Caratérisation d'YVCC, transporteur ABC de Bacillus Subtilis impliqué dans le transport de multiples drogues et notamment des antibiotiques

L'analyse du génome de Bacillus subtilis a montré que le gène yvcc code un transporteur ABC ("ATP Binding Cassette") fortement homologue aux deux moitiés de la glycoprotéine-P (P-gp) humaine et à LmrA, premier transporteur ABC bactérien responsable d'un phénotype de résistance à de multiples drogues. Une souche yvcc a été construite et le transport du bromure d'éthidium dans cette souche, mesuré en présence ou non d'inhibiteur et analysé comparativement à la souche sauvage, suggère que le transporteur YvcC est majoritairement responsable de l'efflux de bromure d'éthidium dans la souche sauvage. Par ailleurs, YvcC a été surexprimé dans la souche C41 (DE3) d'E. coli et constitue près de 50 % des protéines membranaires. Des vésicules inversés (IMV) de ces membranes ont permis de visualiser le transport de plusieurs drogues fluorescentes : le Hoeschst 3342, la doxorubicine, la BODIPY-vinblastine et également un analogue d'actinomycine D. Ce transport est empêché par l'addition de réserpine ou d'autres drogues telles que la vinblastine, le vérapamil et des représentants de différentes familles d'antibiotiques. Après solubilisation de YvcC par le dodécylmaltoside, une seule étape de purification a permis d'obtenir la protéine purifiée en grande quantité et l'interaction de YvcC avec les effecteurs de la P-gp a été suivie par modification de fluorescence. La reconstitution de YvcC dans les liposomes permet d'obtenir une activité ATPase du transporteur d'environ 6 micromol/min/mg de protéine à 37 C, activité notamment stimulable par certaines drogues et inhibée par l'orthovanadate. L'ensemble des résultats suggère donc que YvcC est un transporteur de multiples drogues chez Bacillus subtilis y compris certains antibiotiques.LYON1-BU.Sciences (692662101) / SudocSudocFranceF

Three-dimensional structure by cryo-electron microscopy of YvcC, an homodimeric ATP-binding cassette transporter from Bacillus subtilis

YvcC, a multidrug transporter from Bacillus subtilis, is a member of the ATP-binding cassette superfamily, highly homologous to each half of human multidrug-resistance P-glycoprotein and to several other bacterial half-ABC transporters. Here, the purified recombinant histidine-tagged YvcC has been reconstituted into a lipid bilayer. Controlled and partial detergent removal from YvcC-lipid micelles allowed the production of particularly interesting lipid-detergent-YvcC ring-shaped particles, about 40 nm in diameter, well suited for single particle analysis by cryo-electron microscopy. Furthermore, binding of these histidine-tagged ring-shaped particles to lipid layers functionalized with a Ni(2+)-chelating head group generated a preferential perpendicular orientation, eliminating the missing cone in the final three-dimensional reconstruction. From such analysis, a computed volume has been determined to 2.5 nm resolution giving a detailed insight into the structural organization of this half-ABC transporter within a membrane. The repetitive unit in the ring-shaped particles is consistent with a homodimeric organization of YvcC. Each subunit was composed of three domains: a 5 nm height transmembrane region, a stalk of about 4 nm in height and 2 nm in diameter, and a cytoplasmic lobe of about 5-6 nm in diameter. The latest domain, which fitted with the reported X-ray structure of HisP, was identified as the nucleotide-binding domain (NBD). The 3D reconstruction of the YvcC homodimer well compared with the very recent X-ray crystallographic data on the MsbA homodimer from Escherichia coli, supporting the existence of a central open chamber between the two subunits constituting the homodimer. In addition, the 3D reconstruction of YvcC embedded in a membrane revealed an asymmetric organization of the two NBDs sites within the homodimer, as well as a dimeric interaction between two homodimers