Protein foszfatáz 2A szerepe a human endothelium barrier funkciójának szabályozásában = Role of protein phosphatase 2A in the regulation of human endothelial barrier function

Tüdő artéria endothel modell rendszerben tanulmányoztuk a protein foszfatáz 2A (PP2A) szerepét. Eredményeink arra utalnak, hogy a PP2A aktívan részt vesz az endothelium barrier funkciójának citoszkeletális fehérjéken keresztül történő regulációjában. Overexpresszált PP2A a barrier diszfunkciót kiváltó ágensek (thrombin, nokodazol) hatását az aktin citoszkeletonra és a mikrotubulusokra mérsékli/megszünteti. Két potenciális citoszkeletális szubsztrátot azonosítottunk, a tau és a Hsp27 fehérjét, amelyeknek szerepe lehet az agonista-indukált citoszkeleton átrendeződésben és permeabilitás változásban. A PP2A aktivitás ezen fehérjék foszforilációs szintjét befolyásolja és ezáltal része lehet az endothel sejtek citoszkeletonjában a mikrotubulusok és a mikrofilamentumok közötti párbeszéd és a barrier funkció szabályozásának. Továbbá kimutattuk, hogy a MYPT fehérje család egyik kevésbé jellemzett tagja, a TIMAP, ami egy membrán-asszociált fehérje, specifikusan kölcsönhat a protein foszfatáz 1 (PP1) béta izoformájával, ami valószínűsíti, hogy a PP1 regulátora. A TIMAP a barrier funkciót pozitívan szabályozza, ezt az RNS interferenciával TIMAP-depletált sejtek vizsgálatával mutattuk ki. Eredményeink alapján feltételezhető, hogy a TIMAP az ERM (ezrin/radixin/moezin) fehérjék PKA indukált szabályozásában vesz részt és ez a TIMAP-mediált endothel barrier védő hatás része lehet. | The role of protein phosphatase 2A (PP2A) in pulmonary artery endothelial cells was studied. Our results suggest the direct involvement of PP2A in the regulation of cytoskeleton proteins and endothelial barrier maintenance. PP2A overexpression attenuated or diminished thrombin- or nocodazole-induced effects on microfilaments and microtubule. We identified two potential substrates of PP2A, tau and Hsp27, which potentially could be involved in agonist-induced cytoskeleton rearrangement and change in permeability. PP2A regulates the phosphorylation level of these proteins, and as a consequence, it is involved in the regulation of the crosstalk between microfilaments and microtubule, and barrier function. Further, we found specific interaction between the beta isoform of protein phosphatase 1 (PP1) and TIMAP, a less characterized member of the MYPT family, implying its regulatory role in PP1 activity. Using siRNA technique we showed that TIMAP is a positive regulator of the endothelial barrier function. Our results also suggest the involvement of TIMAP in PKA-mediated ERM (ezrin/radixin/moesin) dephosphorylation and the connection of this dephosphorylation in TIMAP-mediated EC barrier protection

Protein foszfatázok szabályozása kölcsönható fehérjékkel = Regulation of protein phosphatases by protein-protein interactions

A pályázatban a miozin foszfatáz foszforilációval történő szabályozását és az enzim fehérje-fehérje kölcsönhatásait tanulmányoztuk. A holoenzimben protein foszfatáz-1 katalitikus alegység (PP1c) kapcsolódik a miozinhoz is kötődő szabályozó alegységhez (MYPT). A MYPT Rho-kináz általi foszforilációja gátolta a miozin foszfatáz aktivitását és simaizom kontrakciót indukált alacsony Ca2+-koncentrációnál. Ez a gátló foszforiláció nem-izom sejtek esetén stressz-rostok képződését és a sejtek migrációjának gátlását eredményezte. A MYPT protein kináz G általi foszforilációja viszont csökkentette a gátló foszforiláció mértékét, elősegítve ezzel a simaizom relaxációt. A miozin foszfatáz nem-izom sejtekben számos, a kontraktilitástól eltérő sejtfolyamatot is szabályozhat. Erre a PP1c és a MYPT neuronális, sejtmag és mitokondriális fehérjékkel történő kölcsönhatásából következtettünk. A miozin foszfatáz változatos lokalizációja és kölcsönhatásai az idegrendszerben a neurotranszmissziót szabályozó szerepét sejteti. Jellemeztük egy új, elsősorban idegszövetben előforduló fehérje foszforilációját és kimutattuk miozin foszfatázt gátló képességét. Az enzimnek a retinoblasztóma fehérje defoszforilációjában játszott szerepe pedig arra utal, hogy a miozin foszfatáz a sejtciklust is szabályozhatja. További kutatásaink olyan molekulák azonosítására irányulnak, amelyek az enzim szelektív gátlásával/aktiválásával elősegíthetik sejtfolyamatokat szabályozó szerepének mélyebb megértését. | In this project the regulation of myosin phosphatase by phosphorylation and by protein-protein interactions were studied. The holoenzyme is composed of protein phosphatase-1 catalytic subunit (PP1c) and myosin-binding regulatory subunit (MYPT). Phosphorylation of MYPT by Rho-kinase resulted in the inhibition of the activity of myosin phosphatase and induced smooth muscle contraction at low Ca2+-concentration. In non-muscle cells this inhibitory phosphorylation increased stress-fiber formation and supressed cell migration. Phosphorylation of MYPT by protein kinase G decreased the extent of inhibitory phosphorylation and resulted in smooth muscle relaxation. In non-muscle cells the myosin phosphatase may regulate cellular events distinct from the contractile processes suggested by the interaction of PP1c and MYPT with neuronal, nuclear and mitochondrial proteins. The widespread localization of myosin phosphatase in neuronal cells implicates this enzyme in the regulation of neuronal transmission. We characterized the phosphorylation and myosin phosphatase inhibitory potency of a novel protein which is mainly enriched in neuronal tissue. The myosin phosphatase dephosphorylate also the retinoblastoma protein implying its regulatory role in the cell cycle. Our further studies aim to identify molecules able to inhibit/activate the myosin phosphatase selectively; therefore they may help to clarify the regulatory role of this enzyme in the various cellular processes

Thrombocyta aktiváció során bekövetkező változások biokémiai és sejtbiológiai jellemzés = Biochemical and cell biological changes during platelet activation

Ex vivo mintákon végzett analízisek közül elvégeztük 30 db stent beültett beteg esetében perifáriás vérminták analízisét az alábbi thrombocyta aktivációs markerekre: thrombocyta P-selectin, solubilis P-selectin, CD63 expresszió, heterotipikus aggregátumok aránya, mikropartikula mennyiség. Fenti eredményeket korreláltattuk a betegek előzetes kezelési protokolljával (csak ASA, vagy ASA+clopidogrel). A XIII-as faktorral (F XIII) kapcsolatos vizsgálatok során megállapítást nyert, hogy thrombocyták TRAP aktiválása, az FXIII expresszió fokozódásával jár. Azonban kimutattuk, hogy ez a plazmában lévő FXIII kötődése és nem az intracellluláris FXIII felszíni megjelenése miatt jön létre. Specifikus fibrinogének felhasználásával tisztáztuk az FXIII kötődés biokémiai jellemzőit. A thrombocyta foszfatáz inhibitorokkal végzett kísérletek során PRP-ben bizonyítottuk, hogy az 1 és 2A típusú foszfatázoknak csak együttes gátlása hozza létre a thrombocyta aktiválás során észlelhető hatást. TRAP aktivált mintákon bizonyítottuk, hogy mind az aggregáció, mind a P-selectin expresszió dózisfüggő módon gátlódik calyculin (CLA) hatására. Ugyanakkor nem aktivált mintákon azt találtuk, hogy a CLA dózisfüggő módon alakváltozást hoz létre a thrombocytákban, mely aggregometriával, valamint áramlási citometriai fényszórási és antigén expressziós vizsgálatokkal bizonyítható volt. | On ex vivo samples we examined 30 cases of stent implanted patients where in peripheral blood samples the following platelet activation markers were investigated: paletelt P-selectin, soluble P-selectin, CD63, heterotypic aggregates, microparticles. The above data were correlated with previous treatment protocol of the patients (ASA only or ASA and clopidogrel). Regarding studies with factor XIII we identified that in TRAP-activated platelets FXIII is elevated on the platelet surface. However, we proved, that FXIII is not derived from intracellular source but is attached from the plasma. By using specific fibrinogens we identified the biochemical requirements for FXIII binding to platelets. The manuscript was submitted to Thrombosis and Haemostasis where a minor revision was required. Regarding phosphatase inhibitors we found that phosphatase 1 and 2A types are both involved in platelet activation, since their simultaneous inhibition by calyculin is required to prevent TRAP-elicited P-selectin axpression and platelet aggregation. At the same time on non-activated platelet samples we found that calyculin dose-dependently inhibited platelet shape-change as measured by aggregometry and flow cytometry

Analysis of Two Putative Candida albicans Phosphopantothenoylcysteine Decarboxylase / Protein Phosphatase Z Regulatory Subunits Reveals an Unexpected Distribution of Functional Roles

Protein phosphatase Z (Ppz) is a fungus specific enzyme that regulates cell wall integrity, cation homeostasis and oxidative stress response. Work on Saccharomyces cerevisiae has shown that the enzyme is inhibited by Hal3/Vhs3 moonlighting proteins that together with Cab3 constitute the essential phosphopantothenoylcysteine decarboxylase (PPCDC) enzyme. In Candida albicans CaPpz1 is also involved in the morphological changes and infectiveness of this opportunistic human pathogen. To reveal the CaPpz1 regulatory context we searched the C. albicans database and identified two genes that, based on the structure of their S. cerevisiae counterparts, were termed CaHal3 and CaCab3. By pull down analysis and phosphatase assays we demonstrated that both of the bacterially expressed recombinant proteins were able to bind and inhibit CaPpz1 as well as its C-terminal catalytic domain (CaPpz1-Cter) with comparable efficiency. The binding and inhibition were always more pronounced with CaPpz1-Cter, indicating a protective effect against inhibition by the N-terminal domain in the full length protein. The functions of the C. albicans proteins were tested by their overexpression in S. cerevisiae. Contrary to expectations we found that only CaCab3 and not CaHal3 rescued the phenotypic traits that are related to phosphatase inhibition by ScHal3, such as tolerance to LiCl or hygromycin B, requirement for external K+ concentrations, or growth in a MAP kinase deficient slt2 background. On the other hand, both of the Candida proteins turned out to be essential PPCDC components and behaved as their S. cerevisiae counterparts: expression of CaCab3 and CaHal3 rescued the cab3 and hal3 vhs3 S. cerevisiae mutations, respectively. Thus, both CaHal3 and CaCab3 retained the PPCDC related functions and have the potential for CaPpz1 inhibition in vitro. The fact that only CaCab3 exhibits its phosphatase regulatory potential in vivo suggests that in C. albicans CaCab3, but not CaHal3, acts as a moonlighting protein

A miozin foszfatáz új szabályozó funkciói nem-izom sejtekben = Novel regulatory functions of myosin phosphatase in non-muscle cells

A protein foszfatáz-1 katalitikus alegységet (PP1c) és a PP1c-t „célra irányító” regulátor alegységet (MYPT1) tartalmazó miozin foszfatáz (MP) szerepét tanulmányoztuk nem-izom sejtek sejtfolyamataiban. PP1c specifikus inhibitorok alkalmazásával, valamint a MYPT1-el kölcsönható új fehérje partnerek azonosításával kívántuk feltárni a MP új funkciót. Tanulmányoztuk a MYPT-családba tartozó TIMAP fehérje és a PP1c kölcsönhatását is és kimutattuk a PP1c-TIMAP komplex szabályozó szerepét a moezin defoszforilációjában. Felismertük, hogy tanninokban és zöld teában előforduló polifenolok PP1c szelektív inhibitorok és csökkentik a daganatos sejtek életképességét. A MYPT1-el kölcsönható fehérjeként és/vagy a MP lehetséges szubsztrátjaiként azonosítottuk a retinoblasztóma fehérjét (Rb), a nitrogén-monoxid szintetázt (NOS) és preszinaptikus neuronális fehérjéket (szinapszin, szintaxin, SNAP-25, CaM-kináz-II, kalcineurin). Kimutattuk, hogy a Rb MP által történő defoszforilációja a leukémiás sejtek kemoszenzitivitásának, a neuronális fehérjék (szintaxin, szinapszin) Rho-kináz/MP által történő foszforilációja/defoszforilációja pedig a neurotranszmitter felszabadulás fontos szabályozó folyamatai. Jellemeztük a MYPT1 és a kalcineurin kölcsönhatását és kimutattuk, hogy a MYPT1 kalcineurin által történő defoszforilációja az endotél sejtek „barrier” funkcióját szabályozza. Összefoglalva: a MP új szabályozó funkcióinak felismerése bővíti e sejtfolyamatok farmakológiai befolyásolásának lehetőségeit. | We studied the role of myosin phosphatase (MP) composed of protein phosphatase-1 catalytic subunit and PP1c-targeting regulatory subunit (MYPT1) in cellular processes of non-muscle cells. We wished to uncover novel functions of MP by using PP1c specific inhibitors as well as by identification of novel MYPT1-interacting proteins. The interaction of TIMAP, a MYPT-family protein, with PP1c was also studied and it was shown that the PP1c-TIMAP complex controlled the dephosphorylation of moesin. We identified the polyphenols of tannins and green tea as PP1c selective inhibitors which were implicated in decreasing the viability of malignant cells. The retinoblastoma protein (Rb), the nitrogen-monoxide (NO) synthase (NOS) and presynaptic neuronal proteins (synapsin, syntaxin, CaM-kinase-II,) were identified as MYPT1-interacting proteins and/or possible substrates for MP. We proved that the dephosphorylation of Rb by MP influenced chemosensitivity of leukemic cells, while the phosphorylation/dephosphorylation of neuronal proteins (synapsin, syntaxin) by Rho-kinase/MP had important regulatory roles in the neurotransmitter release. We characterized the interaction of MYPT1 with calcineurin and showed that dephosphorylation of MYPT1 by calcineurin mediated the barrier function of endothelial cells. In summary, the novel regulatory functions of MP recognized here extend the possibilities to pharmacologically influence the above cellular processes

Dissection of the regulatory role for the N-terminal domain in Candida albicans protein phosphatase Z1

L

Inhibition of protein phosphatase-1 and -2A by ellagitannins: structure-inhibitory potency relationships and influences on cellular systems

L