Die strukturelle und funktionelle Evolution des G-Protein-gekoppelten Rezeptors GPR34

Gegenstand der Arbeit ist eine umfassende Charakterisierung von Struktur und Funktion des G-Protein-gekoppelten Rezeptors GPR34 auf genomischer, mRNA und Proteinebene, die mögliche Rückschlüsse auf physiologische Funktionen oder den natürlichen Agonisten zulassen. Dazu wurde die genomische Organisation des GPR34 in Mensch, Maus und Ratte analysiert und festgestellt, dass neben der intronlosen kodierenden Sequenz auch der 5´-Bereich des GPR34 mit seiner nicht-kodierenden Intron-Exon-Struktur stark konserviert ist. Es wurden in der Ratte und der Maus mindestens zwei, beim Menschen ein putativer Transkriptionsstart identifiziert. Beim Menschen konnte ein kryptisches Intron innerhalb der kodierenden Sequenz des GPR34 gefunden werden, was zu einer Verkürzung des N-Terminus um 47 Aminosäuren führt. Auf der Transkriptionsebene wurde der GPR34 und der GPR34-like Rezeptor im Haushuhn (Gallus gallus) und die GPR34-Expression in der Ratte mittels quantitativer RT-PCR analysiert und die ubiquitäre Gewebeverteilung des Rezeptors bestätigt. Beim menschlichen GPR34 konnte festgestellt werden, dass die fünf putativen Translationsstarts innerhalb der kodierenden Sequenz auch als solche funktionstüchtig sind und der zweite Translationsstart bevorzugt genutzt wird. Die genetische Variabilität des GPR34 in der menschlichen Population ist sehr gering. Es konnte innerhalb einer weltweiten DNA-Probensammlung nur ein einziges Mal eine Mutation in der kodierenden Sequenz lokalisiert werden. Mithilfe des während dieser Arbeit entstandenen Mausmodelles ist eine weitere Charakterisierung der physiologischen Relevanz des GPR34 möglich.:Bibliographische Beschreibung 4 1 Einleitung 5 1.1 Das GPCR-Repertoire in Vertebraten 5 1.1.1 Signaltransduktion 5 1.1.2 GPCR - Klassifikation 6 1.1.3 „Orphan“ G-Protein-gekoppelte Rezeptoren 7 1.2 Die Familie der Purin- und Pyrimidinrezeptoren 8 1.2.1 Strukturelle Besonderheiten der P2Y-Rezeptoren 8 1.2.2 Rolle der Nukleotidrezeptoren im kardiovaskulären System 9 1.3 GPR34 - ein „orphan“ G-Protein-gekoppelter Rezeptor 10 1.3.1 Gewebeexpression des GPR34 10 1.3.2 Genomische Organisation und Proteinstruktur des GPR34 11 1.3.3 Lysophosphatidyl-L-Serin – möglicher Agonist des GPR34 12 1.4 GPR34–like ein verwandter „orphan“ G-Protein-gekoppelter Rezeptor 15 2 Zielstellung 16 3 Originalarbeit 17 4 Ergänzungen zur vorgenannten Originalarbeit 29 4.1 Vergleich der Expression von GPR34 und GPR34-like Rezeptoren im Huhn 29 4.2 Populationsgenetische Untersuchungen des humanen GPR34 30 5 Zusammenfassung der Arbeit 31 5.1 Spezifische Promotoraktivität in verschiedenen Organen der Maus 31 5.2 Alternative Translationsstarts im hGPR34 32 5.3 Geringe allelische Variabilität des GPR34-Gens in der menschlichen Population 33 5.4 Ubiquitäre Expression von GPR34 und GPR34-like Rezeptoren 34 5.5 Etabliertes Mausmodell ist vital und fortpflanzungsfähig 34 6 Referenzen 36 Anlagen 38 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 38 Eigene Publikationen 39 Danksagung 4

Structural and functional evolution of the P2Y12-like receptor group

Metabotropic pyrimidine and purine nucleotide receptors (P2Y receptors) belong to the superfamily of G protein-coupled receptors (GPCR). They are distinguishable from adenosine receptors (P1) as they bind adenine and/or uracil nucleotide triphosphates or diphosphates depending on the subtype. Over the past decade, P2Y receptors have been cloned from a variety of tissues and species, and as many as eight functional subtypes have been characterized. Most recently, several members of the P2Y12-like receptor group, which includes the clopidogrel-sensitive ADP receptor P2Y12, have been deorphanized. The P2Y12-like receptor group comprises several structurally related GPCR which, however, display heterogeneous agonist specificity including nucleotides, their derivatives, and lipids. Besides the established function of P2Y12 in platelet activation, expression in macrophages, neuronal and glial cells as well as recent results from functional studies implicate that several members of this group may have specific functions in neurotransmission, inflammation, chemotaxis, and response to tissue injury. This review focuses specifically on the structure-function relation and shortly summarizes some aspects of the physiological relevance of P2Y12-like receptor members

Die strukturelle und funktionelle Evolution des G-Protein-gekoppelten Rezeptors GPR34

Gegenstand der Arbeit ist eine umfassende Charakterisierung von Struktur und Funktion des G-Protein-gekoppelten Rezeptors GPR34 auf genomischer, mRNA und Proteinebene, die mögliche Rückschlüsse auf physiologische Funktionen oder den natürlichen Agonisten zulassen. Dazu wurde die genomische Organisation des GPR34 in Mensch, Maus und Ratte analysiert und festgestellt, dass neben der intronlosen kodierenden Sequenz auch der 5´-Bereich des GPR34 mit seiner nicht-kodierenden Intron-Exon-Struktur stark konserviert ist. Es wurden in der Ratte und der Maus mindestens zwei, beim Menschen ein putativer Transkriptionsstart identifiziert. Beim Menschen konnte ein kryptisches Intron innerhalb der kodierenden Sequenz des GPR34 gefunden werden, was zu einer Verkürzung des N-Terminus um 47 Aminosäuren führt. Auf der Transkriptionsebene wurde der GPR34 und der GPR34-like Rezeptor im Haushuhn (Gallus gallus) und die GPR34-Expression in der Ratte mittels quantitativer RT-PCR analysiert und die ubiquitäre Gewebeverteilung des Rezeptors bestätigt. Beim menschlichen GPR34 konnte festgestellt werden, dass die fünf putativen Translationsstarts innerhalb der kodierenden Sequenz auch als solche funktionstüchtig sind und der zweite Translationsstart bevorzugt genutzt wird. Die genetische Variabilität des GPR34 in der menschlichen Population ist sehr gering. Es konnte innerhalb einer weltweiten DNA-Probensammlung nur ein einziges Mal eine Mutation in der kodierenden Sequenz lokalisiert werden. Mithilfe des während dieser Arbeit entstandenen Mausmodelles ist eine weitere Charakterisierung der physiologischen Relevanz des GPR34 möglich.:Bibliographische Beschreibung 4 1 Einleitung 5 1.1 Das GPCR-Repertoire in Vertebraten 5 1.1.1 Signaltransduktion 5 1.1.2 GPCR - Klassifikation 6 1.1.3 „Orphan“ G-Protein-gekoppelte Rezeptoren 7 1.2 Die Familie der Purin- und Pyrimidinrezeptoren 8 1.2.1 Strukturelle Besonderheiten der P2Y-Rezeptoren 8 1.2.2 Rolle der Nukleotidrezeptoren im kardiovaskulären System 9 1.3 GPR34 - ein „orphan“ G-Protein-gekoppelter Rezeptor 10 1.3.1 Gewebeexpression des GPR34 10 1.3.2 Genomische Organisation und Proteinstruktur des GPR34 11 1.3.3 Lysophosphatidyl-L-Serin – möglicher Agonist des GPR34 12 1.4 GPR34–like ein verwandter „orphan“ G-Protein-gekoppelter Rezeptor 15 2 Zielstellung 16 3 Originalarbeit 17 4 Ergänzungen zur vorgenannten Originalarbeit 29 4.1 Vergleich der Expression von GPR34 und GPR34-like Rezeptoren im Huhn 29 4.2 Populationsgenetische Untersuchungen des humanen GPR34 30 5 Zusammenfassung der Arbeit 31 5.1 Spezifische Promotoraktivität in verschiedenen Organen der Maus 31 5.2 Alternative Translationsstarts im hGPR34 32 5.3 Geringe allelische Variabilität des GPR34-Gens in der menschlichen Population 33 5.4 Ubiquitäre Expression von GPR34 und GPR34-like Rezeptoren 34 5.5 Etabliertes Mausmodell ist vital und fortpflanzungsfähig 34 6 Referenzen 36 Anlagen 38 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 38 Eigene Publikationen 39 Danksagung 4

Die strukturelle und funktionelle Evolution des G-Protein-gekoppelten Rezeptors GPR34

Gegenstand der Arbeit ist eine umfassende Charakterisierung von Struktur und Funktion des G-Protein-gekoppelten Rezeptors GPR34 auf genomischer, mRNA und Proteinebene, die mögliche Rückschlüsse auf physiologische Funktionen oder den natürlichen Agonisten zulassen. Dazu wurde die genomische Organisation des GPR34 in Mensch, Maus und Ratte analysiert und festgestellt, dass neben der intronlosen kodierenden Sequenz auch der 5´-Bereich des GPR34 mit seiner nicht-kodierenden Intron-Exon-Struktur stark konserviert ist. Es wurden in der Ratte und der Maus mindestens zwei, beim Menschen ein putativer Transkriptionsstart identifiziert. Beim Menschen konnte ein kryptisches Intron innerhalb der kodierenden Sequenz des GPR34 gefunden werden, was zu einer Verkürzung des N-Terminus um 47 Aminosäuren führt. Auf der Transkriptionsebene wurde der GPR34 und der GPR34-like Rezeptor im Haushuhn (Gallus gallus) und die GPR34-Expression in der Ratte mittels quantitativer RT-PCR analysiert und die ubiquitäre Gewebeverteilung des Rezeptors bestätigt. Beim menschlichen GPR34 konnte festgestellt werden, dass die fünf putativen Translationsstarts innerhalb der kodierenden Sequenz auch als solche funktionstüchtig sind und der zweite Translationsstart bevorzugt genutzt wird. Die genetische Variabilität des GPR34 in der menschlichen Population ist sehr gering. Es konnte innerhalb einer weltweiten DNA-Probensammlung nur ein einziges Mal eine Mutation in der kodierenden Sequenz lokalisiert werden. Mithilfe des während dieser Arbeit entstandenen Mausmodelles ist eine weitere Charakterisierung der physiologischen Relevanz des GPR34 möglich.:Bibliographische Beschreibung 4 1 Einleitung 5 1.1 Das GPCR-Repertoire in Vertebraten 5 1.1.1 Signaltransduktion 5 1.1.2 GPCR - Klassifikation 6 1.1.3 „Orphan“ G-Protein-gekoppelte Rezeptoren 7 1.2 Die Familie der Purin- und Pyrimidinrezeptoren 8 1.2.1 Strukturelle Besonderheiten der P2Y-Rezeptoren 8 1.2.2 Rolle der Nukleotidrezeptoren im kardiovaskulären System 9 1.3 GPR34 - ein „orphan“ G-Protein-gekoppelter Rezeptor 10 1.3.1 Gewebeexpression des GPR34 10 1.3.2 Genomische Organisation und Proteinstruktur des GPR34 11 1.3.3 Lysophosphatidyl-L-Serin – möglicher Agonist des GPR34 12 1.4 GPR34–like ein verwandter „orphan“ G-Protein-gekoppelter Rezeptor 15 2 Zielstellung 16 3 Originalarbeit 17 4 Ergänzungen zur vorgenannten Originalarbeit 29 4.1 Vergleich der Expression von GPR34 und GPR34-like Rezeptoren im Huhn 29 4.2 Populationsgenetische Untersuchungen des humanen GPR34 30 5 Zusammenfassung der Arbeit 31 5.1 Spezifische Promotoraktivität in verschiedenen Organen der Maus 31 5.2 Alternative Translationsstarts im hGPR34 32 5.3 Geringe allelische Variabilität des GPR34-Gens in der menschlichen Population 33 5.4 Ubiquitäre Expression von GPR34 und GPR34-like Rezeptoren 34 5.5 Etabliertes Mausmodell ist vital und fortpflanzungsfähig 34 6 Referenzen 36 Anlagen 38 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 38 Eigene Publikationen 39 Danksagung 4

Identification by site-directed mutagenesis of amino acids contributing to ligand-binding specificity or signal transduction properties of the human FP prostanoid receptor.

Prostanoid receptors belong to the class of heptahelical plasma membrane receptors. For the five prostanoids, eight receptor subtypes have been identified. They display an overall sequence similarity of roughly 30%. Based on sequence comparison, single amino acids in different subtypes of different species have previously been identified by site-directed mutagenesis or in hybrid receptors that appear to be essential for ligand binding or G-protein coupling. Based on this information, a series of mutants of the human FP receptor was generated and characterized in ligand-binding and second-messenger-formation studies. It was found that mutation of His-81 to Ala in transmembrane domain 2 and of Arg-291 to Leu in transmembrane domain 7, which are putative interaction partners for the prostanoid's carboxyl group, abolished ligand binding. Mutants in which Ser-263 in transmembrane domain 6 or Asp-300 in transmembrane domain 7 had been replaced by Ala or Gln, respectively, no longer discriminated between prostaglandins PGF(2alpha) and PGD(2). Thus distortion of the topology of transmembrane domains 6 and 7 appears to interfere with the cyclopentane ring selectivity of the receptor. PGF(2alpha)-induced inositol formation was strongly reduced in the mutant Asp-300Gln, inferring a role for this residue in agonist-induced G-protein activation

Altered Immune Response in Mice Deficient for the G Protein-coupled Receptor GPR34*

The X-chromosomal GPR34 gene encodes an orphan Gi protein-coupled receptor that is highly conserved among vertebrates. To evaluate the physiological relevance of GPR34, we generated a GPR34-deficient mouse line. GPR34-deficient mice were vital, reproduced normally, and showed no gross abnormalities in anatomical, histological, laboratory chemistry, or behavioral investigations under standard housing. Because GPR34 is highly expressed in mononuclear cells of the immune system, mice were specifically tested for altered functions of these cell types. Following immunization with methylated BSA, the number of granulocytes and macrophages in spleens was significantly lower in GPR34-deficient mice as in wild-type mice. GPR34-deficient mice showed significantly increased paw swelling in the delayed type hypersensitivity test and higher pathogen burden in extrapulmonary tissues after pulmonary infection with Cryptococcus neoformans compared with wild-type mice. The findings in delayed type hypersensitivity and infection tests were accompanied by significantly different basal and stimulated TNF-α, GM-CSF, and IFN-γ levels in GPR34-deficient animals. Our data point toward a functional role of GPR34 in the cellular response to immunological challenges