Development of cell factories for the efficient production of mannosylglycerate, a thermolyte with great potential in biotechnology

Mannosylglycerate (MG) is a compatible solute implicated in the response to osmotic or heat stresses in many marine microorganisms adapted to hot environments. MG shows a remarkable ability to protect model proteins, especially against heat denaturation; however, high production costs prevented the industrial exploitation of these features. This thesis has two main objectives: i) to assess the efficacy of MG as protein stabilizer in the intracellular milieu; and ii) to develop a bio-based process for production of MG at competitive cost. The first goal was achieved by using a yeast model of Parkinson’s disease in which an aggregation-prone protein, eGFP-tagged α-synuclein, was expressed along with the biosynthetic activities that catalyze the formation of MG from GDP-mannose and 3-phosphoglycerate. There was a reduction of 3.3-fold in the number of cells containing fluorescent foci of α-synuclein, in comparison with a control strain without MG. It was also proven that inhibition of aggregation was due to direct MG-protein effects, i.e., MG acted in vivo as a chemical chaperone. This opened a way for drug development against diseases related with protein misfolding. Towards the second objective, genes PMI40 and PSA1 of the GDP-mannose pathway were over-expressed in the industrial microorganism, Saccharomyces cerevisiae, to redirect metabolic flux towards that MG precursor. This strategy led to 2.2-fold increase in MG production (15.86 mgMG.gDW-1) for cells cultivated in controlled batch mode. Further improvement was achieved by cultivation in chemostat mode at a dilution rate of 0.15 h-1; a constant productivity of 1.79 mgMG.gDW-1h-1 was reached. Next, a holist approach was undertaken by using in silico tools to identify engineering strategies that would lead to efficient channeling of substrates to MG production. The proposed strains were constructed and characterized in batch fermentation and continuous mode and led to an improved MG production of 25.3 mgMG.gDW-1 and 3.4 mgMG.L-1h-1, respectively

Dynamic Consumption and Portfolio Choice with Ambiguity about Stochastic Volatility

We introduce ambiguity about the variance of the risky asset's return in the model of Chacko and Viceira (2005) for dynamic consumption and portfolio choice with stochastic variance. We find that, with investors being able to update their portfolio continuously (as a function of the instantaneous variance), ambiguity has no impact. To shed some light on the case in which continuous portfolio updating is not possible, we also evaluate the effect of ambiguity when investors must use their expectation of future variance for their portfolio decision. In the latter scenario, demand for the risky asset can be decomposed into three components: myopic and intertemporal hedging demands (as in Chacko and Viceira (2005)) and ambiguity demand. Using long-run US data, Chacko and Viceira (2005) found that intertemporal hedging demand is empirically small, suggesting a low impact of stochastic variance on portfolio choice. Using the same calibration, we find that ambiguity demand may be very high, much more than intertemporal hedging demand. Therefore, stochastic variance can be very relevant for portfolio choice, not because of the variance risk, but because of investors' ambiguity about variance.Asset Allocation, Stochastic Volatility, Ambiguity

Engineering Saccharomyces cerevisiae for the production of mannosylglycerate: a yeast model for assessing its application in the protein stabilization

Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010Mannosylglycerate (MG) is an osmolyte widespread in microorganisms adapted to hot environments. The effect of MG on the protection of model proteins against heat-induced denaturation and aggregation has been amply demonstrated in vitro. These characteristics make MG a valuable compound in biotechnological applications. However, the practical application of MG is hampered by the high production cost. In this work, we engineered Saccharomyces cerevisiae for the production of MG. Two strains (VSY71 and CEN.PK2) and several carbon sources were examined to optimize the production of MG. Using glucose as carbon source, the strain VSY71 accumulated 90 μmol MG/g of dry mass, an increase of 2-fold compared with strain CEN.PK2. The effect of several carbon sources (sucrose, mannose, galactose and raffinose) on MG production by strain VSY71 was also investigated. Synthesis of MG (28.1 μmol/g of dry mass) was detected with sucrose only. In addition to the biotechnological importance of being a MG producer, this strain can serve as a platform to assess protein stabilization by osmolytes in vivo. Therefore, we used it to evaluate the effect of MG on the aggregating-prone protein, α-synuclein (α-Syn). For that, the S. cerevisiae strain VSY72, harboring two copies of α-Syn-EGFP integrated in the genome, was engineered to synthesize MG. As a control, a mutant transformed with the empty MG-plasmid was also constructed. The accumulation of MG (20 μmol/g of dry mass) prior to α-Syn over-production clearly reduced the formation of inclusions of this protein; moreover, the formation of reactive oxygen species induced by α-Syn overproduction decreased in the MG-producing strain. Additionally, when MG accumulation was induced in cells harboring large inclusions of α-Syn there was an effective solubilization of these forms. This work clearly shows that MG inhibits the aggregation of α-Syn and promotes the solubilization of α-Syn inclusions in vivo.Microrganismos adaptados a proliferar optimamente em ambientes com temperatura elevada são designados termófilos ou hipertermófilos, consoante a temperatura óptima de crescimento se situa entre 60oC e 80oC ou acima de 80oC, respectivamente. Estes organismos tem sido isolados a partir de amostras de zonas geotermais, quer terrestres quer marinhas, superficiais ou de profundidade, bem como de ambientes aquecidos artificialmente. Tal como a maioria dos microrganismos halofílicos ou halotolerantes, os microrganismos termofílicos e hipertermofílicos provenientes de ambientes marinhos acumulam compostos orgânicos denominados “solutos compatíveis” para contrabalançar a pressão osmótica exterior. São moléculas de baixa massa molecular, com elevada solubilidade em água e que podem atingir concentrações elevadas no interior das células (da ordem de 1 M) sem interferirem negativamente com as funções celulares. Para alem da sua função na adaptação a flutuações na osmolaridade do meio exterior, alguns destes solutos são preferencialmente acumulados em resposta a temperaturas supra-óptimas. Além disso, os solutos tipicos de (hiper)termófilos são quimicamente diferentes dos que geralmente são encontrados em organismos mesofílicos, nomeadamente no que se refere a carga eléctrica da molécula que é negativa nos primeiros e neutra nos segundos. Este conjunto de observações levou a hipótese de que os solutos compatíveis de (hiper)termófilos desempenhariam um papel relevante na protecção de componentes celulares contra os efeitos desnaturantes provocados por temperaturas elevadas. Manosilglicerato e um dos solutos compatveis mais frequentemente encontrado em microrganismos adaptados a ambientes quentes. Foi identificado inicialmente em Rhodothermus marinus, uma bacteria termofílica isolada de uma nascente geotermal dos Açores, mas posteriormente foi detectado em muitos outros (hiper)termófilos (trabalho da nossa equipa). A maioria dos organismos estudados acumula este soluto em resposta a stress osmótico, no entanto acumulação em resposta a stress térmico tem sido observada em alguns casos. Ensaios in vitro com proteínas modelo mostraram que manosilglicerato actua como estabilizador, exibindo capacidade termoprotectora muito superior a da trealose, um soluto caracteristico de organismos iv mesófilos. Manosilglicerato tem-se revelado um excelente protector da estrutura de proteínas, impedindo a sua desnaturação e subsequente agregação, bem como a perda de actividade no caso de enzimas. Por estas razões, o manosilglicerato tem grande potencialidade de aplicação, nomeadamente na industria cosmética, como hidratante e protector solar, na conservação de vacinas durante armazenamento e transporte, como estabilizador de enzimas em “kits” clínicos e analíticos e na estabilização de proteínas usadas em biosensores. Em particular, manosilglicerato aumenta o tempo de vida de vectores retrovirais e melhora a sensibilidade em metodologias com microgrelhas de DNA. Trata-se portanto de um composto valioso sob o ponto de vista biotecnológico. Contudo, a produção de manosilglicerato e actualmente um processo altamente dispendioso, uma vez que o seu isolamento e realizado a partir da biomassa de um produtor natural, Rhodothermus marinus, que acumula apenas 15 g por kg de biomassa húmida (resultados não publicados). Neste contexto, torna-se premente o desenvolvimento de um produtor industrial de manosilglicerato de modo a conseguir custos de produção competitivos. A estrategia mais promissora envolverá necessariamente a manipulação genética de uma estirpe industrial (nomeadamente, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis) de modo a dotá-la com a capacidade para produzir manosilglicerato em larga escala. Esta tarefa é exequível visto que os genes envolvidos na síntese deste composto são conhecidos. Um dos objectivos do presente trabalho foi melhorar a produção de manosilglicerato usando uma organismo industrial. Para tal seleccionou-se a estirpe S. cerevisiae VSY71 que foi transformada com o plasmídeo (p425::mgsD), contendo o gene que codifica a enzima bifuncional manosil-3-fosfoglicerato sintase/fosfatase da bactéria mesofílica Dehalococcoides ethenogenes. Esta enzima sintetiza manosilglicerato a partir de GDP-manose e 3-fosfoglicerato. Estratégia idêntica tinha sido anteriormente seguida usando como hospedeiro a estirpe CEN.PK2 (Empadinhas et al., 2004), pelo que transformamos CEN.PK2 também com p425::mgsD e usámo-la para fins de comparação de produção. Para optimização da produção de manosilglicerato usou-se S. cerevisiae estirpe VSY71, contendo o plasmídeo para a síntese de manosilglicerato, e testaram-se varias fontes de carbono e varias salinidades no meio de crescimento. Os substratos rafinose, manose e galactose não conduziram a síntese de manosilglicerato, apesar de suportarem crescimento celular ainda que com velocidades de crescimento inferiores as registadas em glucose. Células cultivadas em sucrose acumularam 28 μmol de manosilglicerato por grama de biomassa seca. Produção maxima, 90 μmol de manosilglicerato por grama de biomassa seca, foi observada usando glucose como v fonte de carbono. Este valor é cerca de duas vezes superior à produção de manosilglicerato observada com a estirpe S. cerevisiae CEN.PK2. Os resultados mostram que a produção de manosilglicerato depende em grande medida da estirpe utilizada pelo que há todo um trabalho de rastreio de colecções de S. cerevisiae que será susceptível de conduzir a produções de manosilglicerato consideravelmente superiores. Mesmo assim, vale a pena destacar que a estratégia seguida neste trabalho conduziu a um melhoramento considerável da produção específica em comparação com a estratégia descrita na literatura. Um segundo objectivo deste trabalho foi avaliar a eficácia de manosilglicerato na estabilização de proteínas in vivo, ou seja, no meio extremamente viscoso e com elevada concentração molecular que constitui o citoplasma celular. O esforco investido neste tópico teve uma dupla finalidade: i) encontrar novas aplicações para manosilglicerato, eventualmente relacionadas com abordagens para prevenir agregação proteica induzida por erros no enrolamento de cadeias polipeptídicas; ii) e obter evidência experimental para apoiar a hipótese de que manosilglicerato exerce de facto um papel protector da estrutura de proteínas in vivo. Para realizar este objectivo usou-se um modelo de levedura para a doenca de Parkinson, no qual o gene codificante da α-Sinucleína humana (fundido com o gene codificante para uma proteína super-fluorescente) foi super-expresso em S. cerevisiae VSY72, onde também foi expresso o gene para a síntese de manosilglicerato. As células recombinantes produziram α-Sinucleína e manosilglicerato, permitindo comparar o efeito da presenca e ausência de manosilglicerato na agregação de α-Sinucleína em ambiente intracelular. α-Sinucleína e uma proteína encontrada apenas no cerebro de mamíferos. Embora a sua função fisiológica seja desconhecida, sabe-se que esta associada a varias doenças neurodegenerativas (doenca de Parkinson entre outras menos comuns) visto ser um dos componentes dos agregados proteicos que caracterizam estas patologias. α-Sinucleína e uma proteína intrinsecamente desenrolada, isto e, a forma nativa não tem estrutura definida. A proteína tem tendência para auto-associação formando em muitos casos estruturas fibrilares, designadas amiloides. Quando produzida na levedura S. cerevisiae, por manipulação genetica, a α-Sinucleína e transportada para a membrana plasmatica onde se ancora. A super-produção desta proteína leva a formação, perto da membrana, de pequenas inclusões citoplasmaticas que aumentam progressivamente de tamanho, originando grandes inclusões, visiveis por microscopia de fluorescência. Neste trabalho, usamos a estirpe VSY72 que contem duas copias do gene da α-Sinucleína integradas no cromossoma e que foi transformada com o plasmídeo que contém o gene que codifica para a síntese do manosilglicerato. Como controlo foi usada a estirpe VSY72 transformada com o plasmídeo vazio. A produção de manosilglicerato e regulada por um promotor constitutivo, enquanto que a produção de α-Sinucleína e controlada por um promotor sensivel a galactose. A acumulação intracelular de manosilglicerato (20 μmol por grama de biomassa seca) reduziu em 3,5 vezes o numero de células com inclusões de α-Sinucleína, em comparação com a estirpe controlo (incapaz de sintetizar manosilglicerato). Estes resultados referem-se a células examinadas dez horas após indução da produção de α-Sinucleína. Tivemos o cuidado de verificar que as duas estirpes apresentam niveis semelhantes de produção de α-Sinucleína (análises por “western blot”). Em paralelo, monitorizaram-se os niveis de especies reactivas de oxigénio induzidas pela produção excessiva de α-Sinucleína. Os resultados mostraram que a presenca de manosilglicerato no citoplasma causou uma diminuição no nivel de espécies reactivas de oxigénio em comparação com o controlo. Por outras palavras, ao prevenir a formação de inclusões de α-Sinucleína, o manosilglicerato diminuiu também o nível de stress oxidativo associado ao processo de super-expres são da proteína, possivelmente promovendo a estabilização de formas nativas de α-Sinucleína, supostamente com menor toxicidade para a célula. Tendo-se demonstrado o efeito inibitório de manosilglicerato na formação de inclusões de α-Sinucleína, pôs-se a questão de saber se este composto teria também efeito ao nível da solubilização de inclusões pré-formadas. Para tal, a produção de α-Sinucleína foi induzida nove horas antes da indução da síntese de manosilglicerato, por permuta de meio contendo galactose para meio fresco contendo glucose como única fonte de carbono. Os resultados obtidos mostraram que o manosilglicerato tem uma acção de chaperona molecular, promovendo a desagregação das inclusões de α-Sinucleína: uma hora apos indução da síntese de manosilglicerato o numero de inclusões visíveis por microscopia de fluorescência era 2,8 vezes inferior ao detectado em células controlo. O efeito do manosilglicerato na prevenção/solubilização de inclusões de α-Sinucleína pode ser atribuido a activação de mecanismos celulares que conduzem a degradação de formas anormais de α-Sinucleína, ou que promovem o seu enrolamento correcto. Alternativamente, o efeito benéfico observado pode resultar de uma interacção directa soluto/proteína que estabilize preferencialmente a estrutura nativa da α-Sinucleína, prevenindo assim a formação de inclusões. Os resultados descritos nesta tese não permitem tirar conclusões definitivas sobre o tipo de mecanismo envolvido, no entanto a observação de efeitos semelhantes em ensaios in vitro monitorizados por microscopia electrónica (resultados de outros membros da equipa) fundamentam a hipotese de que interacções directas manosilglicerato/proteína terão uma contribuição relevante quer in vivo quer in vitro

The fiscal forecasting track record of the European Commission and Portugal

Mestrado em Monetary and Financial EconomicsThis study aims at explaining the deviation between the budget balance ratio forecasts and the outcomes in the Portuguese official forecasts and in the European Commission (EC) vintage forecasts. Therefore, we used data from the EC for the period 1969-2011 and also the Portuguese official forecasts for 1977-2011. We explain the deviation of the budget balance-to-GDP through econometric estimations and present statistical decomposition about budget balance, revenue and spending-to-GDP deviations. The statistical significance of real GDP and inflation deviations reveals the effect of automatic stabilizers and the imperfect tax indexation system. The European panel reveals statistical significance (no significance) of investment (unemployment) deviation in the budget-to-GDP ratio. Countries with better fiscal rules seem to present favourable deviations (in the absence of fixed effects). In Portugal, there is evidence of unfavourable errors about the budget balance in nominal currency in most years, which has been offset (totally or partially) by a favourable nominal GDP effect deviation

A Panel ARDL Approach

Gross Domestic Product (GDP) has been the most widely accepted measure of economic performance, but it fails to accurately measure economic development, overlooking key aspects of quality of life and sustainability. Over the last few years, concern about the future of our planet and sustainability of human activity rose among public eye and political institutions, due to the increased natural resources exploitation, and the intensification and deepening of globalization. Thereby, the Index of Sustainable Economic Welfare (ISEW) emerges as the dominant alternative. This paper aims to: (i) compare both GDP and ISEW as measures of economic performance; and (ii) establish the effects of natural resources exploitation, and globalization on both economic growth and sustainable development. The research question is: Are globalization and natural resources exploitation harmful to economic development? Diagnostic tests show presence of cross-section dependence, heteroskedasticity and serial correlation. Thus, Driscoll-Kraay estimator is performed due to its robustness in the presence of these phenomena. A Panel Autoregressive Distributed Lag approach is used, which allows to check for short and long-term effects of the variables. The panel is composed by 14 OECD countries, and uses annual data for the time span from 1995 to 2013. Results show that natural resource rents have a positive effect on GDP per capita in the short-run and a negative effect on ISEW per capita both on short- and long-run. These results reveal that enhancing GDP does not account for the impacts of changes in natural capital and that natural resource exploitation may represent a hazard to sustainable development. Trade openness has a positive impact on short-term economic growth and a negative impact on long-term sustainable development. Other results show that social globalization has a positive impact on long-term economic growth and that political integration is positive for economic welfare. Policy makers ought to consider ISEW as an alternative and more accurate measure of economic development, should implement policies that reduce the depletion of natural resources, and confine the harmful effects of globalization to enhance economic development and create more welfare.O Produto Interno Bruto (PIB) tem sido a medida mais aceite de desempenho económico, apesar de não medir com exatidão o desenvolvimento económico, ignorando aspetos-chave da qualidade de vida e sustentabilidade. Ao longo dos últimos anos, a preocupação com o futuro do nosso planeta e a sustentabilidade da atividade humana tem-se tornado foco das instituições públicas e políticas, devido à crescente exploração dos recursos naturais e à intensificação e aprofundamento da globalização. Deste modo, o Índice de Bem-estar Económico Sustentável (ISEW) surge como a alternativa dominante. Este artigo procura: (i) comparar o PIB e o ISEW enquanto medidas de performance económica; e (ii) identificar os efeitos resultantes da exploração de recursos naturais e do fenómeno da globalização tanto no crescimento económico como no desenvolvimento sustentável. A questão de investigação é: serão a globalização e a exploração dos recursos naturais prejudiciais ao desenvolvimento económico? Testes de diagnóstico revelam a presença de cross-sectional dependence entre as variáveis, heterocedasticidade e auto-correlação. Assim, o estimador Driscoll-Kraay é utilizado devido à sua robustez na presença destes fenómenos. A abordagem Panel Autoregressive Distributed Lag é utilizada, permitindo assim verificar os efeitos de curto e longo prazo. O painel é composto por 14 países desenvolvidos, membros da OCDE, e são utilizados dados anuais para o horizonte temporal compreendido entre 1995 e 2013. Os resultados obtidos mostram que as receitas provenientes dos recursos naturais têm um efeito positivo no PIB per capita no curto prazo, enquanto que no ISEW se verifica um efeito negativo tanto no curto como a longo prazo. Estes resultados demonstram que o aumento do PIB não tem em conta os impactos das mudanças no capital natural e que a exploração de recursos naturais pode constituir um entrave ao desenvolvimento sustentável. A abertura comercial tem um impacto positivo para o crescimento económico no curto prazo e um impacto negativo no desenvolvimento sustentável de longo prazo. Outros resultados revelam que a globalização social tem um impacto positivo no crescimento económico a longo prazo e que a integração política é positiva para o bem-estar económico. Os formuladores de políticas devem considerar o ISEW como uma medida alternativa e mais precisa do desenvolvimento económico, devendo implementar políticas que reduzam o desgaste dos recursos naturais, e limitar os efeitos nocivos da globalização para melhorar o desenvolvimento económico e criar mais bem-estar para as populações

Natural hydraulic lime mortars: influence of the aggregates

3rd Historic Mortars Conference, 11-14 September 2013, Glasgow, ScotlandNatural hydraulic lime specifications changed with the new version of standard EN 459-1: 2010 and a new Portuguese NHL3.5 appeared in the market. The characteristics of mortars depend on many different parameters such as the type of binder, the type of aggregates, the use of fillers and of superplasticizers; also on mixing and curing conditions. In this paper NHL3.5 mortars with binder:aggregate volumetric proportions1:3 were prepared, varying the aggregates type and proportions between them. Two coarse sands, a medium sand, a river sand, a finer sand, a calcareous filler and a ceramic powder were used. The two last mentioned aggregates were byproducts from industry. Prismatic mortar samples and samples of mortar applied over brick were prepared and conditioned in two different situations – following standard EN 1015-11 and at 65% relative humidity with initial daily water spray. Mortars were characterized in the fresh state and at the age of 28 days. Results showed the influence namely of the curing, particularly in terms of water capillary, of the superplasticizer and of the fillers. They also showed that NHL3.5 mortars seem to be adequate for old masonries conservation and repair and, in some situations, they can be an alternative to air lime based mortars

Robust header compression over IEEE 802 networks

Tese de mestrado. Redes e Serviços de Comunicação. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto, INESC Porto. 200

Manual asymmetries in bimanual isochronous tapping tasks in children

Mestrado em Desenvolvimento da Criança na Variante de Desenvolvimento MotorThe reasons why some people use preferably one hand to perform everyday tasks instead of the other are still the object of study of many investigators. Even if ambidexterity would seem an advantage, the fact is, even small babies show preferences for one side over the other on their most basic movements. These lateral asymmetries are always present but suffer fluctuations throughout life and even from one activity to another, performed minutes later. A very common and effective way of studying manual asymmetries is through tapping tasks, following and adapting the models of authors like Stevens (1886) and Wing and Kristofferson (1973). These authors showed the scientific community that the synchronization-continuation experiments were valid and could be used to investigate the process of timekeeping and a variety of different aspects related to motor control. Our work was based on these previous investigations and has the purpose of analyzing the ability of keeping a rhythm, in children on a bimanual tapping task, as well as the manual asymmetries displayed while doing so. The children's performance was compared to that of adult musicians, who are expected to have a better than average performance on this type of tasks