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In Vivo Imaging Reveals Distinct Inflammatory Activity of CNS Microglia versus PNS Macrophages in a Mouse Model for ALS
Mutations in the enzyme superoxide dismutase-1 (SOD1) cause hereditary variants
of the fatal motor neuronal disease Amyotrophic lateral sclerosis (ALS).
Pathophysiology of the disease is non-cell-autonomous: neurotoxicity is derived
not only from mutant motor neurons but also from mutant neighbouring
non-neuronal cells. In vivo imaging by two-photon
laser-scanning microscopy was used to compare the role of
microglia/macrophage-related neuroinflammation in the CNS and PNS using
ALS-linked transgenic SOD1G93A mice. These mice contained labeled
projection neurons and labeled microglia/macrophages. In the affected lateral
spinal cord (in contrast to non-affected dorsal columns), different phases of
microglia-mediated inflammation were observed: highly reactive microglial cells
in preclinical stages (in 60-day-old mice the reaction to axonal transection was
∼180% of control) and morphologically transformed microglia that have
lost their function of tissue surveillance and injury-directed response in
clinical stages (reaction to axonal transection was lower than 50% of
control). Furthermore, unlike CNS microglia, macrophages of the PNS lack any
substantial morphological reaction while preclinical degeneration of peripheral
motor axons and neuromuscular junctions was observed. We present in
vivo evidence for a different inflammatory activity of microglia
and macrophages: an aberrant neuroinflammatory response of microglia in the CNS
and an apparently mainly neurodegenerative process in the PNS
Identification et exocytose d´organelles dans les astrocytes en culture: couplage de la microscopie à onde évanescente et de la décomposition spectrale
Les astrocytes sont capables de sécréter des gliotransmetteurs en réponse à une stimulation qui engendre l'augmentation de la concentration calcique intra-cellulaire. Différents mécanismes de sécrétion ont été proposés, parmi lesquels l'exocytose régulée. Mais les expériences menées dans le but d'observer la fusion d'organelles individuels dans des astrocytes en culture ont conduit à des résultats contradictoires, notamment en terme d'identité des vésicules libérables. Nos expériences préliminaires nous ont convaincus que les conflits sur l'identité des organelles libérables sont dus à de fausses colocalisations à cause du recouvrement spectral des marqueurs fluorescents utilisés et de la présence d'autofluorescence dans les astrocytes en culture. Nous avons donc adapté la décomposition spectrale à l'identification rigoureuse d'organelles individuels et au suivi de leur exocytose. La décomposition spectrale permet la séparation de sources de fluorescence mal séparées et ainsi l'étude de l'expression et de la colocalisation de protéines fluorescentes, même en présence d'autofluorescence. Nous avons à cette occasion introduit un intervalle de confiance du résultat de l'estimation des quantités de colorants. Appliquée au marquage des organelles astrocytaires avec la EGFP et l'acridine orange, cette méthode a montré que l'apparente colocalisation entre ces marqueurs reflète en fait la présence d'acridine orange plus intense que la EGFP et coexistant dans les mêmes organelles sous deux formes verte et rouge. A l'aide de la décomposition spectrale et de la microscopie à onde évanescente, nous avons ensuite montré que les organelles autofluorescents dans les astrocytes sont en majorité des lysosomes capables de fusionner lors d'une stimu\-lation qui engendre l'augmentation du calcium intra-cellulaire. Ces lysosomes sont peut-être les organelles majoritairement responsables de l'exocytose dans les astrocytes en culture.Non disponibl
Systematic Colocalization Errors between Acridine Orange and EGFP in Astrocyte Vesicular Organelles
Dual-color imaging of acridine orange (AO) and EGFP fused to a vesicular glutamate transporter or the vesicle-associated membrane proteins 2 or 3 has been used to visualize a supposedly well-defined subpopulation of glutamatergic astrocytic secretory vesicles undergoing regulated exocytosis. However, AO metachromasy results in the concomitant emission of green and red fluorescence from AO-stained tissue. Therefore, the question arises whether AO and EGFP fluorescence can be distinguished reliably. We used evanescent-field imaging with spectral fluorescence detection as well as fluorescence lifetime imaging microscopy to demonstrate that green fluorescent AO monomers inevitably coexist with red fluorescing AO dimers, at the level of single astroglial vesicles. The green monomer emission spectrally overlaps with that of EGFP and produces a false apparent colocalization on dual-color images. On fluorophore abundance maps calculated from spectrally resolved and unmixed single-vesicle spectral image stacks, EGFP is obscured by the strong green monomer fluorescence, precluding the detection of EGFP. Hence, extreme caution is required when deriving quantitative colocalization information from images of dim fluorescing EGFP-tagged organelles colabeled with bright and broadly emitting dyes like AO. We finally introduce FM4-64/EGFP dual-color imaging as a remedy for imaging a distinct population of astroglial fusion-competent secretory vesicles