Unraveling the antifungal activity of a newly discovered oligomer produced by an in vitro proteolytic pathway

Tese de mestrado, Microbiologia Aplicada, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2015Os fungos patogénicos representam, à escala mundial, uma séria ameaça para a saúde humana, tendo-se vindo a registar um aumento significativo de infeções fúngicas devido a fungos patogénicos oportunistas, o que as torna num fator importante de morbidade e mortalidade. Apesar de Candida albicans continuar a liderar as espécies de Candida causadoras de infeções da corrente sanguínea (ICS), nas últimas duas décadas tem ocorrido um desvio epidemiológico para um aumento de espécies de Candida "não-albicans". Infeções causadas por outras espécies de Candida têm vindo a aumentar, sendo responsáveis por mais de 90% das infeções fúngicas invasivas. De entre essas espécies, apenas C. glabrata pode ser verdadeiramente reconhecida como uma espécie emergente causadora de ICS, devido à sua resistência intrínseca e adquirida aos azóis e a outros agentes antifúngicos. Nenhuma das classes de antifúngicos atualmente disponíveis possui todas as características ideais de um agente antifúngico, o que, em última análise, conduz a falhas no tratamento. Como consequência, novas formulações de antifúngicos, combinações terapêuticas e o desenvolvimento de novos compostos bioativos podem ser úteis na obtenção de melhores resultados terapêuticos. As sementes de leguminosas são fontes bastante abundantes de proteínas, sendo o género Lupinus um dos mais ricos neste tipo de proteínas de reserva. As proteínas de reserva das sementes de leguminosas, classificadas como globulinas, compreendem duas famílias principais de proteínas: as vicilinas e as leguminas, que constituem aproximadamente 80% das proteínas totais das suas sementes, atuando não só como reservas de nutrientes durante a germinação, como também como proteínas de defesa para as plantas. A β-conglutina é a principal proteína de reserva nas sementes das espécies de Lupinus, sendo as suas subunidades sintetizadas durante o desenvolvimento cotiledonar de L. albus, a partir de um único polipéptido precursor glicosilado. Após a germinação, as subunidades da β-conglutina sofrem uma grande alteração na sua estrutura e concentração, levando ao aparecimento de um novo conjunto de polipéptidos. Recentemente, foi acidentalmente descoberto no nosso laboratório que a β-conglutina purificada de L. albus sofre, in vitro, um processo de proteólise. Após uma incubação de 7 dias a 25ºC, a β-conglutina sofre uma degradação controlada originando um oligómero estável e com atividade antifúngica, que denominámos PDβ. Tendo em conta o conhecimento prévio da atividade antifúngica do PDβ, este plano de trabalho teve como objetivos principais caracterizar o oligómero e determinar a sua estabilidade e a sua atividade antifúngica, bem como tentar perceber o seu mecanismo de ação como agente antifúngico, avaliando os efeitos fisiológicos e morfológicos em C. glabrata. A primeira fase do trabalho passou por isolar as globulinas totais dos cotilédones de L. albus seguida de purificação da fração correspondente à β-conglutina. Após purificação, a β-conglutina foi incubada a 25°C durante 7 dias, de modo a ocorrer a degradação para PDβ. Começou por se tentar perceber se o resultado desta degradação é devido a uma destruição da estrutura original da proteína dando origem a subunidades independentes. Os resultados permitiram concluir que embora a proteína sofra um processo de degradação, a sua massa molecular aumenta ligeiramente, o que permite concluir que o processo in vitro não se traduz num catabolismo com desaparecimento de sub-unidades mas sim de um arranjo estrutural diferente. O passo seguinte passou por avaliar a evolução do perfil polipeptídico e da atividade antifúngica durante o processo de degradação. Foi possível determinar que a degradação da β-conglutina começa a ocorrer a partir do terceiro dia de incubação a 25°C, sendo o pico máximo de degradação ao fim dos 7 dias. Esta degradação leva a uma acumulação progressiva de um polipéptido com 20 kDa, o que parece semelhante ao catabolismo que ocorre naturalmente nos cotilédones de L. albus. No entanto no processo in vivo a degradação origina exclusivamente um polipéptido de 20 kDa denominado Blad, que acaba por ser completamente degradado. Neste caso, o processo é interrompido sugerindo que falta uma peça chave para posterior degradação. Em relação à atividade antifúngica, o seu aparecimento é gradual: vai aumentando atingindo o pico máximo de atividade aos 7 dias de incubação. De seguida tentou caracterizar-se e identificar o mecanismo envolvido na degradação da β-conglutina em PDβ, começando por se analisar se poderia ser causada por uma reação de oxidação-redução, interferindo com o oxigénio disponível na reação. Os resultados obtidos indicam que o aumento de oxigénio disponível na reação não tem qualquer influência sobre a reação de degradação mas quando se adiciona dithiothreitol (DTT) a degradação não ocorre, ou é interrompida no momento em que este é adicionado. Uma possível explicação pode ser pelo facto de o DTT ser um eficaz desnaturante de proteínas quebrando as ligações dissulfídicas nos grupos de cisteína. Tendo em conta estes resultados e admitindo a hipótese de haver uma protease envolvida no processo de conversão a qual poderia estar a ser inibida por um agente redutor, foram testados vários inibidores de diferentes classes de proteases, adicionando-os separadamente à β-conglutina antes do período de incubação in vitro de 7 dias. Dos inibidores de proteases testados, apenas o ácido etilenodiaminatetraacético (EDTA) teve influência na β-conglutina, impedindo a sua degradação. De acordo com este resultado é possível concluir que a degradação da β-conglutina é dependente de uma metaloprotease, inibida aquando da adição de EDTA, resultado confirmado por recurso a uma zimografia. Esta metaloprotease encontra-se sob a forma inativa, encontrando-se apenas ativa ao fim de 3 dias de incubação da β-conglutina a 25°C, altura em que se inicia o processo de degradação. Para esclarecer a origem da molécula responsável pela degradação da β-conglutina, levantou-se a hipótese de se tratar de uma contaminação externa. No entanto, esta hipótese foi abandonada uma vez que tanto a solução de β-conglutina filtrada através de filtros de fluoreto de polivinilideno (PVDF) como a β-conglutina submetida a um tratamento com antibiótico sofreram o processo normal de degradação. Embora nesta fase do trabalho existissem resultados bastante interessantes, nenhum permitiu identificar a molécula responsável pela degradação da β-conglutina. Uma vez que os ensaios de zimografia foram os que permitiram chegar mais perto da sua identidade, foi efetuada uma nova zimografia utilizando as vicilinas totais como substrato, visto ser o substrato natural da metaloprotease em questão. As bandas com atividade proteolítica foram excisadas do gel e enviadas para sequenciação. No entanto, após receção dos resultados verificou-se que não foi possível identificar a possível metaloprotease. Em simultâneo com a caracterização bioquímica do processo de degradação, foi avaliada a atividade antimicrobiana de PDβ, o que revelou que apesar de PDβ não apresentar atividade bactericida, esta apresenta atividade fungicida em várias espécies de leveduras e de fungos filamentosos. Após o rastreio efetuado, foram avaliados os efeitos morfológicos e fisiológicos da PDβ, usando C. glabrata ISA 2163 como modelo. Começou por se comparar a actividade antifúngica de PDβ com a do itraconazole e anfotericina B, o que revelou que PDβ parece apresentar maior atividade inibitória e fungicida numa base molecular do que tanto o itraconazole como a anfotericina B. De seguida, realizaram-se curvas de crescimento de C. glabrata ISA 2163 exposta às concentrações inibitórias e letais de PDβ e de anfotericina B, de modo a estudar e comparar os seus efeitos no crescimento da levedura. As curvas obtidas permitiram concluir que a adição tanto de PDβ como de anfotericina B teve um forte efeito inibitório no crescimento de C. glabrata ISA 2163, visto que as células expostas a ambas as concentrações testadas de ambas as drogas apresentam uma diminuição na taxa de crescimento, quando comparado com a situação controlo (sem droga). Em ambos os casos, os efeitos de inibição começam a ocorrer ao fim de 4 h de incubação, verificando-se uma estabilização da DO640nm e das contagens de unidades formadoras de colónias (UFC), mais acentuada a partir das 12 h de incubação, na fração incubada com a concentração letal de PDβ. Simultaneamente foi avaliado o efeito de PDβ na atividade metabólica, com recurso ao fluorocromo FUN-1, e na integridade da parede celular, com recurso ao calcofluor white, de C. glabrata ISA2163, recolhendo amostras ao longo da curva de crescimento. Os resultados obtidos sugerem que, mesmo ao fim de 24 h de incubação com uma concentração letal de PDβ, não ocorre perda de viabilidade celular sugerindo que as células apenas perdem a capacidade de se multiplicar, dada a estabilização do número de células. Relativamente à integridade da parede celular, existe uma diferença notória entre a fração incubada com PDβ e a fração controlo. Enquanto a integridade da parede celular da fração controlo permanece inalterada ao longo da curva, a fração exposta à PDβ apresenta falhas na marcação com calcofluor white, a partir das 8 h de incubação, tornando-se mais evidentes após as 12 h. Estes resultados sugerem perda de integridade da parede celular e podem ser a razão pela qual as células perdem a capacidade para se multiplicar. Por último, determinou-se a localização celular da PDβ ao fim de 24 h de incubação em C. glabrata ISA 2163. Os resultados obtidos sugerem que PDβ se liga à parede celular da levedura, destabilizando-a. No entanto, não há vestígios da proteína no interior da célula. Este trabalho permite concluir que a degradação in vitro da β-conglutina para PDβ ocorre de forma controlada, possivelmente sob a ação de uma metaloprotease. A atividade desta metaloprotease só é visível após o início da conversão da β-conglutina, aumentando de atividade à medida que o oligómero é convertido. Isto sugere que na semente seca, quando se purifica a β-conglutina, a metaloprotease se encontra inativa, sendo necessária a sua ativação para que a conversão da β-conglutina tenha início. No que respeita a atividade antimicrobiana de PDβ, é possível concluir que a mesma apresenta uma forte atividade em diferentes fungos, tanto leveduras, patogénicas e alimentares, como fungos filamentos. Relativamente ao modo de ação do oligómero, verificou-se que este tem capacidade para se ligar à parede celular da levedura em estudo, criando danos significativos e afetando a sua integridade celular. Os danos causados ao nível da parede celular parecem ser suficientes para impedir a multiplicação do microrganismo, levando à inibição do seu crescimento.Pathogenic fungi represent, worldwide, a serious threat for human’s health. Candida species are among the top ten pathogens causing bloodstream infections (BSI). C. glabrata can be described as a truly emerging pathogen that cause BSI due, in part, to its intrinsic and acquired resistance to azoles and other commonly used antifungal agents. All antifungal agents available display several disadvantages. It is therefore essential to identify new, potent and safe antifungal drugs with novel modes of action. PDβ is an in vitro breakdown oligomer resultant from the degradation of β-conglutin, with proved antifungal activity. Based on this information and in an attempt to go deeper in knowledge, the first objective of this work was the biochemical characterization of PDβ oligomer and the understanding of the metabolic route involved in the degradation process. This process was found to occur gradually and controlled by a metalloproteinase that needs to be activated, converting an inactive protein into an oligomer with antifungal activity. The second goal was the characterization of PDβ stability and antimicrobial activity against an array of different species. The antimicrobial activity of PDβ was shown to be quite diverse among yeasts and filamentous fungi; however no bactericidal activity was detected. Finally, an attempt to understand PDβ mode of action by assessing its physiological and morphological effects on C. glabrata was explored. Upon exposure of C. glabrata to PDβ, the yeast is still metabolically active but loses its cell wall integrity. Furthermore, the activity of PDβ suggests binding to the cell wall, without entering into the cell. The binding of PDβ leads to damages and destabilization of the cell wall which are severe enough to prevent C. glabrata ISA 2163 multiplication

Blad-containing oligomer fungicidal activity on human pathogenic yeasts. From the outside to the inside of the target cell

Blad polypeptide comprises residues 109–281 of Lupinus albus b-conglutin precursor. It occurs naturally as a major subunit of an edible, 210 kDa oligomer which accumulates to high levels, exclusively in the cotyledons of Lupinus seedlings between the 4th and 14th day after the onset of germination. Blad-containing oligomer (BCO) exhibits a potent and broad spectrum fungicide activity toward plant pathogens and is now on sale in the US under the tradename FractureTM. In this work we demonstrate its antifungal activity toward human pathogens and provide some insights on its mode of action. BCO bioactivity was evaluated in eight yeast species and compared to that of amphotericin B (AMB). BCO behaved similarly to AMB in what concerns both cellular inhibition and cellular death. As a lectin, BCO binds strongly to chitin. In addition, BCO is known to possess ‘exochitinase’ and ‘endochitosanase’ activities. However, no clear disruption was visualized at the cell wall after exposure to a lethal BCO concentration, except in cell buds. Immunofluorescent and immunogold labeling clearly indicate that BCO enters the cell, and membrane destabilization was also demonstrated. The absence of haemolytic activity, its biological origin, and its extraordinary antifungal activity are the major outcomes of this work, and provide a solid background for a future application as a new antifungal therapeutic drug. Furthermore, its predictable multisite mode of action suggests a low risk of inducing resistance mechanisms, which are now a major problem with other currently available antifungal drugs.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Insights into the role of three Endonuclease III enzymes for oxidative stress resistance in the extremely radiation resistant bacterium Deinococcus radiodurans

The extremely radiation and desiccation resistant bacterium Deinococcus radiodurans possesses three genes encoding Endonuclease III-like enzymes (DrEndoIII1, DrEndoIII2, DrEndoIII3). In vitro enzymatic activity measurements revealed that DrEndoIII2 is the main Endonuclease III in this organism, while DrEndoIII1 and 3 possess unusual and, so far, no detectable EndoIII activity, respectively. In order to understand the role of these enzymes at a cellular level, DrEndoIII knockout mutants were constructed and subjected to various oxidative stress related conditions. The results showed that the mutants are as resistant to ionizing and UV-C radiation as well as H2O2 exposure as the wild type. However, upon exposure to oxidative stress induced by methyl viologen, the knockout strains were more resistant than the wild type. The difference in resistance may be attributed to the observed upregulation of the EndoIII homologs gene expression upon addition of methyl viologen. In conclusion, our data suggest that all three EndoIII homologs are crucial for cell survival in stress conditions, since the knockout of one of the genes tend to be compensated for by overexpression of the genes encoding the other two

D6.3 Policy Recommendations and Strategy Report

The European Commission aims to develop a more sustainable environment for research infrastructures ecosystem, and to ensure that the benefits and impacts are widely perceived by research communities and led to research excellence. This vision is reflected in a range of international and European documents. Recent work conducted by the OECD and the European Commission, particularly by ESFRI and e-IRG, have stated the need to make structural changes in the EU framework for research infrastructures (RIs). In line with this strategic vision, DARIAH intends to establish itself as a sustainable research infrastructure. DESIR (DARIAH ERIC Sustainability Refined) work package 6 TRUST contributes to DARIAH’s long-term sustainability by measuring acceptance and impact of DARIAH in new cross-disciplinary DARIAH communities and core groups. This was the base to define the theoretical and methodological framework that supported the research here presented. Therefore, this report focuses on the development of recommendations and strategies to support and increase confidence in DARIAH services and infrastructure, aiming at contributing to a major DESIR goal, which is to enlarge DARIAH by engaging new cross-disciplinary communities and considering their specific requirements. The proposed recommendations could set the basis for a broader debate within the DARIAH and RIs landscape on the actions to be taken at all decision levels in order to address a vision for longer-term sustainable RI. So, this report intends to be a policy document that aims at inspiring the future path of DARIAH, contributing to its sustainability and to fulfil the mission for which it was created. The recommendations stem from the analytical work developed from the contributions of multiple sources of information: an academically-driven multi-country survey (see D6.2); 33 qualitative interviews in three different countries; a workshop with DARIAH national coordinators held in Warsaw; contributions from DESIR partners who lead other work projects within the project; and DESIR Winter School “Shaping New Approaches to Data Management in Arts and Humanities”. After defining the entire set of recommendations, they were grouped according to three main strategic frameworks (sustainability, scope and DARIAH Strategic Plan) and visually displayed in a “Recommendations & Community Engagement Tool” (https://dariah.peopleware.pt), an open platform that supports DARIAH, strengthening the link with arts and humanities communities.The new DARIAH Strategic Plan for the next seven years, which will be followed by the publication of a Strategic Action Plan, represents a big opportunity to address sustainability, both as a conceptual level and in terms of organizational and operational configuration. Therefore, the main findings are summarized in seven key recommendations, linked with the strategic pillars of the recent published DARIAH Strategic Plan:1. Promote research excellence with inclusive, collaborative, bureaucracy free and community-driven approach.2. Ensure the integration of tools, services, data and resources within DARIAH community and with other Research Infrastructures (e.g. by gathering them on a platform such as the Marketplace).3. Foster a collaborative learning environment and anticipate the skills of the future through a joint strategy for education and training (e.g. DARIAH-CAMPUS).4. Establish a flexible, participatory and effective governance model with a clear and sustainable business plan.5. Strengthen DARIAH’s representation in European and International policy arena, expanding its visibility and cooperation outside EU borders.6. Broaden and extend DARIAH’s role, action and benefits towards the strengthening of scientific citizenship in Europe.7. Set up means for monitoring and bringing communities together, while respecting diversity on an institutional, scientific, disciplinary and methodological level.The work developed in the DESIR project - particularly this set of recommendations - could be a contribution to foster the implementation of guidelines and short and long-term actions to improve DARIAH’s sustainability and firmly establish it as a long-term leader and partner within arts and humanities communities

entre os impulsos da tecnocracia e o paradoxo europeu

UIDB/04004/2020A evolução das políticas de Ciência e Tecnologia em Portugal tem sido descrita sobretudo pelos seus actores, que nos vêm falando frequentemente em um “confronto permanente entre políticas de necessidades e políticas de oportunidades” (Heitor & Horta 2004, p. 4) A percepção dos intervenientes traduz uma realidade de “subfinanciamento crónico” (GEPAE 1968, Agudo 1996). Com importantes antecedentes de política científica, é a partir do segundo pós-guerra que o debate da coordenação e os exercícios de planeamento e inventariação dos recursos científicos e tecnológicos anunciam a adopção da política científica e tecnológica para o desenvolvimento. É uma matriz semelhante a diversos outros casos nacionais europeus, em que o ‘ocedeismo’ (cf. Miranda 1978; Henriques & Larédo 2013) influenciou o modelo de organização da ciência e introduziu a perspetiva sistémica nas políticas de Ciência, Tecnologia e Inovação em Portugal.publishersversionpublishe

Cultura Material, Cultura Científica: Património Industrial para o Futuro

IH4Future (PTDC/FIS-aQM/30292/2017Material, Culture, Scientific Culture: Industrial Heritage for the Futurepublishersversionpublishe

Portugal

SFRH/BPD/111782/2015 UID/HIS/04209/2013Portugal’s participation in the First World War was depicted by its supporters as a vital component of the consolidation of the country’s young republican regime (established in 1910) and its affirmation abroad. However, there was never any consensus on intervention and the despatch of an expeditionary force on the Western Front, and a coup d’état in December 1917 led to a revision of Portugal’s commitment to the conflict. The defence of the country’s substantial colonial empire generated greater agreement at the level of national elites, but the war in the colonies – especially in Mozambique – proved especially problematic for the Portuguese. All of these factors, taken together with domestic upheaval and a disappointing peace treaty in 1919, suggest that rather than strengthening the Republic, the First World War served to undermine it fatally, leaving it unprepared for the challenges of the post-war world.publishersversionpublishe

Spectroelectrochemical insights into structural and redox properties of immobilized endonuclease III and its catalytically inactive mutant

Endonuclease III is a Fe-S containing bifunctional DNA glycosylase which is involved in the repair of oxidation damaged DNA. Here we employ surface enhanced IR spectroelectrochemistry and electrochemistry to study the enzyme from the highly radiation- and desiccation-resistant bacterium Deinococcus radiodurans (DrEndoill(2)). The experiments are designed to shed more light onto specific parameters that are currently proposed to govern damage search and recognition by endonucleases III. We demonstrate that electrostatic interactions required for the redox activation of DrEndoill(2) may result in high electric fields that alter its structural and thermodynamic properties. Analysis of inactive DrEndollI(2) (K132A/D150A double mutant) interacting with undamaged DNA, and the active enzyme interacting with damaged DNA also indicate that the electron transfer is modulated by subtle differences in the protein-DNA complex. (C) 2017 Elsevier B.V. All rights reserved

Disentangling Unusual Catalytic Properties and the Role of the [4Fe-4S] Cluster of Three Endonuclease III from the Extremophile D. radiodurans

Funding Information: This work was supported by FCT—Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P., through MOSTMICRO-ITQB R&D Unit (UIDB/04612/2020, UIDP/04612/2020) and LS4FUTURE Associated Laboratory (LA/P/0087/2020), research projects PTDC/QUI/BIQ/100007/2008, PTDC/BBB-BEP/0561/2014, PTDC/BIA-BFS/31026/2017, post doc fellowhip SFRH/BPD/97493/2013 (EM) and PhD fellowship SFRH/BD/132966/2017 (FR). Funding is also acknowledged for the TIMB3 project, European Union’s Horizon 2020 research and innovation program, under grant agreement No 810856. Publisher Copyright: © 2022 by the authors. Licensee MDPI, Basel, Switzerland.Endonuclease III (EndoIII) is a bifunctional DNA glycosylase with specificity for a broad range of oxidized DNA lesions. The genome of an extremely radiation-and desiccation-resistant bac-terium, Deinococcus radiodurans, possesses three genes encoding for EndoIII-like enzymes (DrEndoIII1, DrEndoIII2 and DrEndoIII3), which reveal different types of catalytic activities. DrEndoIII2 acts as the main EndoIII in this organism, while DrEndoIII1 and 3 demonstrate unusual and no EndoIII activity, respectively. In order to understand the role of DrEndoIII1 and DrEndoIII3 in D. radiodurans, we have generated mutants which target non-conserved residues in positions considered essential for classic EndoIII activity. In parallel, we have substituted residues coordinating the iron atoms in the [4Fe-4S] cluster in DrEndoIII2, aiming at elucidating the role of the cluster in these enzymes. Our results demonstrate that the amino acid substitutions in DrEndoIII1 reduce the enzyme activity without altering the overall structure, revealing that the residues found in the wild-type enzyme are essential for its unusual activity. The attempt to generate catalytic activity of DrEndoIII3 by re-designing its catalytic pocket was unsuccessful. A mutation of the iron-coordinating cysteine 199 in DrEndoIII2 appears to compromise the structural integrity and induce the formation of a [3Fe-4S] cluster, but apparently without affecting the activity. Taken together, we provide important structural and mechanistic insights into the three EndoIIIs, which will help us disentangle the open questions related to their presence in D. radiodurans and their particularities.publishersversionpublishe

A collaborative strategy towards local history and heritage

UID/HIS/04209/2013This paper intends to present the project Memória das Avenidas and the collaborative strategies undertook,  regarding local history, heritage and memory. The project Memória das Avenidas (developed since 2015) has  been recording and collecting oral testimonies and memorabilia from the elder inhabitants of Avenidas Novas  (Lisbon), following a collaborative strategy with the involvement of local citizens, NGOs and institutions, in  order to understand the historical processes by which the city has been developed, occupied, transformed  and lived. One of its main goals has been to build an open platform for raising awareness towards critical ways  of dealing with local heritage in its various forms as a means to foster community building and identity. publishersversionpublishe