Mapping insecticide resistance and characterization of resistance mechanisms in Anopheles arabiensis (Diptera: Culicidae) in Ethiopia

Background: The emergence and spread of insecticide resistance in the major African malaria vectors Anopheles gambiae (s.s.) and An. arabiensis may compromise the current vector control interventions and threatens the global malaria control and elimination efforts. Methods: Insecticide resistance was monitored in several study sites in Ethiopia from 2013 to 2015 using papers impregnated with discriminating concentrations of DDT, deltamethrin, bendiocarb, propoxur, malathion, fenitrothion and pirimiphos-methyl, following the WHO insecticide susceptibility test procedure. Mosquitoes sampled from different localities for WHO bioassay were morphologically identified as An. gambiae (s.l.) using standard taxonomic keys. Samples were identified to species using species-specific polymerase chain reaction (PCR) and screened for the presence of target site mutations L1014F, L1014S and N1575Y in the voltage gated sodium channel (VGSC) gene and G119S in the acethylcholinesterase (AChE) gene using allele-specific PCR. Biochemical assays were performed to assess elevated levels of acetylcholinesterases, carboxylcholinesterases, glutathione-S-transferases (GSTs) and cytochrome P450s monooxygenases in wild populations of An. arabiensis, compared to the fully susceptible Sekoru An. arabiensis laboratory strain. Results: Populations of An. arabiensis were resistant to DDT and deltamethrin but were susceptible to fenitrothion in all the study sites. Reduced susceptibility to malathion, pirimiphos-methyl, propoxur and bendiocarb was observed in some of the study sites. Knockdown resistance (kdr L1014F) was detected in all mosquito populations with allele frequency ranging from 42 to 91%. Elevated levels of glutathione-S-transferases (GSTs) were detected in some of the mosquito populations. However, no elevated levels of monooxygenases and esterases were detected in any of the populations assessed. Conclusions: Anopheles arabiensis populations from all surveyed sites in Ethiopia exhibited resistance against DDT and pyrethroids. Moreover, some mosquito populations exhibited resistance to propoxur and possible resistance to bendiocarb. Target site mutation kdr L1014F was detected in all mosquito populations while elevated levels of glutathione-S-transferases (GSTs) was detected in some mosquito populations. The reduced susceptibility of An. arabiensis to propoxur and bendiocarb, which are currently used for indoor residual spraying (IRS) in Ethiopia, calls for continuous resistance monitoring, in order to plan and implement evidence based insecticide resistance management

Reduced proinsecticide activation by cytochrome P450 confers coumaphos resistance in the major bee parasite Varroa destructor

Varroa destructor is one of the main problems in modern beekeeping. Highly selective acaricides with low toxicity to bees are used internationally to control this mite. One of the key acaricides is the organophosphorus (OP) proinsecticide coumaphos, that becomes toxic after enzymatic activation inside Varroa. We show here that mites from the island Andros (AN-CR) exhibit high levels of coumaphos resistance. Resistance is not mediated by decreased coumaphos uptake, target-site resistance, or increased detoxification. Reduced proinsecticide activation by a cytochrome P450 enzyme was the main resistance mechanism, a powerful and rarely encountered evolutionary solution to insecticide selection pressure. After treatment with sublethal doses of [14C] coumaphos, susceptible mite extracts had substantial amounts of coroxon, the activated metabolite of coumaphos, while resistant mites had only trace amounts. This indicates a suppression of the P450 (CYP)-mediated activation step in the AN-CR mites. Bioassays with coroxon to bypass the activation step showed that resistance was dramatically reduced. There are 26 CYPs present in the V. destructor genome. Transcriptome analysis revealed overexpression in resistant mites of CYP4DP24 and underexpression of CYP3012A6 and CYP4EP4. RNA interference of CYP4EP4 in the susceptible population, to mimic underexpression seen in the resistant mites, prevented coumaphos activation and decreased coumaphos toxicity

A Simple Colorimetric Assay for Specific Detection of Glutathione-S Transferase Activity Associated with DDT Resistance in Mosquitoes

Aedes mosquitoes transmit many human viral pathogens including dengue, yellow fever and chikungunya. Most of these pathogens have no specific treatment or vaccine and hence their control is reliant on controlling the mosquito vectors, which usually involves the use of insecticides. In order to prevent the alarming prospect of mosquito control failure due to the rapid selection and spread of insecticide resistance in several mosquito populations worldwide, it is essential that effective resistance management strategies are implemented and adhered to. The development of simple diagnostic tests for the early identification and monitoring of resistance is an important prerequisite for this task. Here, we describe the development of a simple colorimetric test for the detection of GSTE2-2/DDTase-based resistance in individual mosquitoes. The novel assay combines the most desirable features of specificity and sensitivity with the low cost and ease of use required for a routine test in endemic countries. It can have direct application in routine vector monitoring as a resistance indicator and help improve the sustainability of insecticide based control strategies

Use of insecticide quantification kits to investigate the quality of spraying and decay rate of bendiocarb on different wall surfaces in Kagera region, Tanzania

Background Bendiocarb was introduced for the first time for Indoor Residual Spraying (IRS) in Tanzania in 2012 as part of the interim national insecticide resistance management plan. This move followed reports of increasingly alarming levels of pyrethroid resistance across the country. This study used the insecticide quantification kit (IQK) to investigate the intra-operational IRS coverage and quality of spraying, and decay rate of bendiocarb on different wall surfaces in Kagera region. Methods To assess intra-operational IRS coverage and quality of spraying, 104 houses were randomly selected out of 161,414 sprayed houses. A total of 509 samples (218 in Muleba and 291 in Karagwe) were obtained by scraping the insecticide samples from wall surfaces. To investigate decay rate, 66 houses (36 in Muleba and 30 in Karagwe) were selected and samples were collected monthly for a period of five months. Laboratory testing of insecticide concentration was done using IQKTM [Innovative Vector Control Consortium]. Results Of the 509 samples, 89.5% met the World Health Organization (WHO) recommended concentration (between 100–400 mg/m2) for IRS target dosage. The proportion of samples meeting WHO standards varied between Karagwe (84.3%) and Muleba (96.3%) (p < 0.001). Assessment of quality of spraying at house level revealed that Muleba (84.8%) had a significantly higher proportion of households that met the expected target dosage (100–400 mg/m2) compared to Karagwe (68.9%) (p < 0.001). The quality of spraying varied across different wall substrates in both districts. Evaluation of bendiocarb decay showed that the proportion of houses with recommended concentration declined from 96.9%, 93.5% and 76.2% at months one, two, and three post IRS, respectively (p-trend = 0.03). The rate of decay increased in the fourth and fifth month post spraying with only 55.9% and 26.3% houses meeting the WHO recommendations, respectively. Conclusion IQK is an important tool for assessing IRS coverage and quality of spraying. The study found adequate coverage of IRS; however, residual life of bendiocarb was observed to be three months. Results suggest that in order to maintain the recommended concentrations with bendiocarb, a second spray cycle should be carried out after three months

Χαρτογράφηση των θέσεων σύζευξης των οπιοειδών υποδοχέων με τις G πρωτεΐνες και τους τελεστές τους

Σε μια προσπάθεια να κατασκευαστούν εξειδικευμένοι αναστολείς ή ενεργοποιητές της κυτταρικής σηματοδότησης των οπιοειδών υποδοχέων, αλλά και άλλων υποδοχέων που συζεύγνυνται με G πρωτεΐνες και χρησιμοποιούν τις ίδιες με τους οπιοειδείς Gi/Go πρωτεΐνες δημιουργήσαμε ένα μικρογονίδιο που κωδικοποιεί την τρίτη ενδοκυτταρική θηλιά του δ- οπιοειδούς υποδοχέα (δ-i3L). Επιπλέον κατασκευάσαμε ένα πολυκλωνικό αντίσωμα που αναγνωρίζει τους οπιοειδείς υποδοχείς. Με το συγκεκριμένο μικρογονίδιο επιμολύναμε κύτταρα θηλαστικών που εξέφραζαν και τους οπιοειδείς υποδοχείς και διαπιστώσαμε ότι το δ-i3L αναγνωρίζει και αλληλεπιδρά αφενός με τους οπιοειδείς υποδοχείς και αφετέρου με τις Go, αλλά δεν συνδέεται με τις Gs πρωτεΐνες. Με μελέτες θερμού και ψυχρού κορεσμού βρήκαμε ότι η παρουσία του δ-i3L δεν επηρεάζει την συγγένεια πρόσδεσης (kd) αγωνιστών και ανταγωνιστών στους οπιοειδείς υποδοχείς αλλά τους οδηγεί στην κατάσταση χαμηλής συγγένειας πρόσδεσης. Όσον αφορά την ενεργοποίηση των G πρωτεϊνών, με τα πειράματα μας αποδείξαμε ότι η παρουσία του δ-i3L στα κύτταρα που εξέφραζαν τους υποδοχείς είχε σαν συνέπεια να μην ενεργοποιούνται οι Gi/Go πρωτεΐνες ούτε από τους ομόλογους με την τρίτη ενδοκυτταρική θηλιά οπιοειδείς αλλά ούτε και από τους ετερόλογους α₂-αδρενεργικούς υποδοχείς. Στο επίπεδο των τελεστών διαπιστώσαμε ότι η έκφραση του δ-i3L μικρογονιδίου είχε σαν αποτέλεσμα την παρεμπόδιση της δράσης της αδενυλικής κυκλάσης μετά από ενεργοποίηση των οπιοειδών και του a₂-AR υποδοχέα, ενώ δεν είχε καμία επίδραση στην δράση της αδενυλικής κυκλάσης μετά από ενεργοποίηση του β₂- αδρενεργικού υποδοχέα ο οποίος αλληλεπιδρά με τις Gs πρωτεΐνες, γεγονός που ενισχύει την υπόθεση μας ότι το δ-i3L μικρογονίδιο στοχεύει ειδικά στις Gi/Go πρωτεΐνες και όχι στον ίδιο τον τελεστή. Η χρήση του μεταλλαγμένου R261 Aδ-i3L μικρογονιδίου στις μελέτες ενεργοποίησης της αδενυλικής κυκλάσης μας έδειξε ότι η αργινίνη 261 δεν είναι το καθοριστικό αμινοξύ για την αλληλεπίδραση υποδοχέα-G πρωτεΐνης. Μελετώντας την δράση του δ-i3L στην ενεργοποίηση της φωσφολιπάσης C, που είναι ένας άλλος τελεστής των οπιοειδών, διαπιστώσαμε ότι η ενεργοποίηση της PLC και η απελευθέρωση του Ca²⁺ από τους οπιοειδείς υποδοχείς παρεμποδίζεται στα κύτταρα που εκφράζουν και το δ-i3L μικρογονίδιο, ενώ δεν παρατηρήθηκε παρεμπόδιση στην ενεργοποίηση της PLC από τον Μ₁-μουσκαρινικό υποδοχέα που ως γνωστόν μετάγει το σήμα του μέσω των Gq πρωτεϊνών. Τέλος, το δ-i3L μικρογονίδιο χρησιμοποιήθηκε προκειμένου να μελετηθεί ο μηχανισμός ενεργοποίησης των ERK1/2 κινασών τόσο από τους οπιοειδείς όσο και από τον α₂-αδρενεργικό και τον EGF υποδοχέα. Διαπιστώσαμε ότι η φωσφορυλίωση των ERK1/2 κινασών από τους δ- και μ- οπιοειδείς υποδοχείς περιλαμβάνει την συμμετοχή των α υπομονάδων των G πρωτεϊνών και η ενεργοποίηση αυτή παρεμποδίζεται από την παρουσία του δ-i3L μικρογονιδίου καθώς και μετά από κατεργασία των κυττάρων με ΡΤΧ. Το δ-i3L μικρογονίδιο δεν έχει καμία επίδραση στην ενεργοποίηση των ERK1/2 κινασών από τον α₂-αδρενεργικό υποδοχέα, γεγονός που υποδηλώνει την ενδεχόμενη συμμετοχή άλλων πρωτεϊνών όπως π.χ. οι Gβγ υπομονάδες. Επιπλέον, η μηδενική επίδραση του δ-i3L μικρογονιδίου στην φωσφορυλίωση των ERK1/2 κινασών μετά από ενεργοποίηση του EFG υποδοχέα φανερώνει ότι στο συγκεκριμένο σηματοδοτικό μονοπάτι δεν συμμετέχουν οι α υπομονάδες των Gi/Go πρωτεϊνών. Συμπερασματικά τα πειραματικά μας δεδομένα μας υποστηρίζουν ότι το δ-i3L μικρογονίδιο είναι ένα εξειδικευμένο μοριακό εργαλείο που μπορεί να χρησιμοποιηθεί σαν πιθανός παρεμποδιστής της σηματοδότησης όχι μόνο των οπιοειδών αλλά και άλλων υποδοχέων οι οποίοι συζεύγνυνται με τον ίδιο Gi/Go πληθυσμό των G πρωτεϊνών