Establishment of a protocol for the cryopreservation of cell sheets of adipose tissue stem cells

Dissertação de Mestrado, Ciências Biomédicas, Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Universidade do Algarve, 2016A Engenharia de Tecidos é uma área interdisciplinar da Medicina Regenerativa que visa criar e desenvolver substitutos biológicos para reparar, manter ou melhorar a função de tecidos lesados, com base em princípios da engenharia conjugados às ciências da vida. A Engenharia de Tecidos tira partido das propriedades de estruturas tri-dimensionais (3D) que combinadas com células estaminais pretendem recriar um ambiente semelhante ao nativo de um tecido. Estas estruturas 3D (scaffolds) são produzidas com materiais de origem natural ou sintéticos, que idealmente terão as propriedades físicas, mecânicas e químicas para promoverem o melhor desempenho dessas células e portanto a regeneração dos tecidos. Na última decada as células estaminais mesenquimais foram amplamente utilizadas na Engenharia de Tecidos, pois têm o potencial de proliferarem e se manterem indiferenciadas com a capacidade de se auto-renovarem e/ou diferenciarem em diferentes tipos de células. Existem várias fontes de células estaminais com caracteristicas diferentes utilizadas em TE, em que as que apresentam maior impacto são as derivadas da medula espinal, do sangue e do tecido adiposo, entre outras localizadas em diferentes zonas do corpo humano. A combinação entre scaffolds e células estaminais mesenquimais apresentam algumas limitações tais como a indução de uma resposta inflamatória após transplante e o facto da grande maioria dos biomateriais utilizados não serem biofuncionais. A Engenharia de Cell sheets é a alternativa, pois utiliza a matriz extracelular depositada pelas células como scaffold natural para a regeneração de diferentes tecidos. O conceito de cell sheet foi introduzido por Teruo Okano e os seu colaboradores nos anos 90 no Japão. Estas cell sheets são produzidas em superficies revestidas com um polímero não iónico sensível à temperatura. Quando a temperatura é inferior a 32ºC a superficie fica hidrofílica, promovendo o destacamento das células em folha (cell sheets) sem recorrer ao uso do tradicional tratamento enzimático. Assim, esta tecnologia permite obter cell sheets com uma organização celular própria e coesiva, dado que as interações célula-celula e célula-matriz extracelular são mantidas. Em estudos anteriores no nosso laboratório foram produzidas cell sheets a partir das células estaminais humanas derivadas do tecido adiposo (hASCs). As cell sheets de hASCs quando transplantadas para feridas excisionais em pele de ratinho, induziram a formação de cristas epiteliais, normalmente apenas encontradas em pele humana, e a formação de um número significativo de folículos pilosos. Tendo em consideração estes resultados e antevendo as possibilidades de ter estas cell sheets disponiveis para uso imediato na clínica (off-the-shelf) a sua criopreservação seria vantajosa. Assim, o objectivo deste estudo foi definir um método de criopreservação que não só permita a preservação da viabilidade das hASCs mas também a integridade da matriz extracelular das cell sheets, que se sabe ser critico para garantir a sua funcionalidade, após transplantação. De modo a minimizar um potencial efeito adverso do processo de criopreservação, o método testado teve como base o método standard slow cooling rate, utilizado na criopreservação de células em suspensão. Foram então definidas duas condições de criopreservação, a condição standard, com 10% do crioprotector Dimethylsulfoxide (DMSO), e a condição exprimental, com 5% DMSO. Com o objectivo reduzir a toxicidade para as células criopreservadas. O efeito das condições de criopreservação na viabilidade celular foi analisado depois das cell sheets serem dissociadas, tendo sido demonstrado que ambas as condições de criopreservação não afectam de forma significativa a viabilidade celular. No entanto, verificou-se que a organização do citoesqueleto das células na cell sheet sofreu alterações depois da criopreservação em ambas as condições, verificando-se uma desorganização mais acentuada na condição standard. Verificou-se ainda que ambas as condições de criopreservação afetam a integridade da matriz extracelular das cell sheets, embora pareça que a condição standard afecte de um modo mais significativo. Mais ainda ambas as condições de criopreservação afectaram a quantidade total de proteínas. Potencialmente, este resultado está associado com as proteínas da matriz laminina, fibronectina e colagéneo I. De facto, a expressão destas proteínas excepto o colagéneo foi afectado tanto a nível molecular e proteico. Mais ainda verificamos a expressão dos seus genes por reacção em cadeia da polimerase (PCR). Onde a nível molecular o gene da laminina está sobre expressa em ambas as condições de criopreservação, o gene da fibronectina apenas na condição exprimental e o gene do colagéneo não sofre alterações significativas em ambas as condições de criopreservação. Considerando que as propriedades mesenquimais das células que compõe as cell sheets, são determinantes nos resultados previamente observados, a expressão dos marcadores típicos após a criopreservação foi analisado a nível genético e proteico, usando PCR e citometria de fluxo respectivamente. Com base nos resultados obtidos, que demonstram que a matriz extracelular é significativamente afectada pelo processo de criopreservação, será necessário testar diferentes protocolos e diferentes métodos de criopreservação, no sentido de se obter uma melhor preservação da integridade estrutural da cell sheet, e portanto garantir a sua funcionalidade após transplantação.Regenerative Medicine (RM) englobes the multidisciplinary and interdisciplinary field of Tissue Engineering (TE) that aims to repair or enhance tissue or organ function. The field of TE takes advantage of the properties of three-dimensional (3D) structures that combined with different cells allow to recreate the native environment of a tissue. These 3D structures are produced with synthetic or natural materials, and aimed to have the ideal physical, mechanical and chemical proprieties for a better performance of cells, thus promoting the tissue regeneration. In context of TE, stem cells (SCs) are combined with the 3D structures or scaffolds, allowing the creation of viable and complex substitutes for tissue regeneration. The SCs have been largely used in TE due to its high proliferative rate, self-renewal capacity, ability to differentiate into different cell lineages. In the last decade the mesenchymal stem cells have been widely used in tissue engineering, they have the potential to proliferate and maintain undifferentiated with the ability to self-renew and / or differentiate into different cell types. There are various sources of stem cells with different characteristics used in TE, where they have the greatest impact are derived from spinal cord, blood and adipose tissue, among others located in different areas of the human body. The use of scaffolds, might promote an inflammatory response after transplantation, and the major part of used biomaterials are not biofunctional. One of the alternatives to solve this problem is the production of constructs without the use of traditional biomaterials. The Cell Sheet Engineering is the alternative because it uses the extracellular matrix deposited by the cells as a natural scaffold for the regeneration of different tissues. Cell sheet technology was originally proposed by Okano and co-workers, in early 90’s. This technology takes advantage of thermo-responsive culture dishes that enable reversible cell adhesion to and detachment from the dish surface by a controllable hydrophobicity of the surface. By temperature change, a cell sheet with organized cellular entities and cohesive cell-to-cell and cell-ECM interactions is obtained. In previous studies in our laboratory we generated cell sheets from human stem cells derived from adipose tissue (hASCs) that after transplantation in mice full-thickness excisional skin wounds, induced the formation of rete ridged-like structures and a significant number of hair follicles. Considering these results and envisioning the possibility of having cell sheets available off-the-shelf for immediate use in the clinic, to have these structures cryopreserved would be advantageous. The goal of this work was to define a cryopreservation methodology that allows the preservation of both cells viability and the properties of CS extracellular matrix (ECM). hASCs obtained from three different donors, were cultured in UP cell thermoresponsive dishes, to form hASCs-CS. Different cryopreservation conditions were considered, by varying the concentration of DMSO: i) standard condition with 10% of DMSO used to cryopreserve cell suspension; and ii) experimental condition with 5% of DMSO to reduce the cytotoxicity. The effect of cryopreservation conditions over cell viability was analysed after dissociation of the CS. The results showed that both cryopreservation conditions do not significantly affect cell viability. However the cytoskeleton of cells suffered alterations after cryopreservation in both conditions, which were more evident in the standard condition. It was also found that both cryopreservation conditions affect the integrity of the extracellular matrix of cell sheets, although it appears that a standard condition affecting more significantly. Furthermore, after cryopreservation the amount of total protein, decreased to half, which indicates that both conditions of cryopreservation affects the extracellular matrix content. Potentially, this result is associated with matrix proteins laminin, fibronectin and collagen type I. In fact, these proteins other than collagen was affected both molecular and protein level. Moreover we found the expression of their genes by polymerase chain reaction (PCR). Where the molecular level, the laminin gene is over expressed in both the cryopreservation conditions, the fibronectin gene only in experimental condition and collagen gene does not change significantly in both the cryopreservation conditions. Whereas the properties of mesenchymal cells that comprise the cell sheets are determining the results previously reported, the expression of typical markers following cryopreservation was examined at the genetic and protein level using PCR and flow cytometry, respectively. Based on the results obtained, showing that extracellular matrix is significantly affected by cryopreservation, is to experiment with different protocols and different methods of cryopreservation. In order to obtain a better preservation of the structural integrity of the cell sheet, and thus ensuring its functionality after transplantation. With this thesis, it was possible to open routes to target a suitable cryopreservation methodology applied to hASCs-CS, which enables an off-the-shelf TE and RM strategy

Colisão de direito fundamentais: o princípio da concordância prática de Konrad Hesse na ADI 4.815

A presente monografia tem como objetivo analisar a fundamentação dos votos proferidos pelos Ministros do Supremo Tribunal Federal no julgamento da Ação Direta de Inconstitucionalidade 4815, de relatoria da Ministra Cármen Lúcia, objetivando responder se o princípio da concordância prática teve as suas premissas observadas de modo adequado. Nesse processo, será demonstrada a necessidade de se adotar uma metodologia para resolução de conflitos entre direitos fundamentais, sendo proposto por esse trabalho o uso do princípio da concordância prática aliado à técnica de ponderação. Desse modo, os conceitos centrais do princípio e da técnica citada irão ser estudados para moldar a base das críticas que serão feitas às diversas fundamentações lógico-jurídicas construídas pelos Ministros. Para isso, primeiramente, o conceito de direitos fundamentais deve ser compreendido. É necessário abordar a sua natureza normativa para que se possa entender a perspectiva de Robert Alexy, ao caracterizar princípios como mandamentos de otimização. A relevância da pretensão que uma norma de direito fundamental busca realizar há de ser entendida. Nessa linha, será questionado o papel da Constituição, sob a ótica de Konrad Hesse, quanto ao efeito vinculante de seus enunciados normativos. No mesmo passo, o princípio da concordância prática deve ter sua finalidade esclarecida. A importância de sua proposta e quais razões justificam a sua necessidade serão demonstradas. Igualmente, a técnica da ponderação possui papel significativo na presente análise e deve ser compreendida em suas diferentes etapas, que serão descritas no decorrer do trabalho. O aspecto central do presente estudo está na necessidade de se observar a coerência decisória e clareza nas justificativas que determinam um julgamento tão complexo como é o que envolve conflito entres direitos fundamentais

A regulação cooperada das aprendizagens

Dissertação de mest., Ensino do 1.º e 2.º Ciclos do Ensino Básico, Escola Superior de Educação e Comunicação, Unv. do Algarve, 2012O presente Relatório da Pratica de Ensino Supervisionada, realizado para a obtenção do grau de mestre em Ensino do 1.º e 2.º ciclos do Ensino Básico, está subordinado ao título “A regulação cooperada das aprendizagens”. Teve como principal objetivo analisar e compreender como é que no 1.º ciclo do Ensino Básico se utiliza o Plano Individual de Trabalho, instrumento que permite que os alunos, através da auto e hétero correção, desenvolvem as suas competências avaliativas. Tendo em vista o objetivo proposto, procedeu-se à análise documental do Projeto Curricular da turma onde realizámos a nossa Prática de Ensino Supervisionada, com a intenção de conhecer a perspetiva da professora cooperante quanto à função pedagógica atribuída ao PIT. Após aval da direção do agrupamento de escolas, foram realizadas entrevistas semiestruturadas à docente, a dois alunos e respetivos encarregados de educação, com a intenção de entender a visão dos atores educacionais, quanto ao trabalho pedagógico que a utilização do PIT permite. Para a concretização do capítulo sobre o percurso formativo do autor deste relatório foram analisadas reflexões individuais produzidas e extraídos excertos das reflexões efetuadas no decurso da Prática de Ensino Supervisionada (PES), tendo-se procedido à respetiva análise de conteúdo e categorização. Com este trabalho pretende-se demonstrar o nosso percurso formativo no decorrer da PES e evidenciar as potencialidades pedagógicas do PIT

Sorção e dessorção de glifosato em solos com distintos níveis de fósforo

The sorption of glyphosate by soils occurs due to the inner sphere complex formation with metals of soil oxides, which are related to the soil phosphate adsorption capacity. The aim of this study was to evaluate the effects of increasing rates of phosphorus on sorption and desorption of glyphosate in three soils with different mineralogical attributes. Soils were a Rhodic Kandiudalf, an Anionic Acrudox and a Typic Humaquept. Soil samples were amended with KH2PO4 at equivalent rates of 0; 1,000; 5,000; 20,000 and 50,000 kg ha-1 of P2O5, which are high from the agricultural point of view, but necessary in order to perform sorption and desorption studies. The experimental design consisted of a completely randomized factorial: 2 soils x 5 phosphorus rates and 3 replicates. For the sorption experiments, five glyphosate solutions were employed (0.42; 0.84; 1.68; 3.36 and 6.72 mg L-1), with a 14C radioactivity of 0.233 kBq mL-1. Four steps of the desorption procedure with CaCl2 0.01 mol L-1 and one extraction with Mehlich 3 were performed only at one concentration (0.84 mol L-1). Soil samples were afterwards biologically oxidized to establish the radioactive balance. Glyphosate competes with phosphorus for specific sorption sites, but this competition becomes important when phosphorus is present at rates higher than 1,000 mg dm-3. Moreover, a small amount of applied glyphosate was extracted (A sorção do glifosato no solo ocorre devido a formação de complexos de esfera interna com os metais dos óxidos, o que está relacionado à capacidade dos solos em adsorver fosfatos. Isto sugere que haja competição entre o herbicida e os íons fosfato pelos sítios de adsorção específica do solo. Com isso, o presente trabalho teve o objetivo de verificar a extensão do efeito de níveis crescentes de fósforo no solo na sorção e dessorção do glifosato em solos com diferentes atributos mineralógicos. Os solos foram Nitossolo Vermelho eutroférrico, Latossolo Amarelo ácrico e Gleissolo. Amostras dos solos foram incubadas com KH2PO4, por 30 dias, nas doses equivalentes a 0; 1000; 5000; 20000 e 50000 kg ha-1 de P2O5, que são muito altos do ponto de vista agronômico, mas necessário para estudos de sorção e dessorção. O delineamento experimental foi do tipo inteiramente casualizado, em arranjo fatorial 3 (solos) X 5 (níveis de fósforo no solo), com três repetições. No estudo da sorção foram utilizadas cinco concentrações do herbicida: 0,42; 0,84; 1,68; 3,36 e 6,72 mg L-1, com radioatividade (14C) de 0,233 kBq mL-1. Apenas para a concentração 0,84 mg L-1 foram feitas quatro dessorções com CaCl2 0,01 mol L-1 e uma extração com extrator Mehlich 3. Posteriormente, alíquotas do solo foram oxidadas em oxidador biológico para o fechamento do balanço de radioatividade. O glifosato compete com o fósforo pelos sítios de sorção específica no solo, mas essa competição somente é importante quando os níveis de P atingem valores superiores a 1000 mg dm-3. A extração do glifosato foi muito baixa e foi acrescida com aumento dos níveis de P no solo

Degradation and sorption of ametryne in two soils with vinasse application

Este trabalho teve o objetivo de avaliar os efeitos da adição de vinhaça nos processos de degradação e sorção do herbicida ametrina em solos das classes Terra Roxa Estruturada (TR) e Latossolo Vermelho-Amarelo (LV). No estudo da degradação foi instalado um experimento, em delineamento inteiramente casualizado arranjado em fatorial 2 (solos) x 3 (doses de vinhaça: 0, 100 e 200 m3 ha-1), que foi conduzido por 120 dias. A mineralização foi avaliada por radiorrespirometria. Após os 120 dias, o herbicida foi extraído do solo e detectado em "radio-scanner". Paralelamente, foi conduzido um ensaio para avaliação do efeito das doses de vinhaça juntamente com a ametrina na atividade microbiana, pH e C orgânico do solo. O experimento de sorção foi realizado com os mesmos tratamentos empregados no estudo de degradação, utilizando-se cinco concentrações do herbicida. A degradação da ametrina foi maior na presença de 100 m3 ha-1 de vinhaça. A adição do resíduo contribuiu para o aumento da atividade microbiana e do pH. A ametrina foi pouco sorvida nos dois solos, não apresentando influência da adição da vinhaça.The aim of this study was to evaluate the effects of vinasse (100 and 200 m3 ha-1) on the degradation and sorption of ametryne in Rhodudalf and Haplorthox soils. For the degradation study an experiment was carried out in a completely randomized design with a factorial experiment of 2 (soils) x 3 (vinasse doses: 0, 100 and 200 m3 ha-1), that was carried by 120 days. The mineralization was evaluated by radiorespirometry. At the end of the incubation (after 120 days), the herbicide was extracted from the soils and detected in the radio-scanner. In parallel, another experiment was carried out in order to evaluate the effect of the vinasse doses and herbicide on the microbial activity, pH and organic carbon content of the soil. The sorption experiment was carried out under the same conditions as the degradation study, with five herbicide concentrations. The ametryne degradation was higher in the presence of 100 m3 ha-1 of vinasse. The vinasse addition increased the microbial activity and the pH. The sorption of ametryne was low and not affected by vinasse

RESULTS FROM LATARJET SURGERY FOR TREATING TRAUMATIC ANTERIOR SHOULDER INSTABILITY ASSOCIATED WITH BONE EROSION IN THE GLENOID CAVITY, AFTER MINIMUM FOLLOW-UP OF ONE YEAR

ABSTRACTObjective: Evaluate the results from the Latarjet procedure in patients with anterior recurrent dislocation of the shoulder who present bone loss of the glenoid cavity greater than 25%. Methods: Twenty six male patients underwent the Latarjet procedure, The bone loss was evaluated by means of radiography using the Bernageau view and by means of CAT scan. The patients were evaluated with regard to range of motion, using the Rowe and UCLA scales, before and after the operation, and by radiographs to assess the presence of arthrosis, position and consolidation of the graft and positioning of the screws. Statistical analysis was used to assess whether there was any relationship between the number of episodes of dislocation and the presence of arthrosis, , and any relationship between arthrosis and limitations on lateral rotation. Differences in range of motion between the operated and unaffected sides and in the UCLA and Rowe scale. Results: The means for elevation and lateral rotation were statistically poorer on the operated side. The UCLA and Rowe scale showed that there was a statistically significant improvement in the clinical-functional results (P < 0.001 for both). There was a relationship between the number of episodes of dislocation and the presence of arthrosis, We also did not observe any correlation between limitations on lateral rotation and arthrosis. Conclusion: The Latarjet procedure is an efficient method for cases of severe erosion of the glenoid margin

MONITORAMENTO AMBIENTAL DO GLIFOSATO E DO SEU METABÓLITO (ÁCIDO AMINOMETILFOSFÔNICO) NA ÁGUA DE LAVOURA DE ARROZ IRRIGADO

Monitorou-se a presença do herbicida Glifosato e do seu metabólito, ácido aminometilfosfônico (AMPA), em amostras de águas coletadas em área orizícola, submetida a plantio direto. Níveis de Glifosato em concentrações acima do limite máximo permitido (7,0 µg/L) pela Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos (Environmental Protection Agency) foram detectados. A presença do metabólito AMPA, nas águas dos canais de irrigação, foi detectada até 120 dias após a aplicação (DAA). Pode-se dizer que determinado nível de segurança será alcançado nas águas de lançamento da granja para o Arroio Bretanhas, 120 DAA da formulação de Glifosato. Como não foi observada deserção do Glifosato em GLEYSSOLO HÁPLICO Ta Eutrófico pode-se inferir que a concentração do mesmo permaneceu como resíduo ligado. Assim, a dissipação do herbicida nesse solo pode ser reflexo, entre outros fatores, da formação de resíduo ligado, determinando desta forma o seu destino e/ou comportamento no ambiente. ENVIRONMENTAL MONITORING OF GLYPHOSATE AND ITS METABOLITE (AMINOMETHYLPHOSPHONIC ACID) IN TILLAGE WATER OF IRRIGABLE RICE Abstract Monitor the presence of the herbicide glyphosate and its metabolite, aminomethylphosphonic acid (AMPA), in samples of water collected in orizicole area, subject to direct plantation, was the objective of this study. Levels of glyphosate above the maximum permitted concentration limit (7.0 µg/L) were detected by the United States Environmental Protection Agency (EPA). The presence of the metabolite AMPA in irrigation channel water was detected up to 120 days after application (DAA). It can be deduced that a certain level of safety will be reached 120 DAA from formulation of glyphosate, for water from the Arroio Bretanhas farm. Since the desertion of glyphosate in a Gleyssolo Háplico Ta Eutrophic was not observed, it can be judged that the concentration of it remained as bonded residue. Thus, the dissipation of this herbicide in this soil can be a reflex of, among other factors, the formation of bonded residue, determining, in this manner, its destiny and/or behavior in the environment