Isolation and characterization of a new serine proteases group with thrombinin-like and L-amino acid oxidase activity from Crotalus durissus cascavella

Orientador: Marcos Hikari ToyamaDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: O uso de toxinas isoladas de venenos como ferramentas moleculares na compreensão de diversos eventos fisiológicos e patológicos tem sido comprovadas por vários trabalhos na literatura. A serpente Crotalus durissus cascavella é encontrada nas áreas de caatinga do nordeste do Brasil, desde o Maranhão até norte do estado de Minas Gerais, e apesar de pouco estudada sua picada constitui um importante problema da saúde pública (Martins et al, 1998). A agregação platequetária é bem caracterizada para a convulxina isolada do veneno de Crotalus durissus cascavella e Crotalus durissus terrificus. O objetivo principal do projeto foi avaliar a atividade de agregação plaquetária induzida por outras frações biológicas e farmacologicamente importantes do veneno total de Cotalus durissus cascavella, que neste projeto foram a crotoxina e giroxina. Através de uma combinação de varias metodologias em HPLC como exclusão molecular, troca iônica e de fase reversa conseguimos isolar os principais constituintes da crotoxina (PLA2, crotapotina e as proteínas ¿trombina-like¿) e a L-aminoácido oxidase a partir da giroxina. Durante o fracionamento do veneno total em coluna de HPLC de exclusão molecular foram detectados dois picos de atividade serino protease, um na fração giroxínica e outro na fração crotoxínica, sendo que na fração crotoxínica encontrou-se uma nova protease até então não caracterizada e na fração giroxínica foram monitoradas a atividade L-aminácido oxidase. Através da cromatografia em HPLC de troca iônica em DEAE 5PW obteve-se a fração Laminoácido oxidase cujo grau de homogeneidade molecular foi confirmado por HPLC de fase reversa. Da fração crotoxínica foram obtidos três grupos principais de proteínas (PLA2, crotapotinas e proteases) e da fração proteolítica foram isoladas três isoformas principais denominadas de F201, F202 e F203, sendo a fração F202, a fração majoritária. F202 foi obtida com maior homegeneidade molecular com massa molecular de 28kDa e mostrou uma alta quantidade de ácido aspártico, ácido glutâmico e outros aminoácidos importantes como histidina, cisteína e lisina. Esta proteína mostrou alta especificidade para BApNA e mostrou um comportamento Michaelis-Menten com Vmáx estimado em 5,64 µM/min e um Km de 0,58mM para este substrato. Neste trabalho foi investigada a habilidade desta proteína em degradar fibrinogênio e observou-se que F202 clivou ambas as cadeias a e ß. A atividade enzimática assim como a agregação plaquetária foi inibida fortemente com a incubação com TLCK, um inibidor específico para serinoproteases. O N-terminal da seqüência de aminoácidos de F202 mostrou alta homologia com outras proteínas ¿trombina-like¿, mas foi significantemente diferente da ¿trombina-like¿ isolada da fração giroxina. Crotalus durissus cascavella apresenta uma fração menos estudada denominada giroxina que tem sido descrita como uma proteína ¿trombina-like¿ como relatado por Raw et al. (1986) e Alexander et al. (1988). Neste trabalho foi demonstrado que a giroxina é uma fração heterogênea composta de uma ¿trombina-like¿ e proteína LAO, a qual parece estar envolvida em várias atividadesAbstract: The use of the isolated toxins from poisons as molecular tools in the understanding of diverse physiological and pathological events has been proved by some works in literature. The serpent Crotalus durissus cascavella is found in the areas of Caatinga Northeast of Brazil, since Maranhão until North of the state of Minas Gerais, and in spite of it hasn¿t been studied a lot, its bite constitutes an important problem to the public health (Martins et al, 1998). The platelet aggregation is well characterized to the isolated convulxin of the poison of Crotalus durissus cascavella and Crotalus durissus terrificus. The main objective of the project was to evaluate the activity of platelet aggregation induced by gyroxin and crotoxin that are biological and pharmacological important fractions of the total poison of Cotalus durissus cascavella. Through a combination of various methodologies in HPLC -as molecular exclusion, ionic exchange and the reverse phase- we managed to isolate the main constituent of the crotoxin (PLA2, crotapotin and the thrombin-like proteins) and the L-amino acid oxidase from the gyroxin. During the fragmentation of the total poison in column of HPLC of molecular exclusion two peaks of serine protease were found: one in the gyroxin fraction and another one in the crotoxin fraction. In the crotoxin fraction a new protease in not characterized yet and in the gyroxin fraction was found the L-amino acid activity oxidase. Through the chromatography in HPLC of ionic exchange in DEAE 5PW that allowed to the attainment of the fraction L-amino acid oxidase whose degree of molecular homogeneity was confirmed by HPLC of reverse phase. From the crotoxin fraction three main groups of proteins (PLA2, crotapotin and proteases) were isolated, and from the named proteolyitic fraction three isoforms of F201, F202 and F203, noticing that the F202 fraction is the major one. The fraction F202 showed a high quantity of aspartic acid, glutamic acid and others amino acids very important as histidine, cysteine and lysine and so more molecular homogeneity could be obtained and with molecular mass of 28kDa. This protein whose behavior Michaelis-Menten with Vmáx measured in 5,64 µM/min and one Km de 0,58 mM to this substratum showed high specificity to BapNA. In this work was investigated the ability of this protein in degrading the fibrinogen and was observed that the F202 made the cleavage into both chains a and ß. The enzymatic activity as well as the platelet aggregation were strongly inhibited with the incubation with TLCK, a specific inhibitor to serine protease. The N-terminal of the amino acid sequence of F202 showed the high homology with other proteins thrombin-like, but it was significantly different from thrombin-like isolated fro m the gyroxin fraction. Crotalus durissus cascavella presents a fraction less studied named gyroxin that has been described as a protein thrombin-like as related by Raw et al. (1986) and Alexander et al. (1988). In this work was demonstrated that the gyroxin is a composed heterogeneous fraction of one thrombin-like and protein LAO, and this seems to be involved in some activitiesMestradoBioquimicaMestre em Biologia Funcional e Molecula

Determination of rutin and narcissin in marigold extract and topical formulations by liquid chromatography: applicability in skin penetration studies

A chromatographic technique for determination of rutin and narcissin in marigold extract and topical formulations was developed and validated. The method shows linearity over the concentration range of 0.2 - 6.0 μg/mL of rutin (r = 0.9986) and 0.8 - 12.0 μg/mL of narcissin (r = 0.9951). The values obtained for precision and accuracy are in agreement with ICH guidelines. Both the formulation excipients and the porcine ear skin samples did not interfere with the flavonoids determination. The recovery of rutin and narcissin in skin samples added with marigold extract was 81.41% and 83.35%, respectively, which demonstrate the applicability of this method to perform skin penetration studies.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP

Assessment of in vitro methodologies to determine topical and transdermal delivery of the flavonoid quercetin

To be effective against the oxidative damages induced by UVB irradiation in the skin, the drug needs to release from the formulation in which it was incorporated and reach the skin layers where the ROS are generated. Thus, it is very important the development of a robust and sensitive methodology to extract and quantify in different skin layers the antioxidant agent delivered from topical formulations. Therefore, in the present work suitable methods to extract and quantify quercetin in skin samples and receptor phase after in vitro penetration studies were developed. The results demonstrated that the recovery from two different layers of skin, the SC and [E+D], using two different methods of quantification (DPPH• assay and HPLC, respectively), was 93.8 % when the quercetin spiked dose was 50 µg/mL, 100.4 % when it was 100 µg/mL and 89.9 % for 250 µg/mL and the average recovery of the quercetin extraction from receptor phase when dichloromethane was used as extractor solvent was 96%. These results demonstrate that the described methods have a potential application to in vitro skin penetration studies of quercetin, since it showed to be accurate and sensitive.Para ser efetiva contra os danos oxidativos induzidos pela radiação UVB na pele, é necessário que o ativo seja liberado da formulação na qual foi incorporado e alcance as camadas da pele onde são geradas as EROS. Desta forma, torna-se de grande importância o desenvolvimento de métodos eficazes e sensíveis para extrair e quantificar, nas diferentes camadas de pele, o agente antioxidante liberado de formulações tópicas. No presente trabalho foram desenvolvidos métodos adequados para extrair e quantificar a quercetina em amostras de pele e na fase receptora após estudos de penetração cutânea in vitro. Os resultados demonstraram que a recuperação das camadas de pele, EC e [E+D], quando do uso de duas diferentes metodologias de quantificação (ensaio de DPPH• e CLAE, respectivamente), foi de 93,8 % quando aplicada uma dose de 50 µg/mL de quercetina, 100,4 % para 100 µg/mL e 89,9 % para 250 µg/mL e a recuperação média da extração da quercetina da fase receptora, quando do emprego de diclorometano como solvente extrator, foi de 96 %. Tais resultados demonstram que os métodos descritos têm grande potencial de aplicação em estudos de penetração in vitro já que apresentaram exatidão e sensibilidade.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP

Potências-limites no quotidiano da adesão à reabilitação de pessoas com lesão medular e suas famílias

Objective: to understand the strengths and limits in the daily life of the adherence to rehabilitation of people with spinal cord injury and their families. Method: an interpretive study of a qualitative nature, based on Comprehensive and Everyday Life Sociology, involving 21 participants, 12 individuals with spinal cord injury and 9 family members, in a Specialized Rehabilitation Center in southern Brazil. The sources of evidence were individual and collective interviews, adopting the strategy of workshops for data validation. The Atlas.ti software was used for data collation and organization. Data analysis involved the following stages: preliminary analysis, ordering, key links, coding, and categorization. Results: the following categories and subcategories were found: Strengths in the adherence to rehabilitation-welcoming and walking side by side; rehabilitation: a return to life; coexistence that brings the family together, as well as practicing faith. Limits on the adherence to rehabilitation-(d)efficiency of the health professionals in health care. Conclusion: rehabilitation was evidenced as a possibility of returning to life, which enables coexistence among equals and stimulates self-care and adaptation. The family rescues the desire to live, and faith is a mechanism of hope and optimism. It is noteworthy that the welcoming deficit in Primary Health Care and the scarcity of rehabilitation care services in the hospital determine the onset of avoidable complications, in addition to the lack of guidance and/or referrals, characterizing a gap in the Referral and Counter-Referral System.Objetivo: compreender as potências e os limites no quotidiano da adesão à reabilitação de pessoas com lesão medular e suas famílias. Método: estudo interpretativo de natureza qualitativa, fundamentado na Sociologia Compreensiva e do Quotidiano, envolvendo 21 participantes, sendo 12 pessoas com lesão medular e 09 familiares, em um Centro Especializado de Reabilitação no sul do Brasil. As fontes de evidências foram entrevistas individuais e coletivas, adotando-se, para estas, a estratégia de oficinas para validação dos dados. Para o agrupamento e organização dos dados, utilizou-se o software Atlas.ti. A análise dos dados envolveu: análise preliminar, ordenação, ligações-chave, codificação e categorização. Resultados: evidenciaram as categorias e subcategorias: Potências na adesão à reabilitação - acolher e caminhar junto; reabilitação: um retorno à vida; a convivência que aproxima a família, bem como praticar a fé. Limites na adesão à reabilitação - (d)eficiência dos profissionais de saúde no cuidado. Conclusão: evidenciou-se a reabilitação como uma possibilidade de retorno à vida, que possibilita a convivência entre iguais, estimula o autocuidado e a adaptação. A família resgata o querer viver, e a fé é um mecanismo de esperança e otimismo. Ressalta-se que o déficit de acolhimento na Atenção Primária à Saúde e a escassez de cuidados de reabilitação no âmbito hospitalar determinam o aparecimento de complicações evitáveis, além da falta da orientação e/ou encaminhamentos, caracterizando uma falha no Sistema de Referência e Contrarreferência.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Evaluation of the Potential of Brazilian Propolis against UV-Induced Oxidative Stress

This study investigated the potential use of topically and orally administered propolis extracts to prevent UV irradiation-induced oxidative stress in skin. The results illustrated that green propolis extract (GPE) contained greater amounts of polyphenols, coumaric acid, drupanin, baccharin and artepillin C than did brown propolis extract (BPE). GPE showed higher antioxidant activity than BPE when the IC50 (concentration that caused 50% inhibition) values were compared. Interesting, the oral treatment of hairless mice demonstrated a recovery of 30.0% for GPE and 22.8% for BPE with respect to UV irradiation-induced GSH depletion. The topical pretreatment of animals with both propolis extract solutions recovered around 14.0% of the depleted GSH. However, the employed treatments did not inhibit the increase of cutaneous proteinase secretion/activity caused by irradiation. These findings indicate that despite differences in composition and antioxidant properties, GPE and BPE both successfully prevent UV-induced GSH depletion in vivo and are both promising antioxidant systems against oxidative stress in skin. Based on these findings, complementary studies should be performed to enhance our understanding of the protective effects of propolis extracts in skin

Atendimento a infartados na emergência: a atuação da enfermagem baseada em protocolos

A presente revisão integrativa tem como objetivo analisar a aplicação de protocolos de atendimento a pacientes com infarto agudo do miocárdio, com foco na atuação da equipe de enfermagem. Inicialmente, na introdução, destaca-se a importância da assistência qualitativa e integralizada prestada pelos enfermeiros desde a entrada do paciente na unidade de pronto atendimento até sua recuperação. No referencial teórico, são abordados os desafios enfrentados pelos enfermeiros em ambientes de emergência, a necessidade de recursos humanos qualificados e a relevância da gestão adequada para manter a qualidade do serviço. A metodologia empregada foi a revisão integrativa de literatura, com busca em bases de dados no BVS e MEDLINE e critérios de inclusão e exclusão bem definidos. Os resultados obtidos demonstraram a existência de protocolos e diretrizes estabelecidos por organizações de saúde, visando melhorar o atendimento a pacientes com emergências cardíacas. Conclui-se que a implementação eficaz desses protocolos, aliada à atuação qualificada da equipe de enfermagem, é fundamental para garantir uma assistência de qualidade e melhores resultados para os pacientes com infarto agudo do miocárdio

Biometria dos órgãos linfoides e composição físico- química da carne de frangos de crescimento lento alimentados com bagaço de mandioca e complexo enzimático / Biometry of lymphoid organs and physical-chemical composition of meat of slow growth chickens fed with cassava bagasse and enzymatic complexes

Objetivou-se no presente trabalho avaliar a biometria dos órgãos linfoides e composição físico-química da carne de frangos de crescimento lento alimentados com bagaço de mandioca com e sem complexo enzimático fúngico. Foram utilizadas 250 aves, Pescoço Pelado Vermelho, com 90 dias de idade. O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado (DIC) em esquema fatorial (2 X 2 + 1), sendo dois níveis de inclusão do bagaço de mandioca (10 e 20%), presença e ausência do complexo enzimático e dieta controle, totalizando cinco tratamentos, cinco repetições e dez aves por unidade experimental. Foram avaliados a biometria dos órgãos linfoides (baço, bursa e timo), gordura abdominal, luminosidade (L*), coloração (a* e b*), pH, força de cisalhamento (FC), perda de peso por cozimento (PPCO), análises químicas e deposição de proteína e gordura da carne do peito. A inclusão de 10 e 20% do bagaço de mandioca com e sem complexo enzimático influenciaram (p<0,05) o peso relativo do baço e o parâmetro de cor (b*), não havendo efeito (p>0,05) sobre o peso da bursa e do timo, parâmetro de cor (a*), luminosidade (L*), pH, força de cisalhamento (FC), perda de peso por cozimento (PPCO), análises químicas, deposição de proteína e gordura da carne. Recomenda-se o uso de até 20% de bagaço de mandioca, não sendo opção tecnicamente viável a utilização do complexo enzimático fúngico, xilanase e amilase, nas dietas para frangos de crescimento lento.

Prevalência do subtipo molecular triplo negativo em pacientes com Câncer de Mama em hospital de referência da Amazônia / Prevalence of triple negative molecular subtype in patients with Breast Cancer in a reference hospital in the Amazônia

Introdução: O subtipo triplo negativo é conhecido por apresentar um comportamento agressivo e se refere a tumores que não expressam receptores de estrogênio, progesterona e HER2. Metodologia: É um estudo epidemiológico observacional, transversal e retrospectivo que abrange o período de 2010 a 2014. Foram analisados 1208 prontuários de pacientes com câncer de mama primário dispensados pelo Laboratório de Patologia da FCECON. A tabulação dos dados foi feita através do Microsoft® Office Excel 2013 e a análise foi conduzida através do software estatístico R versão 3.5.3 (R Core Team). Objetivos: Avaliar a frequência do subtipo triplo negativo e correlacionar com a idade, tipo histológico, estadiamento e tratamento inicial das pacientes com câncer de mama da FCECON-AM. Resultados: Dos prontuários analisados, 147 (12,2%) das mulheres possuiam subtipo triplo negativo, a idade das pacientes variou de 33 a 85 anos, com idade média de 53,6 ± 11,9 anos, mediana igual a 52 e a maioria das pacientes eram procedentes de Manaus (60%). No que concerne ao tipo histológico, o ductal foi o mais frequente(86,4%); em relação ao estadiamento clínico, os estádios IIA e IIIB foram os mais frequentes, com 25,9% e 27,2% respectivamente; sobre a abordagem terapêutica inicial, a mastectomia esteve presente em 57,8% dos casos. Conclusão: Conclui-se que a faixa etária de 41 a 48 anos foi a que mais apresentou o subtipo triplo negativo (23,8%). Além disso, o tratamento inicial mais frequente foi a mastectomia