In vitro αξιολόγηση και in vivo φαρμακοκινητική/ φαρμακοδυναμική μελέτη του εκχυλίσματος από τα στίγματα του φυτού Crocus sativus L. με έμφαση στην αντιαθηρωματική δράση

Εισαγωγή και σκοπός: Στόχοι της παρούσας εργασίας ήταν 1) η παρασκευή, ταυτοποίηση και ποσοτικοποίηση ως προς τα κύρια δραστικά συστατικά στερεού υδατικού εκχυλίσματος των στιγμάτων του φυτού Crocus sativus (SFE) , 2) η in vitro μελέτη της σταθερότητας ως προς την περιεκτικότητά του σε δραστικά συστατικά, 3) η in vivo μελέτη της φαρμακοκινητικής του κύριου αντιοξειδωτικού συστατικού του (κροκετίνη μετά από υδρόλυση της κροκίνης) και 4) η διερεύνηση της πιθανής αντιαθηρωματικής του δράση σε εξειδικευμένο ζωικό πρότυπο (μύες με ομόζυγη έλλειψη της απολιποπρωτεΐνης Ε, ApoE-/-) μετά από χορήγηση 3 διαφορετικών δόσεων (30 – 60 – 90 mg/kg σωματικού βάρους) και του πιθανού μηχανισμού δράσης. Μέθοδοι: Για την παρασκευή του υδατικού εκχυλίσματος τα στίγματα του φυτού Crocus sativus L. αναμίχθηκαν με απιονισμένο νερό και το μίγμα φυλάχθηκε για 3 ημέρες στο ψυγείο για να ολοκληρωθεί η εκχύλιση. Μετά το πέρας των 3 ημερών, το εκχύλισμα διηθήθηκε και ακολούθησε η λυοφιλοποίηση. Το λυόφιλο προϊόν αναλύθηκε ως προς τη χημική του σύσταση με εφαρμογή ημιπαρασκευαστικής HPLC και φασματοσκοπίας NMR, ποσοτικοποιήθηκε ως προς τα κύρια βιοδραστικά συστατικά (κροκίνη και σαφρανάλη) και μελετήθηκε για τη σταθερότητά του κατά τη φύλαξη ως προς την περιεκτικότητα σε κροκίνη (το κύριο δραστικό συστατικό). Στη συνέχεια, το εκχύλισμα χορηγήθηκε ενδοφλέβια και από του στόματος σε 80 wild type C57/Bl6J μύες σε δόση 60 mg/kg βάρους με σκοπό την εκτίμηση της φαρμακοκινητικής και της βιοδιαθεσιμότητας του κύριου βιοδραστικού μορίου της κροκετίνης (υδρολυμένη μορφή της κροκίνης που αποτελεί το βασικότερο συστατικό του εκχυλίσματος). Συνελέγησαν δείγματα αίματος και ιστών σε επιλεγμένα χρονικά σημεία μετά τη χορήγηση (5, 15, 30, 60, 90, 120, 180 και 240 min). Για την ποσοτικοποίηση της κροκετίνης στα βιολογικά δείγματα (ορός και ιστοί) βελτιστοποιήθηκε μεθοδος HPLC-PDA. Στα δεδομένα συγκέντρωσης-χρόνου που προέκυψαν τόσο για τον ορό όσο και για τους ιστούς εφαρμόστηκε διαμερισματική και μη-διαμερισματική φαρμακοκινητική ανάλυση με σκοπό την εκτίμηση των ΦΚ παραμέτρων. Για τη διερεύνηση της πιθανής αντιαθηρωματικής/αθηροπροστατευτικής δράσης, χρησιμοποιήθηκαν 50 μύες με ομόζυγη έλλειψη της απολιποπρωτεΐνης Ε (ApoE-/-), που σιτίστηκαν για 12 εβδομάδες με διαβητογόνο-αθηρογόνο τροφή και τυχαιοποιήθηκαν σε 5 ισάριθμες ομάδες: 1) Την ομάδα baseline (BLG) που θανατώθηκε χωρίς παρέμβαση στις 12 εβδομάδες, 2) τις 3 ομάδες χορήγησης SFE (SF1, SF2, SF3) που έλαβαν εκχύλισμα κρόκου από το στόμα για 4 εβδομάδες καθημερινά σε δόση 30, 60 και 90 mg/kg αντίστοιχα και 3) την ομάδα ελέγχου (COG) που έλαβε απλό ενέσιμο ύδωρ από το στόμα για 4 εβδομάδες καθημερινά. Μετά τις αιμοληψίες και την ευθανασία των ζώων, παρασκευάστηκαν οι αορτές τους, αξιολογήθηκε η αορτική στένωση και οι αθηρωματικές αλλοιώσεις που εντοπίστηκαν μελετήθηκαν για την περιεκτικότητά τους σε μακροφάγα, λεία μυικά κύτταρα (SMCs), συνδετικό ιστό και ελαστίνη καθώς και για την έκφραση φλεγμονωδών παραγόντων όπως ο TNF-a, o MCP-1, οι μεταλλοπρωτεϊνάσες-2, -3, -9 (ΜΜΡ-2, ΜΜΡ-3, ΜΜΡ-9) και ο αναστολέας τους TIMP-2 και η IL-6, χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημικές τεχνικές και RT-qPCR. Αποτελέσματα: Το SFE που παρασκευάστηκε είναι πλούσιο σε κροκίνες και πικροκροκίνη ενώ είναι εμφανής η χαμηλή περιεκτικότητα σε σαφρανάλη λόγω του λιγώτερο πολικού της χαρακτήρα και της υψηλότερης διαλυτότητάς της σε οργανικά μέσα. Σε ό,τι αφορά στη σταθερότητά του, το λυόφιλο εκχύλισμα παραμένει σταθερό ως προς την περιεκτικότητά του σε κροκίνη όταν φυλάσσεται σε θερμοκρασία δωματίου για μεγάλο χρονικό διάστημα (τουλάχιστον 18 μήνες) ενώ το ανασυσταμένο διάλυμα μπορεί να επαναχρησιμοποιηθεί εντός 24 ωρών από την παρασκευή του. Το μονοδιαμερισματικό φαρμακοκινητικό μοντέλο κατανομής βρέθηκε να περιγράφει ικανοποιητικά την κινητική του κύριου μεταβολίτη της κροκίνης την κροκετίνη, μετά από ενδοφλέβια και peros χορήγηση με πρωτοταξική κινητική απορρόφησης. Μετά από peros χορήγηση του SFE σε δόση 60mg/kg επιτυγχάνονται επίπεδα Cmax = 2.77 μg/mL (%CV 2.17) και 3.84 μg/mL (%CV 1.6) για την κροκετίνη και την ολική κροκετίνη (κροκετίνη + μεταβολίτης) αντίστοιχα, σε χρόνο 30 min μετά τη χορήγηση, γεγονός που δείχνει ότι η κροκίνη υδρολύεται σε κροκετίνη στον εντερικό σωλήνα και απορροφάται στη συνέχεια γρήγορα με χρόνο επίτευξης μέγιστης συγκέντρωση τα 30 min. Τα αποτελέσματα των μετρήσεων στους ιστούς που μελετήθηκαν δείχνουν ότι η κροκετίνη φαίνεται να κατανέμεται κυρίως στο ήπαρ και τους νεφρούς, που είναι τα βασικά όργανα για τη βιομετατροπή και απομάκρυνσής της. Δεν ανιχνεύθηκαν μετρήσιμες τιμές για τη συγκέντρωση της κροκετίνης τόσο στους πνεύμονες όσο και στην καρδιά πιθανώς λόγω της ταχείας γλυκουρονιδίωσης προς τον αντίστοιχο μεταβολίτη. Σχετικά με τον μεταβολίτη της κροκετίνης, οι μετρούμενες συγκεντρώσεις δείχνουν περιορισμένη κατανομή στους ιστούς που μελετήθηκαν. Από τα αποτελέσματα της ΦΚ μελέτης προέκυψε ότι η χορηγηθείσα δόση του εκχυλίσματος (60mg/kg) οδήγησε σε επίπεδα συγκεντρώσεων κροκετίνης στον ορό του αίματος ανάλογα με αυτά που υπολογίστηκαν σε υγιείς εθελοντές μετά από χορήγηση καθαρής κροκετίνης (7,5 έως και 22,5 mg (1), που ισοδυναμεί με 0.11-0.32 mg/kg) και μετά την από του στόματος χορήγηση είτε κροκετίνης (40 nmol ή 0.37 mg/kg) είτε κροκίνης (40 nmol ή 1.12 mg/kg) σε μύες (2), και επέτρεψε την ασφαλή επιλογή δόσεων στο εύρος 30-90 mg/kg/ημέρα που αντιστοιχούν σε 2.90-8.70 mg/kg καθαρής κροκετίνης ή 0.33-0.66 mg/kg κροκίνης για να γίνει αξιολόγηση της αντιαθηρωματικής και αντιφλεγμονώδους δράσης του εκχυλίσματος. H μελέτη της επίδρασης του SFE στην αθηρωμάτωση έδειξε ότι το εκχύλισμα δεν επηρέασε το σωματικό βάρος των ζώων και τα επίπεδα ολικής χοληστερόλης (p>0.05). Η υψηλή δόση (90mg/kg βάρους) βελτίωσε σημαντικά το γλυκαιμικό προφίλ και τα επίπεδα των τριγλυκεριδίων σε σύγκριση με όλες τις άλλες ομάδες χορήγησης (p<0.05). Η μείωση της αορτικής στένωσης στις ομάδες των πειραματοζώων ακολούθησε δοσοεξαρτώμενη σχέση (p<0.05). Ακόμη, η αύξηση της δόσης SFE μείωσε αναλογικά το περιεχόμενο των αθηρωματικών αλλοιώσεων σε μακροφάγα και οδήγησε σε αυξημένα ποσοστά συνδετικού ιστού, ελαστίνης, κολλαγόνου και λείων μυικών κυττάρων οδηγώντας σε σταθερότερο φαινότυπο αθηρωμάτωσης σε σχέση με την ομάδα ελέγχου (COG, p<0.05). Η επίδραση αυτή επιβεβαιώνεται και από τη σημαντική μείωση (>30%) των επιπέδων IL-6, TNF-a, MCP-1, MMP-2,-3,-9 (p<0.05) και της αναλογίας MMP-2/TIMP-2. Από την ανάλυση RT-qPCR, προέκυψαν παρόμοια αποτελέσματα που επιβεβαίωσαν τα αποτελέσματα της ανοσοϊστοχημείας. Πιο συγκεκριμένα, έδειξαν ότι η γονιδιακή έκφραση των αντιφλεγμονωδών παραγόντων IL-6, MCP-1 και TNF-a ήταν στατιστικά σημαντικά μειωμένη για όλες τις ομάδες μυών που έλαβαν υδατικό εκχύλισμα κρόκου σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (p<0.05) και μάλιστα η μείωση της έκφρασης ήταν δοσοεξαρτώμενη. Παρόμοια ήταν και τα αποτελέσματα για τις μεταλλοπρωτεϊνάσες που μετρήθηκαν (MMP-2, MMP-9), ενώ ο αναστολέας τους ΤΙΜΡ-2 –όπως ήταν αναμενόμενο- παρουσίασε αυξημένη έκφραση στις ομάδες που έλαβαν θεραπεία.. Συμπεράσματα: To SFE είναι σταθερό λυόφιλο εκχύλισμα πλούσιο σε all trans-κροκίνη. Η φαρμακοκινητική μελετη επέτρεψε να προσδιοριστούν οι βασικές φαρμακοκινητικές παράμετροι και η σχετική βιοδιαθεσιμότητα του κύριου βιοδραστικού συστατικού, κροκετίνη, μετά από peros χορήγηση, ενώ ταυτόχρονα έδωσε τη δυνατότητα σωστής επιλογής του εύρους των δόσεων που χορηγήθηκαν για να γίνει αξιολόγηση της αθηροπροστατευτικής και αντιαθηρωματικής δράσης του εκχυλίσματος. Το SFE επέδειξε δοσοεξαρτώμενη αντιαθηρωματική δράση (μείωση έκτασης και σταθεροποίηση αθηρωματικών πλακών) σε μύες με ομόζυγη έλλειψη της απολιποπρωτεΐνης Ε (ApoE-/-) πιθανότατα μέσω της επίδρασης/τροποποίησης των μηχανισμών φλεγμονής της αθηρωματικής νόσου.Background and aims: The aims of the present study were: 1) the production, identification and quantification of a solid aqueous saffron extract (Crocus sativus L., SFE), 2) the in vitro study of its stability and content in bioactive components, 3) the in vivo pharmacokinetic study of its main antioxidant component (crocetin after crocin hydrolysis) and 4) the investigation of its possible antiatherosclerotic properties in ApoE knockout mice (ApoE-/-) after the administration of 3 different doses (30-60-90 mg/ kg body weight) and its possible mechanism of action. Methods: The production of saffron aqueous extract was accomplished with the mixture of Crocus sativus L. stigmas with distilled water. The mixture was let in the refrigerator for 3 days till the extraction to be completed. The extract was then infiltrated and lyophilized. The lyophilized product was studied for its chemical composition with the help of semi-preparative HPLC analysis and NMR spectroscopy, and then quantified to identify its major components (crocin, safranal). The SFE was then studied for its stability concerning its major component, crocin. Intravenous and peros administration to 80 C57Bl/6J mice at a dose of 60 mg/kg body weight followed in order to assess the pharmacokinetic properties and bioavailability of the main bioactive component of SFE, crocetin (hydrolyzed form of crocin). Samples were collected at selected time points after administration (5, 15, 30, 60, 90, 120, 180 and 240 min). The quantification of crocetin in biological samples (serum and tissues) was accomplished after the optimization of an HPLC-PDA analysis method. The data obtained (Concentration vs time) for both serum and tissue samples were subjected to both compartmental and non-compartmental PK analysis to estimate the pharmacokinetic parameters and characterize crocetin’s PK profile. Finally, for the estimation of SFE’s possible antiatherosclerotic/atheroprotective effect fifty male, ApoE-/- mice, fed high-fat diet (HFD) for 12 weeks, were randomized into 5 equally numbered groups: 1) Baseline group, euthanatized, without intervention on the 12th week, 2) three saffron groups (SF1, SF2, SF3) receiving HFD and 30-,60-,90mg/kg/day of SFE, respectively, for four weeks, peros through gavage, after reconstitution in water for injection (WFI), 3) control group (COG) receiving daily HFD and the same volume of WFI (four weeks). After blood sampling and euthanasia, aortic roots were excised and analyzed for the gene expression and/or percentage of aortic stenosis, relative content of macrophages, smooth muscle cells (SMCs), connective tissue, tumor necrosis factor-α (TNF-a), monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), matrix metalloproteinases-2,-3,-9 (MMP-2,-3,-9) and their inhibitor (TIMP-2) and IL-6, with the use of immunohistochemical and qRT-PCR techniques. Results: The saffron extract (SFE) that was produced was found rich in crocins and picrocrocin, whereas safranal was found in very low concentrations due to its less polar character which requires organic solvents to be solubilized. As far as its stability is concerned, SFE remains stable (crocin concentration) when kept in room temperature for a long period of time (at least 18 months), and the reconstituted solution can be re-used for the first 24 hours after reconstitution. The one-compartment model was found to describe adequately the kinetics of SFE’s main metabolite crocetin after intravenous and peros administration. After peros administration of SFE at a dose of 60 mg/kg body weight Cmax was found to be 2.77 μg/mL (%CV 2.17) and 3.84 (%CV1.6) for free and total crocetin respectively, which shows that crocin is hydrolyzed into crocetin in the intestinal lumen and then quickly absorbed (Tmax=30 min). The measurement results of the studied tissue samples show that crocetin is mainly distributed in the liver and the kidneys, which are the basic organs of its biotransformation and elimination. No measurable crocetine concentrations could be obtained from both lungs and heart samples, most probably because of its fast glucuronidation into crocetin’s metabolite. Concerning crocetin’s metabolite, the measured concentration values reveal limited distribution to the studied tissues. The results of the PK study lead to the conclusion that the administered SFE dose (60 mg/kg) was capable in achieving serum concentration levels proportional to those estimated in healthy volunteers after administration of pure crocetin (7.5 up to 22.5 mg which is equivalent to 0.11-0.32 mg/kg body weight) (1) or after administration of crocin in mice (40 nmol or 1.12 mg/kg body weight) (2). These facts suggested the use of the dosage scheme between 30 and 90 mg/kg body weight/day which correspond to 2.90-8.70 mg/kg of pure crocetin or 0.33-0.33 mg/kg of crocin for the conduction of the study for the effect of SFE in atheromatosis and inflammation generally. The study of the effect of SFE in atheromatosis, revealed that the administration of the extract did not affect body weight and total cholesterol levels (p>0.05). High SFE dose significantly ameliorated glucose and triglycerides profiles compared to other groups (p<0.05). Following a dose-dependent-manner SFE considerably decreased aortic stenosis (p<0.05). Furthermore, increasing SFE doses proportionally reduced macrophages content and increased the content of collagen, elastin, SMCs, in plaques promoting more stable plaque phenotype compared to COG (p<0.05). Those effects seemed to be associated with considerable reduction (>30%) of IL-6, TNF-a, MCP-1, MMP-2,-3,-9 (p<0.05) and MMP-2/TIMP-2 ratio. RT-qPCR analysis reassured our previous results of immunohistochemistry. Conclusions: SFE is a stable lyophilized extract rich in all trans-crocins. The PK study allowed the estimation of basic PK parameters and the bioavailability of SFE’s main bioactive component, crocetin, after peros administration and helped in the selection of the right dosage range for the evaluation of SFE’s atheroprotective and anti-atherosclerotic effect. SFE exerted dose dependent anti-atherosclerotic and plaque-stabilizing effects in Apo-E-/- mice, probably mediated by favorable modification of inflammatory mechanisms

Pharmacokinetic Characteristics of Nebulized Colistimethate Sodium Using Two Different Types of Nebulizers in Critically Ill Patients with Ventilator-Associated Respiratory Infections

Colistin pharmacokinetics; Critically ill; Inhaled colistinFarmacocinética de la colistina; Enfermo crítico; Colistina inhaladaFarmacocinètica de la colistina; Malalt crític; Colistina inhaladaBackground: Rising antimicrobial resistance has led to a revived interest in inhaled colistin treatment in the critically ill patient with ventilator-associated respiratory infection (VARI). Nebulization via vibrating mesh nebulizers (VMNs) is considered the current standard-of-care, yet the use of generic jet nebulizers (JNs) is more widespread. Few data exist on the intrapulmonary pharmacokinetics of colistin when administered through VMNs, while there is a complete paucity regarding the use of JNs. Methods: In this study, 18 VARI patients who received 2 million international units of inhaled colistimethate sodium (CMS) through a VMN were pharmacokinetically compared with six VARI patients who received the same drug dose through a JN, in the absence of systemic CMS administration. Results: Surprisingly, VMN and JN led to comparable formed colistin exposures in the epithelial lining fluid (ELF) (median (IQR) AUC0–24: 86.2 (46.0–185.9) mg/L∙h with VMN and 91.5 (78.1–110.3) mg/L∙h with JN). The maximum ELF concentration was 10.4 (4.7–22.6) mg/L and 7.4 (6.2–10.3) mg/L, respectively. Conclusions: Based on our results, JN might be considered a viable alternative to the theoretically superior VMN. Therapeutic drug monitoring in the ELF can be advised due to the observed low exposure, high variability, and appreciable systemic absorption.This research was funded by Norma Hellas S.A., grant number 06797/2017, managed by the Special Research Account of the National and Kapodistrian University of Athens (ELKE)

Blood-based analysis of type-2 diabetes mellitus susceptibility genes identifies specific transcript variants with deregulated expression and association with disease risk

Despite significant progress by genome-wide association studies, the ability of genetic variants to conduce to the prediction or prognosis of type-2 diabetes (T2D) is weak. Expression analysis of the corresponding genes may suggest possible links between single-nucleotide polymorphisms and T2D phenotype and/or risk. Herein, we investigated the expression patterns of 24 T2D-susceptibility genes, and their individual transcript variants (tv), in peripheral blood of T2D patients and controls (CTs), applying RNA-seq and real-time qPCR methodologies, and explore possible associations with disease features. Our data revealed the deregulation of certain transcripts in T2D patients. Among them, the down-regulation of CAPN10 tv3 was confirmed as an independent predictor for T2D. In patients, increased expression of CDK5 tv2, CDKN2A tv3 or THADA tv5 correlated positively with serum insulin levels, of CDK5 tv1 positively with % HbA1c levels, while in controls, elevated levels of TSPAN8 were associated positively with the presence of T2D family history. Herein, a T2D-specific expression profile of specific transcripts of disease-susceptibility genes is for the first time described in human peripheral blood. Large-scale studies are needed to evaluate the potential of these molecules to serve as disease biomarkers

Экспериментальное изучение влияния глюкозамина гидрохлорида на развитие патоспермии стареющих крыс, вызванной доксорубицином

ГЛЮКОЗАМИНА ГИДРОХЛОРИДДОКСОРУБИЦИНПАТОСПЕРМИЯСТАРЕНИЕФАРМАКОЛОГИЯ КЛИНИЧЕСКАЯЛЕКАРСТВ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕРЕПРОДУКЦИЮ КОНТРОЛИРУЮЩИЕ СРЕДСТВАЭКСПЕРИМЕНТЫ НА ЖИВОТНЫХКРЫСЫЦель работы - исследование влияния глюкозамина гидрохлорида на развитие гипофункции семенников крыс, вызванной длительным введением доксорубицина на фоне старения животных

Η Ποιμαντική Αντιμετώπιση των Καρκινοπαθών

Είναι γεγονός πως τα τελευταία χρόνια αυξάνεται όλο και περισσότερο ο αριθμός των ανθρώπων που εμφανίζουν κάποιο νεόπλασμα, αυτός είναι και ο λόγος που επιλέχθηκε η συγκεκριμένη θεματική. Η ασθένεια αυτή αποτελεί για τον άνθρωπο απειλή για μεγάλο μέρος της ζωής του και εκεί έγκειται και η δυσκολία στην προσέγγισή της. Από τη διάγνωση μέχρι την κατάληξη (θετική ή αρνητική) όποιος νοσεί κατακλείζεται από ανασφάλεια, συναισθηματική αναταραχή και μοναξιά. Η Εκκλησία στις περιπτώσεις των ογκολογικών ασθενών –όπως και όλων των υπολοίπων ασθενών, δεν μένει απαθής αλλά δείχνει έμπρακτα το ενδιαφέρον της μέσω της ποιμαντικής φροντίδας. Αυτή την εξιδικευμένη φροντίδα προσπαθήσαμε να συστηματοποιήσουμε σε ένα θέμα εξ ορισμού δύσκολο αλλά και συνάμα πάντα τόσο κοντά μας. Στο πρώτο μέρος της εργασίας γίνεται αναφορά στους όρους υγεία, ασθένεια και θάνατος σύμφωνα με την ιατρική πράξη και τη θεολογική σκέψη και επιχειρείται μία ιστορική αναδρομή στην ποιμαντική των νοσούντων από την περίοδο των πρώτων χριστιανών έως και τις μέρες μας. Στο δεύτερο μέρος παρουσιάζεται μία συνοπτική προσέγγιση της νόσου και της ψυχολογικής κατάστασης του ογκολογικόυ ασθενή. Και τέλος το τρίτο μέρος ολοκληρώνεται με την ποιμαντική φροντίδα και τις προυποθέσεις για την τέλεσή της προς όσους νοσούν και τους οικείους τους.It is a fact that in recent years the number of people who develop a tumor is increasing, this is the reason why this topic was chosen. This disease is a threat to man for much of his life and that is where the difficulty in approaching it lies. From the diagnosis to the end (positive or negative) whoever is ill is locked up with insecurity, emotional turmoil and loneliness. The Church in the cases of cancer patients - like all other patients, does not remain apathetic but shows its interest in practice through pastoral care. We tried to systematize this specialized care in a subject that is by definition difficult but at the same time always so close to us. The first part of the work refers to the terms health, illness and death according to medical practice and theological thought and attempts a historical review of the pastoral care of the sick from the period of the first Christians to the present day. The second part presents a brief approach to the disease and the psychological state of the oncology patient. And finally the third part is completed with the pastoral care and the preconditions for its performance to those who are ill and their relatives

In vitro evaluation and in vivo pharmacokinetic/ pharmacodynamic study of saffron aqueous extract: emphasis on its anti-atherosclerotic properties

Background and aims: The aims of the present study were: 1) the production, identification and quantification of a solid aqueous saffron extract (Crocus sativus L., SFE), 2) the in vitro study of its stability and content in bioactive components, 3) the in vivo pharmacokinetic study of its main antioxidant component (crocetin after crocin hydrolysis) and 4) the investigation of its possible antiatherosclerotic properties in ApoE knockout mice (ApoE-/-) after the administration of 3 different doses (30-60-90 mg/ kg body weight) and its possible mechanism of action. Methods: The production of saffron aqueous extract was accomplished with the mixture of Crocus sativus L. stigmas with distilled water. The mixture was let in the refrigerator for 3 days till the extraction to be completed. The extract was then infiltrated and lyophilized. The lyophilized product was studied for its chemical composition with the help of semi-preparative HPLC analysis and NMR spectroscopy, and then quantified to identify its major components (crocin, safranal). The SFE was then studied for its stability concerning its major component, crocin. Intravenous and peros administration to 80 C57Bl/6J mice at a dose of 60 mg/kg body weight followed in order to assess the pharmacokinetic properties and bioavailability of the main bioactive component of SFE, crocetin (hydrolyzed form of crocin). Samples were collected at selected time points after administration (5, 15, 30, 60, 90, 120, 180 and 240 min). The quantification of crocetin in biological samples (serum and tissues) was accomplished after the optimization of an HPLC-PDA analysis method. The data obtained (Concentration vs time) for both serum and tissue samples were subjected to both compartmental and non-compartmental PK analysis to estimate the pharmacokinetic parameters and characterize crocetin’s PK profile. Finally, for the estimation of SFE’s possible antiatherosclerotic/atheroprotective effect fifty male, ApoE-/- mice, fed high-fat diet (HFD) for 12 weeks, were randomized into 5 equally numbered groups: 1) Baseline group, euthanatized, without intervention on the 12th week, 2) three saffron groups (SF1, SF2, SF3) receiving HFD and 30-,60-,90mg/kg/day of SFE, respectively, for four weeks, peros through gavage, after reconstitution in water for injection (WFI), 3) control group (COG) receiving daily HFD and the same volume of WFI (four weeks). After blood sampling and euthanasia, aortic roots were excised and analyzed for the gene expression and/or percentage of aortic stenosis, relative content of macrophages, smooth muscle cells (SMCs), connective tissue, tumor necrosis factor-α (TNF-a), monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), matrix metalloproteinases-2,-3,-9 (MMP-2,-3,-9) and their inhibitor (TIMP-2) and IL-6, with the use of immunohistochemical and qRT-PCR techniques.Results: The saffron extract (SFE) that was produced was found rich in crocins and picrocrocin, whereas safranal was found in very low concentrations due to its less polar character which requires organic solvents to be solubilized. As far as its stability is concerned, SFE remains stable (crocin concentration) when kept in room temperature for a long period of time (at least 18 months), and the reconstituted solution can be re-used for the first 24 hours after reconstitution. The one-compartment model was found to describe adequately the kinetics of SFE’s main metabolite crocetin after intravenous and peros administration. After peros administration of SFE at a dose of 60 mg/kg body weight Cmax was found to be 2.77 μg/mL (%CV 2.17) and 3.84 (%CV1.6) for free and total crocetin respectively, which shows that crocin is hydrolyzed into crocetin in the intestinal lumen and then quickly absorbed (Tmax=30 min). The measurement results of the studied tissue samples show that crocetin is mainly distributed in the liver and the kidneys, which are the basic organs of its biotransformation and elimination. No measurable crocetine concentrations could be obtained from both lungs and heart samples, most probably because of its fast glucuronidation into crocetin’s metabolite. Concerning crocetin’s metabolite, the measured concentration values reveal limited distribution to the studied tissues. The results of the PK study lead to the conclusion that the administered SFE dose (60 mg/kg) was capable in achieving serum concentration levels proportional to those estimated in healthy volunteers after administration of pure crocetin (7.5 up to 22.5 mg which is equivalent to 0.11-0.32 mg/kg body weight) (1) or after administration of crocin in mice (40 nmol or 1.12 mg/kg body weight) (2). These facts suggested the use of the dosage scheme between 30 and 90 mg/kg body weight/day which correspond to 2.90-8.70 mg/kg of pure crocetin or 0.33-0.33 mg/kg of crocin for the conduction of the study for the effect of SFE in atheromatosis and inflammation generally. The study of the effect of SFE in atheromatosis, revealed that the administration of the extract did not affect body weight and total cholesterol levels (p>0.05). High SFE dose significantly ameliorated glucose and triglycerides profiles compared to other groups (p30%) of IL-6, TNF-a, MCP-1, MMP-2,-3,-9 (p0.05). Η υψηλή δόση (90mg/kg βάρους) βελτίωσε σημαντικά το γλυκαιμικό προφίλ και τα επίπεδα των τριγλυκεριδίων σε σύγκριση με όλες τις άλλες ομάδες χορήγησης (p30%) των επιπέδων IL-6, TNF-a, MCP-1, MMP-2,-3,-9 (p<0.05) και της αναλογίας MMP-2/TIMP-2. Από την ανάλυση RT-qPCR, προέκυψαν παρόμοια αποτελέσματα που επιβεβαίωσαν τα αποτελέσματα της ανοσοϊστοχημείας. Πιο συγκεκριμένα, έδειξαν ότι η γονιδιακή έκφραση των αντιφλεγμονωδών παραγόντων IL-6, MCP-1 και TNF-a ήταν στατιστικά σημαντικά μειωμένη για όλες τις ομάδες μυών που έλαβαν υδατικό εκχύλισμα κρόκου σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (p<0.05) και μάλιστα η μείωση της έκφρασης ήταν δοσοεξαρτώμενη. Παρόμοια ήταν και τα αποτελέσματα για τις μεταλλοπρωτεϊνάσες που μετρήθηκαν (MMP-2, MMP-9), ενώ ο αναστολέας τους ΤΙΜΡ-2 –όπως ήταν αναμενόμενο- παρουσίασε αυξημένη έκφραση στις ομάδες που έλαβαν θεραπεία.. Συμπεράσματα: To SFE είναι σταθερό λυόφιλο εκχύλισμα πλούσιο σε all trans-κροκίνη. Η φαρμακοκινητική μελετη επέτρεψε να προσδιοριστούν οι βασικές φαρμακοκινητικές παράμετροι και η σχετική βιοδιαθεσιμότητα του κύριου βιοδραστικού συστατικού, κροκετίνη, μετά από peros χορήγηση, ενώ ταυτόχρονα έδωσε τη δυνατότητα σωστής επιλογής του εύρους των δόσεων που χορηγήθηκαν για να γίνει αξιολόγηση της αθηροπροστατευτικής και αντιαθηρωματικής δράσης του εκχυλίσματος. Το SFE επέδειξε δοσοεξαρτώμενη αντιαθηρωματική δράση (μείωση έκτασης και σταθεροποίηση αθηρωματικών πλακών) σε μύες με ομόζυγη έλλειψη της απολιποπρωτεΐνης Ε (ApoE-/-) πιθανότατα μέσω της επίδρασης/τροποποίησης των μηχανισμών φλεγμονής της αθηρωματικής νόσου

EXPLORING THE INTERACTIONS OF IRBESARTAN AND IRBESARTAN–2-HYDROXYPROPYL-Β-CYCLODEXTRIN COMPLEX IN MICELLES

Irbesartan is a beneficial drug against hypertension and other diseases. Although it is a polydynamic drug, it suffers from high lipophilicity. New formulations of the drug may increase its efficient pharmacological profile. Towards this aim, we have studied the interactions of irbesartan in simple or complexed form with 2-hydroxypropyl-cyclodextrin in micelles. The interactions of the drug in the two forms in the micelle environment are discussed. Of special interest, is the highly flexibility of the spacer phenyl ring