Integration of fault tolerance and hardware redundancy techniques into the design of mobile platforms

This work addresses the development of a fault-tolerant mobile platform. Fault-tolerant mechanical system design is an emerging technology that attempts to build highly reliable systems by incorporating hardware and software architectures. For this purpose, previous work in fault-tolerant were reviewed. Alternate architectures were evaluated to maximize the fault tolerance capabilities of the driving and steering systems of a mobile platform. The literature review showed that most of the research work on fault tolerance has been done in the area of kinematics and control systems of robotic arms. Therefore, hardware redundancy and fault tolerance in mobile robots is an area to be researched. The prototype constructed as part of this work demonstrated basic principles and uses of a fault-tolerant mechanism, and is believed to be the first such system in its class. It is recommended that different driving and steering architectures, and the fault-tolerant controllers\u27 performance be tested on this prototype

Optimierung der Transportbedingungen von mesenchymalen Stromazellen für die klinisch-therapeutische Anwendung am Pferd

Einleitung: Mesenchymale Stromazellen (MSC) werden zunehmend für klinische Anwendungen bei Pferdepatienten eingesetzt. Für die MSC-Isolation und Expansion ist ein Laborschritt obligatorisch, danach werden die Zellen an den teilnehmenden Tierarzt zurückgesandt. Die Erhaltung der biologischen Eigenschaften von MSCs bzw. die Erhaltung der Qualität der MSCs ist für den Erfolg der Therapie während dieses Transports von größter Bedeutung. Ziele der Untersuchung: Das Ziel der Studie war es, transportbezogene Parameter (Transportbehälter, Medien, Temperatur, Zeit, Zellkonzentration) zu vergleichen, die potenziell Einfluss auf die Eigenschaften der in Kultur expandierten MSC während des Transportes in Suspension haben können. Material und Methoden: Diese Studie wurde in drei Teile geteilt, in welchen (I) fünf verschiedene Transportbehälter (Kryotube, zwei Arten von Plastikspritzen, Glasspritze, CellSeal), (II) sieben verschiedene Transportmedien, vier Temperaturen (4 °C gegen Raumtemperatur, - 20 °C vs. - 80 °C), zwei verschiedene Zeitrahmen (24 h gegen 48 h im positiven Temperaturbereich, 48 h gegen 72 h im negativen Temperaturbereich) und (III) drei MSC-Konzentrationen (5 x 106, 10 x 106, 20 x 106 MSC/ml) für den positiven und negativen Temperaturbereich verglichen wurden. Jeder Teil der Studie wurde unter Verwendung von Proben von sechs Pferden (n = 6) ausgewertet und Differenzierungsprotokolle (adipogene, osteogene und chondrogene) sowie Untersuchung der Vitalität und Proliferationsfähigkeit der MSC wurden für jeden Teil der Studie in doppeltem Einsatz bzw. verdoppelt bestimmt. Die Ergebnisse wurden als Median und mittlerer Interquartilabstand (IQR) dargestellt (p ≤ 0,05). Eine Anpassung des Signifikanzniveaus bei multiplen Vergleichen wurde mittels Bonferroni- Korrektur durchgeführt. Die Überprüfung der Daten auf Normalverteilung erfolgte mittels Shapiro- Wilk-Test. Ergebnisse: In Teil I der Studie lieferten die Spritzenmodelle die höheren Werte hinsichtlich des Endvolumens und gleichzeitig erzielte die Glasspritze die beste Zellvitalität. Dieser Behälter wurde für die nachfolgenden Teile der Studie ausgewählt. In Teil II der Studie wurde die höchste Zelllebensfähigkeit mit autologen Knochenmarküberständen als Transportmedium bei 4 °C für 24 h beobachtet (70,6 % gegenüber der Kontrollgruppe 75,3 %). Im Gegensatz dazu war die Lebensfähigkeit für alle Gefrierprotokolle bei -20 °C oder -80 °C, insbesondere bei Knochenmarküberstand oder Plasma und DMSO, unannehmbar niedrig (< 40 %). In Teil III der Studie zeigten die untersuchte Zellkonzentrationen keinen Einfluss auf die ausgewerteten Parameter. Diskussion: In dieser Studie wurden keine signifikanten Unterschiede festgestellt, möglicherweise war dies durch die hohe Anzahl von Transportbedingungen, welche gleichzeitig verglichen wurden, sowie die Anzahl der Stichproben (n=6) bedingt. Jedoch ergaben sich wichtige Hinweise zur Verbesserung des Transports der MSC für die klinisch-therapeutische Anwendung. Eine Einschränkung der chondrogenen Differenzierungsfähigkeit der MSC trat unter allen untersuchten Bedingungen auf. Im Vergleich zu früheren Pferdestudien wurde eine niedrigere Lebensfähigkeit der MSC nach dem Auftauen beobachtet. Mögliche Ursachen können unterschiedliche Protokolle beim Einfrieren und Auftauen der MSC sowie die große Anzahl an gleichzeitig bearbeiteten Proben sein. Zukünftige Studien könnten die möglicherweise negativen Auswirkungen des Transports auf die chondrogene Differenzierung klären. Schlussfolgerung: Trotz fehlender signifikanter Unterschiede ist eine deutliche Tendenz erkennbar, dass MSC aus dem Knochenmark schnellstmöglich bei 4 °C in autologem bzw. eigenem Knochenmark-Überstand aus dem Labor zum Patienten, in dem in dieser Studie untersuchten Glasspritzenmodell, zurückgesandt werden sollten.:Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung ...................................................................................................................1 2 Literaturübersicht ......................................................................................................2 2.1 Der Ursprung mesenchymaler Stromazellen .........................................................2 2.2 Klassifizierung der MSC .........................................................................................3 2.3 Charakterisierung der MSC ....................................................................................4 2.4 Quellen von MSC ...................................................................................................4 2.5 Ablauf der MSC-Therapie beim Pferd ....................................................................4 2.6 Empfehlungen der EMA zur klinisch-therapeutischen Anwendung zellbasierter Therapien ..........................................................................................6 2.7 Rechtliche Aspekte ................................................................................................7 2.8 Tetrazoliumsalze zur Bestimmung der Zellaktivität (WST-1-Reagenztest) .............9 2.9 Zielstellung dieser Arbeit.......................................................................................10 2.10 Hypothese dieser Arbeit......................................................................................10 3 Material und Methoden............................................................................................11 3.1 Versuchspferde ....................................................................................................11 3.2 Allgemeine Schritte für die gesamte Studie ........................................................11 3.2.1 Knochenmarkentnahme beim Pferd .................................................................11 3.2.2 Blutentnahme beim Pferd ..................................................................................13 3.2.3 Probenverarbeitung und Zellkultur ....................................................................13 3.2.4 Isolation der MSC ..............................................................................................14 3.2.5 Bestimmung der Zellzahl ...................................................................................15 3.2.6 Expansion der MSC ..........................................................................................16 3.2.7 Kryokonservierung ............................................................................................16 3.2.8 Auftauen der MSC ............................................................................................16 3.2.9 Bestimmung der Zellvitalität .............................................................................17 3.2.10 Kumulative Populationsverdopplungen (kPV) der MSC ..................................18 3.2.11 Differenzierungspotentiale der MSC ...............................................................18 3.2.11.1 Differenzierung in Monolayer-Zellkultur für die adipogene und osteogene Linie ............................................................................................................................19 3.2.11.1.1 Adipogene Differenzierung ........................................................................19 3.2.11.1.2 Osteogene Differenzierung ........................................................................22 3.2.11.2 Chondrogene Differenzierung (dreidimensionales Modell) ...........................25 3.3 Studiendesign – allgemeine Darstellung ..............................................................32 3.3.1 Teil 1: Untersuchung zur Ermittlung des optimalen Transportbehälters ...........33 3.3.1.1 Studiendesign zum ersten Teil der Studie ......................................................33 3.3.1.2 Zeit0: Vorbereitung der Kontrolle ...................................................................33 3.3.1.3 Zeit0: Vorbereitung der Versuchsbedingungen nach 24 Stunden .................34 3.3.1.4 Transportbehälter ......................................................................................... 34 3.3.1.5 Zeit1: Auswertung der Transportbehälter nach 24 Stunden Inkubationszeit 35 3.3.2 Teil 2: Untersuchung zum optimalen Verhältnis von Medium-Temperatur-Zeit 36 3.3.2.1 Studiendesign zum zweiten Teil der Studie ................................................. 36 3.3.2.2 Untersuchungsbedingungen .........................................................................37 3.3.2.3 Auswertung der Kontrolle und der Konditionsbedingungen ........................ 37 3.3.3 Teil 3: Untersuchung zur optimalen Zellkonzentration ..................................... 38 3.3.3.1 Studiendesign zum dritten Teil der Studie .................................................... 38 3.3.3.2 Untersuchungsbedingungen ......................................................................... 39 3.3.3.3 Auswertung der Kontrolle und der Konditionsbedingungen ......................... 39 3.4 Statistische Auswertung ..................................................................................... 40 4 Ergebnisse ............................................................................................................. 41 4.1 Teil 1: Behälter .................................................................................................... 41 4.1.1 Evaluierung der Endvolumen pro Behälter ....................................................... 41 4.1.2 Evaluierung der Zellvitalität .............................................................................. 42 4.1.2.1 Evaluierung der Zellvitalität durch Trypanblau-Färbung ................................ 42 4.1.2.2 Evaluierung der Zellvitalität durch WST-1-Reagenztest ................................ 43 4.1.3 Proliferationsverhalten der MSC ...................................................................... 44 4.1.4 Evaluierung des Differenzierungspotentials der MSC ...................................... 45 4.1.4.1 Adipogene Differenzierung ............................................................................ 45 4.1.4.2 Osteogene Differenzierung ............................................................................ 47 4.1.4.3 Chondrogene Differenzierung ....................................................................... 49 4.2 Teil 2: Medium, Temperatur und Zeit .................................................................. 53 4.2.1 Evaluierung der Zellvitalität .............................................................................. 53 4.2.1.1 Evaluierung der Zellvitalität durch Trypanblau-Färbung ................................ 53 4.2.1.2 Evaluierung der Zellvitalität durch WST-1-Reagenztest ................................ 54 4.2.2 Proliferationsverhalten der MSC ...................................................................... 56 4.2.3 Evaluierung des Differenzierungspotentials der MSC ...................................... 58 4.2.3.1 Adipogene Differenzierung ............................................................................ 58 4.2.3.2 Osteogene Differenzierung ............................................................................ 59 4.2.3.3 Chondrogene Differenzierung ....................................................................... 61 4.3 Teil 3: Zellkonzentration ...................................................................................... 64 4.3.1 Evaluierung der Zellvitalität .............................................................................. 64 4.3.1.1 Evaluierung der Zellvitalität durch Trypanblau-Färbung ................................ 64 4.3.1.2 Evaluierung der Zellvitalität durch WST-1-Reagenztest ................................ 65 4.3.2 Proliferationsverhalten der MSC ...................................................................... 66 4.3.3 Evaluierung des Differenzierungspotentials der MSC ...................................... 67 4.3.3.1 Adipogene Differenzierung .......................................................................... 67 4.3.3.2 Osteogene Differenzierung ............................................................................ 69 4.3.3.3 Chondrogene Differenzierung ....................................................................... 71 5 Diskussion .............................................................................................................. 74 5.1 Zielsetzung der geplanten Durchführung ............................................................ 74 5.2 Diskussion zum Material ..................................................................................... 75 5.3 Vorversuche ........................................................................................................ 76 5.3.1 Inkubationsbedingungen ................................................................................. 76 5.3.2 Sechster Behälter ............................................................................................. 76 5.3.3 WST-1-Reagenztest ......................................................................................... 77 5.3.4 Adipogene Differenzierung ............................................................................... 77 5.3.5 Chondrogene Differenzierung .......................................................................... 78 5.3.6 Kryokonservierungsmedium in der Pferdereproduktionsmedizin..................... 79 5.3.7 Die Auswirkung von Druck auf die Zellmembran ............................................. 80 5.4 Diskussion der Ergebnisse und Vergleich mit der Literatur ................................ 80 5.4.1 Diskussion des ersten Teils der Studie............................................................. 80 5.4.2 Diskussion des zweiten Teils der Studie........................................................... 82 5.4.3 Diskussion des dritten Teils der Studie............................................................. 87 5.4.4 Schlussfolgerungen ..........................................................................................87 6 Zusammenfassung ................................................................................................ 89 7 Summary ............................................................................................................... 91 8 Literaturverzeichnis ................................................................................................ 9

The evolution of the ventilatory ratio is a prognostic factor in mechanically ventilated COVID-19 ARDS patients

Background: Mortality due to COVID-19 is high, especially in patients requiring mechanical ventilation. The purpose of the study is to investigate associations between mortality and variables measured during the first three days of mechanical ventilation in patients with COVID-19 intubated at ICU admission. Methods: Multicenter, observational, cohort study includes consecutive patients with COVID-19 admitted to 44 Spanish ICUs between February 25 and July 31, 2020, who required intubation at ICU admission and mechanical ventilation for more than three days. We collected demographic and clinical data prior to admission; information about clinical evolution at days 1 and 3 of mechanical ventilation; and outcomes. Results: Of the 2,095 patients with COVID-19 admitted to the ICU, 1,118 (53.3%) were intubated at day 1 and remained under mechanical ventilation at day three. From days 1 to 3, PaO2/FiO2 increased from 115.6 [80.0-171.2] to 180.0 [135.4-227.9] mmHg and the ventilatory ratio from 1.73 [1.33-2.25] to 1.96 [1.61-2.40]. In-hospital mortality was 38.7%. A higher increase between ICU admission and day 3 in the ventilatory ratio (OR 1.04 [CI 1.01-1.07], p = 0.030) and creatinine levels (OR 1.05 [CI 1.01-1.09], p = 0.005) and a lower increase in platelet counts (OR 0.96 [CI 0.93-1.00], p = 0.037) were independently associated with a higher risk of death. No association between mortality and the PaO2/FiO2 variation was observed (OR 0.99 [CI 0.95 to 1.02], p = 0.47). Conclusions: Higher ventilatory ratio and its increase at day 3 is associated with mortality in patients with COVID-19 receiving mechanical ventilation at ICU admission. No association was found in the PaO2/FiO2 variation

Effects of hospital facilities on patient outcomes after cancer surgery: an international, prospective, observational study

Background Early death after cancer surgery is higher in low-income and middle-income countries (LMICs) compared with in high-income countries, yet the impact of facility characteristics on early postoperative outcomes is unknown. The aim of this study was to examine the association between hospital infrastructure, resource availability, and processes on early outcomes after cancer surgery worldwide.Methods A multimethods analysis was performed as part of the GlobalSurg 3 study-a multicentre, international, prospective cohort study of patients who had surgery for breast, colorectal, or gastric cancer. The primary outcomes were 30-day mortality and 30-day major complication rates. Potentially beneficial hospital facilities were identified by variable selection to select those associated with 30-day mortality. Adjusted outcomes were determined using generalised estimating equations to account for patient characteristics and country-income group, with population stratification by hospital.Findings Between April 1, 2018, and April 23, 2019, facility-level data were collected for 9685 patients across 238 hospitals in 66 countries (91 hospitals in 20 high-income countries; 57 hospitals in 19 upper-middle-income countries; and 90 hospitals in 27 low-income to lower-middle-income countries). The availability of five hospital facilities was inversely associated with mortality: ultrasound, CT scanner, critical care unit, opioid analgesia, and oncologist. After adjustment for case-mix and country income group, hospitals with three or fewer of these facilities (62 hospitals, 1294 patients) had higher mortality compared with those with four or five (adjusted odds ratio [OR] 3.85 [95% CI 2.58-5.75]; p&lt;0.0001), with excess mortality predominantly explained by a limited capacity to rescue following the development of major complications (63.0% vs 82.7%; OR 0.35 [0.23-0.53]; p&lt;0.0001). Across LMICs, improvements in hospital facilities would prevent one to three deaths for every 100 patients undergoing surgery for cancer.Interpretation Hospitals with higher levels of infrastructure and resources have better outcomes after cancer surgery, independent of country income. Without urgent strengthening of hospital infrastructure and resources, the reductions in cancer-associated mortality associated with improved access will not be realised

Multiancestry analysis of the HLA locus in Alzheimer’s and Parkinson’s diseases uncovers a shared adaptive immune response mediated by HLA-DRB1*04 subtypes

Across multiancestry groups, we analyzed Human Leukocyte Antigen (HLA) associations in over 176,000 individuals with Parkinson’s disease (PD) and Alzheimer’s disease (AD) versus controls. We demonstrate that the two diseases share the same protective association at the HLA locus. HLA-specific fine-mapping showed that hierarchical protective effects of HLA-DRB1*04 subtypes best accounted for the association, strongest with HLA-DRB1*04:04 and HLA-DRB1*04:07, and intermediary with HLA-DRB1*04:01 and HLA-DRB1*04:03. The same signal was associated with decreased neurofibrillary tangles in postmortem brains and was associated with reduced tau levels in cerebrospinal fluid and to a lower extent with increased Aβ42. Protective HLA-DRB1*04 subtypes strongly bound the aggregation-prone tau PHF6 sequence, however only when acetylated at a lysine (K311), a common posttranslational modification central to tau aggregation. An HLA-DRB1*04-mediated adaptive immune response decreases PD and AD risks, potentially by acting against tau, offering the possibility of therapeutic avenues

Optimierung der Transportbedingungen von mesenchymalen Stromazellen für die klinisch-therapeutische Anwendung am Pferd

Einleitung: Mesenchymale Stromazellen (MSC) werden zunehmend für klinische Anwendungen bei Pferdepatienten eingesetzt. Für die MSC-Isolation und Expansion ist ein Laborschritt obligatorisch, danach werden die Zellen an den teilnehmenden Tierarzt zurückgesandt. Die Erhaltung der biologischen Eigenschaften von MSCs bzw. die Erhaltung der Qualität der MSCs ist für den Erfolg der Therapie während dieses Transports von größter Bedeutung. Ziele der Untersuchung: Das Ziel der Studie war es, transportbezogene Parameter (Transportbehälter, Medien, Temperatur, Zeit, Zellkonzentration) zu vergleichen, die potenziell Einfluss auf die Eigenschaften der in Kultur expandierten MSC während des Transportes in Suspension haben können. Material und Methoden: Diese Studie wurde in drei Teile geteilt, in welchen (I) fünf verschiedene Transportbehälter (Kryotube, zwei Arten von Plastikspritzen, Glasspritze, CellSeal), (II) sieben verschiedene Transportmedien, vier Temperaturen (4 °C gegen Raumtemperatur, - 20 °C vs. - 80 °C), zwei verschiedene Zeitrahmen (24 h gegen 48 h im positiven Temperaturbereich, 48 h gegen 72 h im negativen Temperaturbereich) und (III) drei MSC-Konzentrationen (5 x 106, 10 x 106, 20 x 106 MSC/ml) für den positiven und negativen Temperaturbereich verglichen wurden. Jeder Teil der Studie wurde unter Verwendung von Proben von sechs Pferden (n = 6) ausgewertet und Differenzierungsprotokolle (adipogene, osteogene und chondrogene) sowie Untersuchung der Vitalität und Proliferationsfähigkeit der MSC wurden für jeden Teil der Studie in doppeltem Einsatz bzw. verdoppelt bestimmt. Die Ergebnisse wurden als Median und mittlerer Interquartilabstand (IQR) dargestellt (p ≤ 0,05). Eine Anpassung des Signifikanzniveaus bei multiplen Vergleichen wurde mittels Bonferroni- Korrektur durchgeführt. Die Überprüfung der Daten auf Normalverteilung erfolgte mittels Shapiro- Wilk-Test. Ergebnisse: In Teil I der Studie lieferten die Spritzenmodelle die höheren Werte hinsichtlich des Endvolumens und gleichzeitig erzielte die Glasspritze die beste Zellvitalität. Dieser Behälter wurde für die nachfolgenden Teile der Studie ausgewählt. In Teil II der Studie wurde die höchste Zelllebensfähigkeit mit autologen Knochenmarküberständen als Transportmedium bei 4 °C für 24 h beobachtet (70,6 % gegenüber der Kontrollgruppe 75,3 %). Im Gegensatz dazu war die Lebensfähigkeit für alle Gefrierprotokolle bei -20 °C oder -80 °C, insbesondere bei Knochenmarküberstand oder Plasma und DMSO, unannehmbar niedrig (< 40 %). In Teil III der Studie zeigten die untersuchte Zellkonzentrationen keinen Einfluss auf die ausgewerteten Parameter. Diskussion: In dieser Studie wurden keine signifikanten Unterschiede festgestellt, möglicherweise war dies durch die hohe Anzahl von Transportbedingungen, welche gleichzeitig verglichen wurden, sowie die Anzahl der Stichproben (n=6) bedingt. Jedoch ergaben sich wichtige Hinweise zur Verbesserung des Transports der MSC für die klinisch-therapeutische Anwendung. Eine Einschränkung der chondrogenen Differenzierungsfähigkeit der MSC trat unter allen untersuchten Bedingungen auf. Im Vergleich zu früheren Pferdestudien wurde eine niedrigere Lebensfähigkeit der MSC nach dem Auftauen beobachtet. Mögliche Ursachen können unterschiedliche Protokolle beim Einfrieren und Auftauen der MSC sowie die große Anzahl an gleichzeitig bearbeiteten Proben sein. Zukünftige Studien könnten die möglicherweise negativen Auswirkungen des Transports auf die chondrogene Differenzierung klären. Schlussfolgerung: Trotz fehlender signifikanter Unterschiede ist eine deutliche Tendenz erkennbar, dass MSC aus dem Knochenmark schnellstmöglich bei 4 °C in autologem bzw. eigenem Knochenmark-Überstand aus dem Labor zum Patienten, in dem in dieser Studie untersuchten Glasspritzenmodell, zurückgesandt werden sollten.:Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung ...................................................................................................................1 2 Literaturübersicht ......................................................................................................2 2.1 Der Ursprung mesenchymaler Stromazellen .........................................................2 2.2 Klassifizierung der MSC .........................................................................................3 2.3 Charakterisierung der MSC ....................................................................................4 2.4 Quellen von MSC ...................................................................................................4 2.5 Ablauf der MSC-Therapie beim Pferd ....................................................................4 2.6 Empfehlungen der EMA zur klinisch-therapeutischen Anwendung zellbasierter Therapien ..........................................................................................6 2.7 Rechtliche Aspekte ................................................................................................7 2.8 Tetrazoliumsalze zur Bestimmung der Zellaktivität (WST-1-Reagenztest) .............9 2.9 Zielstellung dieser Arbeit.......................................................................................10 2.10 Hypothese dieser Arbeit......................................................................................10 3 Material und Methoden............................................................................................11 3.1 Versuchspferde ....................................................................................................11 3.2 Allgemeine Schritte für die gesamte Studie ........................................................11 3.2.1 Knochenmarkentnahme beim Pferd .................................................................11 3.2.2 Blutentnahme beim Pferd ..................................................................................13 3.2.3 Probenverarbeitung und Zellkultur ....................................................................13 3.2.4 Isolation der MSC ..............................................................................................14 3.2.5 Bestimmung der Zellzahl ...................................................................................15 3.2.6 Expansion der MSC ..........................................................................................16 3.2.7 Kryokonservierung ............................................................................................16 3.2.8 Auftauen der MSC ............................................................................................16 3.2.9 Bestimmung der Zellvitalität .............................................................................17 3.2.10 Kumulative Populationsverdopplungen (kPV) der MSC ..................................18 3.2.11 Differenzierungspotentiale der MSC ...............................................................18 3.2.11.1 Differenzierung in Monolayer-Zellkultur für die adipogene und osteogene Linie ............................................................................................................................19 3.2.11.1.1 Adipogene Differenzierung ........................................................................19 3.2.11.1.2 Osteogene Differenzierung ........................................................................22 3.2.11.2 Chondrogene Differenzierung (dreidimensionales Modell) ...........................25 3.3 Studiendesign – allgemeine Darstellung ..............................................................32 3.3.1 Teil 1: Untersuchung zur Ermittlung des optimalen Transportbehälters ...........33 3.3.1.1 Studiendesign zum ersten Teil der Studie ......................................................33 3.3.1.2 Zeit0: Vorbereitung der Kontrolle ...................................................................33 3.3.1.3 Zeit0: Vorbereitung der Versuchsbedingungen nach 24 Stunden .................34 3.3.1.4 Transportbehälter ......................................................................................... 34 3.3.1.5 Zeit1: Auswertung der Transportbehälter nach 24 Stunden Inkubationszeit 35 3.3.2 Teil 2: Untersuchung zum optimalen Verhältnis von Medium-Temperatur-Zeit 36 3.3.2.1 Studiendesign zum zweiten Teil der Studie ................................................. 36 3.3.2.2 Untersuchungsbedingungen .........................................................................37 3.3.2.3 Auswertung der Kontrolle und der Konditionsbedingungen ........................ 37 3.3.3 Teil 3: Untersuchung zur optimalen Zellkonzentration ..................................... 38 3.3.3.1 Studiendesign zum dritten Teil der Studie .................................................... 38 3.3.3.2 Untersuchungsbedingungen ......................................................................... 39 3.3.3.3 Auswertung der Kontrolle und der Konditionsbedingungen ......................... 39 3.4 Statistische Auswertung ..................................................................................... 40 4 Ergebnisse ............................................................................................................. 41 4.1 Teil 1: Behälter .................................................................................................... 41 4.1.1 Evaluierung der Endvolumen pro Behälter ....................................................... 41 4.1.2 Evaluierung der Zellvitalität .............................................................................. 42 4.1.2.1 Evaluierung der Zellvitalität durch Trypanblau-Färbung ................................ 42 4.1.2.2 Evaluierung der Zellvitalität durch WST-1-Reagenztest ................................ 43 4.1.3 Proliferationsverhalten der MSC ...................................................................... 44 4.1.4 Evaluierung des Differenzierungspotentials der MSC ...................................... 45 4.1.4.1 Adipogene Differenzierung ............................................................................ 45 4.1.4.2 Osteogene Differenzierung ............................................................................ 47 4.1.4.3 Chondrogene Differenzierung ....................................................................... 49 4.2 Teil 2: Medium, Temperatur und Zeit .................................................................. 53 4.2.1 Evaluierung der Zellvitalität .............................................................................. 53 4.2.1.1 Evaluierung der Zellvitalität durch Trypanblau-Färbung ................................ 53 4.2.1.2 Evaluierung der Zellvitalität durch WST-1-Reagenztest ................................ 54 4.2.2 Proliferationsverhalten der MSC ...................................................................... 56 4.2.3 Evaluierung des Differenzierungspotentials der MSC ...................................... 58 4.2.3.1 Adipogene Differenzierung ............................................................................ 58 4.2.3.2 Osteogene Differenzierung ............................................................................ 59 4.2.3.3 Chondrogene Differenzierung ....................................................................... 61 4.3 Teil 3: Zellkonzentration ...................................................................................... 64 4.3.1 Evaluierung der Zellvitalität .............................................................................. 64 4.3.1.1 Evaluierung der Zellvitalität durch Trypanblau-Färbung ................................ 64 4.3.1.2 Evaluierung der Zellvitalität durch WST-1-Reagenztest ................................ 65 4.3.2 Proliferationsverhalten der MSC ...................................................................... 66 4.3.3 Evaluierung des Differenzierungspotentials der MSC ...................................... 67 4.3.3.1 Adipogene Differenzierung .......................................................................... 67 4.3.3.2 Osteogene Differenzierung ............................................................................ 69 4.3.3.3 Chondrogene Differenzierung ....................................................................... 71 5 Diskussion .............................................................................................................. 74 5.1 Zielsetzung der geplanten Durchführung ............................................................ 74 5.2 Diskussion zum Material ..................................................................................... 75 5.3 Vorversuche ........................................................................................................ 76 5.3.1 Inkubationsbedingungen ................................................................................. 76 5.3.2 Sechster Behälter ............................................................................................. 76 5.3.3 WST-1-Reagenztest ......................................................................................... 77 5.3.4 Adipogene Differenzierung ............................................................................... 77 5.3.5 Chondrogene Differenzierung .......................................................................... 78 5.3.6 Kryokonservierungsmedium in der Pferdereproduktionsmedizin..................... 79 5.3.7 Die Auswirkung von Druck auf die Zellmembran ............................................. 80 5.4 Diskussion der Ergebnisse und Vergleich mit der Literatur ................................ 80 5.4.1 Diskussion des ersten Teils der Studie............................................................. 80 5.4.2 Diskussion des zweiten Teils der Studie........................................................... 82 5.4.3 Diskussion des dritten Teils der Studie............................................................. 87 5.4.4 Schlussfolgerungen ..........................................................................................87 6 Zusammenfassung ................................................................................................ 89 7 Summary ............................................................................................................... 91 8 Literaturverzeichnis ................................................................................................ 9

Optimierung der Transportbedingungen von mesenchymalen Stromazellen für die klinisch-therapeutische Anwendung am Pferd

Einleitung: Mesenchymale Stromazellen (MSC) werden zunehmend für klinische Anwendungen bei Pferdepatienten eingesetzt. Für die MSC-Isolation und Expansion ist ein Laborschritt obligatorisch, danach werden die Zellen an den teilnehmenden Tierarzt zurückgesandt. Die Erhaltung der biologischen Eigenschaften von MSCs bzw. die Erhaltung der Qualität der MSCs ist für den Erfolg der Therapie während dieses Transports von größter Bedeutung. Ziele der Untersuchung: Das Ziel der Studie war es, transportbezogene Parameter (Transportbehälter, Medien, Temperatur, Zeit, Zellkonzentration) zu vergleichen, die potenziell Einfluss auf die Eigenschaften der in Kultur expandierten MSC während des Transportes in Suspension haben können. Material und Methoden: Diese Studie wurde in drei Teile geteilt, in welchen (I) fünf verschiedene Transportbehälter (Kryotube, zwei Arten von Plastikspritzen, Glasspritze, CellSeal), (II) sieben verschiedene Transportmedien, vier Temperaturen (4 °C gegen Raumtemperatur, - 20 °C vs. - 80 °C), zwei verschiedene Zeitrahmen (24 h gegen 48 h im positiven Temperaturbereich, 48 h gegen 72 h im negativen Temperaturbereich) und (III) drei MSC-Konzentrationen (5 x 106, 10 x 106, 20 x 106 MSC/ml) für den positiven und negativen Temperaturbereich verglichen wurden. Jeder Teil der Studie wurde unter Verwendung von Proben von sechs Pferden (n = 6) ausgewertet und Differenzierungsprotokolle (adipogene, osteogene und chondrogene) sowie Untersuchung der Vitalität und Proliferationsfähigkeit der MSC wurden für jeden Teil der Studie in doppeltem Einsatz bzw. verdoppelt bestimmt. Die Ergebnisse wurden als Median und mittlerer Interquartilabstand (IQR) dargestellt (p ≤ 0,05). Eine Anpassung des Signifikanzniveaus bei multiplen Vergleichen wurde mittels Bonferroni- Korrektur durchgeführt. Die Überprüfung der Daten auf Normalverteilung erfolgte mittels Shapiro- Wilk-Test. Ergebnisse: In Teil I der Studie lieferten die Spritzenmodelle die höheren Werte hinsichtlich des Endvolumens und gleichzeitig erzielte die Glasspritze die beste Zellvitalität. Dieser Behälter wurde für die nachfolgenden Teile der Studie ausgewählt. In Teil II der Studie wurde die höchste Zelllebensfähigkeit mit autologen Knochenmarküberständen als Transportmedium bei 4 °C für 24 h beobachtet (70,6 % gegenüber der Kontrollgruppe 75,3 %). Im Gegensatz dazu war die Lebensfähigkeit für alle Gefrierprotokolle bei -20 °C oder -80 °C, insbesondere bei Knochenmarküberstand oder Plasma und DMSO, unannehmbar niedrig (< 40 %). In Teil III der Studie zeigten die untersuchte Zellkonzentrationen keinen Einfluss auf die ausgewerteten Parameter. Diskussion: In dieser Studie wurden keine signifikanten Unterschiede festgestellt, möglicherweise war dies durch die hohe Anzahl von Transportbedingungen, welche gleichzeitig verglichen wurden, sowie die Anzahl der Stichproben (n=6) bedingt. Jedoch ergaben sich wichtige Hinweise zur Verbesserung des Transports der MSC für die klinisch-therapeutische Anwendung. Eine Einschränkung der chondrogenen Differenzierungsfähigkeit der MSC trat unter allen untersuchten Bedingungen auf. Im Vergleich zu früheren Pferdestudien wurde eine niedrigere Lebensfähigkeit der MSC nach dem Auftauen beobachtet. Mögliche Ursachen können unterschiedliche Protokolle beim Einfrieren und Auftauen der MSC sowie die große Anzahl an gleichzeitig bearbeiteten Proben sein. Zukünftige Studien könnten die möglicherweise negativen Auswirkungen des Transports auf die chondrogene Differenzierung klären. Schlussfolgerung: Trotz fehlender signifikanter Unterschiede ist eine deutliche Tendenz erkennbar, dass MSC aus dem Knochenmark schnellstmöglich bei 4 °C in autologem bzw. eigenem Knochenmark-Überstand aus dem Labor zum Patienten, in dem in dieser Studie untersuchten Glasspritzenmodell, zurückgesandt werden sollten.:Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung ...................................................................................................................1 2 Literaturübersicht ......................................................................................................2 2.1 Der Ursprung mesenchymaler Stromazellen .........................................................2 2.2 Klassifizierung der MSC .........................................................................................3 2.3 Charakterisierung der MSC ....................................................................................4 2.4 Quellen von MSC ...................................................................................................4 2.5 Ablauf der MSC-Therapie beim Pferd ....................................................................4 2.6 Empfehlungen der EMA zur klinisch-therapeutischen Anwendung zellbasierter Therapien ..........................................................................................6 2.7 Rechtliche Aspekte ................................................................................................7 2.8 Tetrazoliumsalze zur Bestimmung der Zellaktivität (WST-1-Reagenztest) .............9 2.9 Zielstellung dieser Arbeit.......................................................................................10 2.10 Hypothese dieser Arbeit......................................................................................10 3 Material und Methoden............................................................................................11 3.1 Versuchspferde ....................................................................................................11 3.2 Allgemeine Schritte für die gesamte Studie ........................................................11 3.2.1 Knochenmarkentnahme beim Pferd .................................................................11 3.2.2 Blutentnahme beim Pferd ..................................................................................13 3.2.3 Probenverarbeitung und Zellkultur ....................................................................13 3.2.4 Isolation der MSC ..............................................................................................14 3.2.5 Bestimmung der Zellzahl ...................................................................................15 3.2.6 Expansion der MSC ..........................................................................................16 3.2.7 Kryokonservierung ............................................................................................16 3.2.8 Auftauen der MSC ............................................................................................16 3.2.9 Bestimmung der Zellvitalität .............................................................................17 3.2.10 Kumulative Populationsverdopplungen (kPV) der MSC ..................................18 3.2.11 Differenzierungspotentiale der MSC ...............................................................18 3.2.11.1 Differenzierung in Monolayer-Zellkultur für die adipogene und osteogene Linie ............................................................................................................................19 3.2.11.1.1 Adipogene Differenzierung ........................................................................19 3.2.11.1.2 Osteogene Differenzierung ........................................................................22 3.2.11.2 Chondrogene Differenzierung (dreidimensionales Modell) ...........................25 3.3 Studiendesign – allgemeine Darstellung ..............................................................32 3.3.1 Teil 1: Untersuchung zur Ermittlung des optimalen Transportbehälters ...........33 3.3.1.1 Studiendesign zum ersten Teil der Studie ......................................................33 3.3.1.2 Zeit0: Vorbereitung der Kontrolle ...................................................................33 3.3.1.3 Zeit0: Vorbereitung der Versuchsbedingungen nach 24 Stunden .................34 3.3.1.4 Transportbehälter ......................................................................................... 34 3.3.1.5 Zeit1: Auswertung der Transportbehälter nach 24 Stunden Inkubationszeit 35 3.3.2 Teil 2: Untersuchung zum optimalen Verhältnis von Medium-Temperatur-Zeit 36 3.3.2.1 Studiendesign zum zweiten Teil der Studie ................................................. 36 3.3.2.2 Untersuchungsbedingungen .........................................................................37 3.3.2.3 Auswertung der Kontrolle und der Konditionsbedingungen ........................ 37 3.3.3 Teil 3: Untersuchung zur optimalen Zellkonzentration ..................................... 38 3.3.3.1 Studiendesign zum dritten Teil der Studie .................................................... 38 3.3.3.2 Untersuchungsbedingungen ......................................................................... 39 3.3.3.3 Auswertung der Kontrolle und der Konditionsbedingungen ......................... 39 3.4 Statistische Auswertung ..................................................................................... 40 4 Ergebnisse ............................................................................................................. 41 4.1 Teil 1: Behälter .................................................................................................... 41 4.1.1 Evaluierung der Endvolumen pro Behälter ....................................................... 41 4.1.2 Evaluierung der Zellvitalität .............................................................................. 42 4.1.2.1 Evaluierung der Zellvitalität durch Trypanblau-Färbung ................................ 42 4.1.2.2 Evaluierung der Zellvitalität durch WST-1-Reagenztest ................................ 43 4.1.3 Proliferationsverhalten der MSC ...................................................................... 44 4.1.4 Evaluierung des Differenzierungspotentials der MSC ...................................... 45 4.1.4.1 Adipogene Differenzierung ............................................................................ 45 4.1.4.2 Osteogene Differenzierung ............................................................................ 47 4.1.4.3 Chondrogene Differenzierung ....................................................................... 49 4.2 Teil 2: Medium, Temperatur und Zeit .................................................................. 53 4.2.1 Evaluierung der Zellvitalität .............................................................................. 53 4.2.1.1 Evaluierung der Zellvitalität durch Trypanblau-Färbung ................................ 53 4.2.1.2 Evaluierung der Zellvitalität durch WST-1-Reagenztest ................................ 54 4.2.2 Proliferationsverhalten der MSC ...................................................................... 56 4.2.3 Evaluierung des Differenzierungspotentials der MSC ...................................... 58 4.2.3.1 Adipogene Differenzierung ............................................................................ 58 4.2.3.2 Osteogene Differenzierung ............................................................................ 59 4.2.3.3 Chondrogene Differenzierung ....................................................................... 61 4.3 Teil 3: Zellkonzentration ...................................................................................... 64 4.3.1 Evaluierung der Zellvitalität .............................................................................. 64 4.3.1.1 Evaluierung der Zellvitalität durch Trypanblau-Färbung ................................ 64 4.3.1.2 Evaluierung der Zellvitalität durch WST-1-Reagenztest ................................ 65 4.3.2 Proliferationsverhalten der MSC ...................................................................... 66 4.3.3 Evaluierung des Differenzierungspotentials der MSC ...................................... 67 4.3.3.1 Adipogene Differenzierung .......................................................................... 67 4.3.3.2 Osteogene Differenzierung ............................................................................ 69 4.3.3.3 Chondrogene Differenzierung ....................................................................... 71 5 Diskussion .............................................................................................................. 74 5.1 Zielsetzung der geplanten Durchführung ............................................................ 74 5.2 Diskussion zum Material ..................................................................................... 75 5.3 Vorversuche ........................................................................................................ 76 5.3.1 Inkubationsbedingungen ................................................................................. 76 5.3.2 Sechster Behälter ............................................................................................. 76 5.3.3 WST-1-Reagenztest ......................................................................................... 77 5.3.4 Adipogene Differenzierung ............................................................................... 77 5.3.5 Chondrogene Differenzierung .......................................................................... 78 5.3.6 Kryokonservierungsmedium in der Pferdereproduktionsmedizin..................... 79 5.3.7 Die Auswirkung von Druck auf die Zellmembran ............................................. 80 5.4 Diskussion der Ergebnisse und Vergleich mit der Literatur ................................ 80 5.4.1 Diskussion des ersten Teils der Studie............................................................. 80 5.4.2 Diskussion des zweiten Teils der Studie........................................................... 82 5.4.3 Diskussion des dritten Teils der Studie............................................................. 87 5.4.4 Schlussfolgerungen ..........................................................................................87 6 Zusammenfassung ................................................................................................ 89 7 Summary ............................................................................................................... 91 8 Literaturverzeichnis ................................................................................................ 9

Etnografías de las ferias de la castaña de Açor y del queso de Soalheira

This article supposes the conclusion of a more extensive anthropological investigation that has been realized in the last four years (2014-2017) on diverse festivals of the Municipality of Fundão (Portugal), concretely on the parties of the "Rattles" of Alpedrinha (2014) ; the "Festival of the cherry" of Alcongosta (2015); the "Mushroom Festival" of Alcaide (2016); and the "the chestnuts festival" of the Maunça in Açor (2017), and now being added to complete the festive cycle, the study of the Cheese Fair in Soalheira. The objective of the final stage of such research has also been to complete the mentioned calendar with the study of one of the oldest and perhaps the most genuine (Açor) celebrations, to provide a final reflection on the importance of these new rituals currently performing an analysis of its structure, its evolution and a prospective about its possible future. We have already seen how these holidays, which are not part of the traditional religious calendar, are aimed at increasing the consumption and trade of quality rural native products, as well as promoting tourism and a positive identity for villagers. And we also know that this new festive cycle is intentionally encouraged by the municipal authorities. This article goes back to its origins, its similarities and differences, and tries to reveal the oppositions of the structural symbolic code of the same.El presente artículo supone la conclusión de una investigación antropológica más amplia que se ha realizado los últimos cuatro años (2014-2017) sobre diversas fiestas del Municipio de Fundão (Portugal), concretamente sobre la fiestas de los Cencerros (“Chocalhos”) de Alpedrinha (2014); la Fiesta de la Cereza (“Festa da Cereja”) de Alcongosta (2015); el Festival de los Níscaros (“Festival dos Miscaros ”) de Alcaide (2016) -etnografías ya publicadas-; a las que ahora viene a sumarse para completar el ciclo festivo, el estudio de la Feria del Queso (“Feira do Queijo”) de Soalheira (2017) y la Fiesta de las castañas” de la Maúnça en Açor (2017). El objetivo de la etapa final de tal investigación también ha sido además del de completar el mencionado calendario con el estudio de una de las celebraciones más antiguas y quizá la más genuina (Açor), el de aportar una reflexión final sobre la importancia de estos nuevos rituales en la actualidad realizando un análisis de su estructura, de su evolución y una prospectiva sobre su posible futuro. Ya hemos comprobado cómo estas fiestas, que no son del calendario tradicional religioso, están orientadas al incremento del consumo y el comercio de productos rurales autóctonos de calidad, así como a fomentar el turismo y una identidad positiva para los aldeanos. Y también conocemos que este nuevo ciclo festivo es intencionadamente fomentado por las autoridades municipales. En el artículo se retoman, ya al completo, sus orígenes, sus semejanzas y diferencias, y se ensaya poner de manifiesto las oposiciones del código simbólico estructural de las mismas

Site-Dependent E-Cadherin Cleavage and Nuclear Translocation in a Metastatic Colorectal Cancer Model

Metastases are frequently found during colorectal cancer diagnoses and are the main determinants of clinical outcome. The lack of reliable models of metastases has precluded their mechanistic understanding and our capacity to improve outcome. We studied the effect of E-cadherin and Snail1 expression on metastagenesis in a colorectal cancer model. We microinjected SW480-ADH human colorectal cancer cells, transfected with an empty vector (Mock) or overexpressing Snail1 (Snail1OE) or E-cadherin (E-cadherinOE), in the ceca of nude mice (eight per group) and analyzed tumor growth, dissemination, and Snail1, E-cadherin, β-catenin, and Presenilin1 (PS1) expression in local tumors and/or metastatic foci. Snail1OE cells disseminated only to lymph nodes, whereas Mock or E-cadherinOE cells spread to lymph nodes and peritoneums. Peritoneal tumor foci developed by E-cadherinOE cells presented an increase in E-cadherin proteolysis and nuclear translocation, and enhanced expression of proteolytically active PS1, which was linked to increased tumor growth and shortened mouse survival. Interestingly, local and lymph node tumors in mice bearing E-cadherinOE cells overexpressed E-cadherin, but they did not show E-cadherin proteolysis or nuclear translocation. Remarkably, E-cadherin nuclear translocation and enhanced expression of active PS1 were found in a patient with colorectal signet-ring cell carcinoma. In conclusion, we have established a colorectal cancer metastasis model in which E-cadherin proteolyis and nuclear translocation associates with aggressive foci growth only in the peritoneal microenvironment