e MAP1B (Zalfa et al., 2003), fa parte del complesso di FMRP in cellule neuronali umane ed è in grado di legarsi fortemente e direttamente al dominio N-terminale di FMRP umana (Kdapp ~ 360 nM). Questo suggerisce che questi due piccoli RNA non codificanti svolgano lo stesso ruolo funzionale nelle cellule neuronali murine e di mammifero rispettivamente, contribuendo ad un livello di regolazione di importanti processi biologici più alto, come la regolazione della traduzione dipendente da FMRP alle sinapsi. In conclusione, quando FMRP non è presente, la mancanza di repressione traduzionale di importanti proteine sinaptiche mediata dal complesso FMRP/BC200 può portare al fenotipo neuronale osservato nei pazienti affetti dalla sindrome dell’X Fragile. Inoltre, poiché le funzioni cerebrali come la capacità di apprendimento e la memoria dipendono dalla funzionalità sinaptica, i nostri dati suggeriscono fortemente che mutazioni nel dominio N-terminale di FMRP o nella forcina 5’ dell’RNA BC200 possano essere la causa di casi di Sindrome dell’X Fragile in cui la proteina FMRP è normalmente espressa (Clarke et al., 2004)

mRNPs, polysomes or granules: FMRP in neuronal protein synthesis

mRNA localization and regulated translation play central roles in neurite outgrowth and synaptic plasticity. A key molecule in these processes is the Fragile X mental retardation protein, FMRP, which is involved in the metabolism of neuronal mRNAs. Absence or mutation of FMRP leads to spine dysmorphogenesis and impairs synaptic plasticity. Studies that have mainly been performed on the mouse and Drosophila models for Fragile X Syndrome showed that FMRP is involved in translational regulation at synapses, but even 15 years after discovery of the FMR1 gene, the precise working mechanisms remain elusive.status: publishe