On-Line influenza virus quantification for viral production processes thanks to affinity-based surface plasmon resonance biosensor

Influenza virus seasonal epidemics, associated with the constant threat of new pandemic outbreak, challenge vaccine manufacturers to develop responsive processes that can outreach the limitations of traditional egg-based technology. Recent progress made regarding cell culture bioprocesses allowed for numerous alternative strategies to developed future vaccine candidates, as for example the recombinant HA or Virus—like Particles (VLP) vaccines. However, while cell culture allows for more versatility than ovoculture, regarding process development and monitoring, these alternatives still require optimization to seriously concurrence the traditional process. To drive these developments, WHO and regulatory agencies underlined the need for developing better influenza vaccine potency assays1,2. Actual influenza vaccine formulation and lot release rely on single-radial immunodiffusion (SRID) assay, which requires strain-specific reference sera and antigen reagents. However, the annual preparation of these reagents takes between 2 to 6 months and constitutes a critical bottleneck for the release of vaccine lots3. Additionally, SRID is not implementable for process development as such technique cannot handle in-process low concentrated and non-purified material. We developed an assay for rapid and label-free quantification of influenza hemagglutinin (HA) antigen and influenza virus based on surface plasmon resonance (SPR). The method is based on affinity capture of hemagglutinin antigen by sialic-acid terminated glycans present at the surface of the fetuin-functionalized sensor. Conditions were optimized for the regeneration of the surface, in order to run multiple sequential analyses on a unique sensor. Two types of purified standard were used during the development of the assay. Commercial trivalent inactivated vaccine (“TIV”) has been used for the determination of optimal analytical conditions, while a stock of split inactivated H1N1 virus has been produced and calibrated in our laboratory to study the specific response obtained toward this HA subtype. This assay offers a quantification of influenza hemagglutinin within minutes with a wide dynamic range (30 ng/mL-20 µg/mL). Also, the technique provides a limit of detection (LOD) 100 times lower than SRID, and a better reproducibility than SRID and its potential alternatives recently proposed (1,4,5. Additionally, the applicability of this assay for an on-line vaccine production monitoring has been validated by off-line measurement of influenza H1N1 virus particles derived from cell culture supernatant. Such a test allowed to achieve a LOD of 106 Infectious Viral Particles/mL Thus, our assay provides an innovative tool to evaluate influenza new vaccine bioprocesses, from viral production kinetics in mammalian cell culture to vaccine potency evaluation

Développement d'une nouvelle technique bioanalytique basée sur l'imagerie par résonance plasmonique de surface pour le suivi en-ligne de virus influenza dans les bioprocédés vaccinaux

Influenza virus seasonal epidemics, associated with the constant threat of new pandemic outbreak, challenge vaccine manufacturers to develop responsive processes that can outreach the limitations of traditional egg-based technology. However, while cell culture allows for more versatility regarding process development and monitoring, these alternatives still require optimization to seriously concurrence the traditional process. FDA’s Process analytical Technology (PAT) and Quality by Design (QbD) guidances impels vaccine manufacturers to implement on-line technologies to monitor both critical process parameters (CPP) and the bioproduct’s critical quality attributes (CQA) within bioprocesses. Today, Influenza vaccine potency is evaluated by single-radial immunodiffusion (SRID), which requires the annual production of strain-specific reagents that constitutes a potential bottleneck for the release of vaccine lots and cannot be implemented for in-process monitoring. On the other hand, while recent physical quantification techniques appear more relevant than traditional infectivity assays for influenza virus monitoring as the ratio of total to infectious influenza virus vary from 10-1000, they are not potency-indicating. During this thesis, we developed and evaluated a potency-indicating assay for rapid and label-free quantification of influenza hemagglutinin (HA) antigens and whole influenza viruses based on quantitative surface plasmon resonance imaging (SPRi). The method is based on affinity capture of hemagglutinin antigen by sialic-acid terminated glycans. Conditions were optimized for the regeneration of the surface, in order to run multiple sequential analyses. Influenza vaccine and virus samples derived from various cell culture platforms were processed onto the sensor to evaluate viral production kinetics. This assay offers a quantification of influenza hemagglutinin within minutes with a wide dynamic range (30 ng HA/mL-20 μg HA/mL). Also, the technique provides a limit of detection (LOD) 100 times lower than SRID, as well as a better reproducibility than SRID and its potential alternatives (<5% RSD vs 6-15%). Such a test also allowed to achieve a LOD <106 Infectious Viral Particles/mL. The applicability of this assay for in-process monitoring of influenza vaccine production has been validated by the determination of influenza virus production kinetics in good correlation with both total viral particle content and total HA protein content in two production cell lines. We validated the potency-indicating nature of this assay. Finally, we designed and evaluated an automated sampling and purification line for at-line (frequency of analysis : 1h-1) monitoring of bioactive influenza virus production kinetics in suspension cell culture. Thus, this work provides an innovative tool for the development of novel influenza vaccine bioprocesses, supporting the PAT initiativeLes épidémies saisonnières du virus de la grippe, associées à la menace constante d'une nouvelle pandémie, incitent les fabricants de vaccins à développer des procédés plus réactifs que le procédé traditionnel basé sur l’ovoculture. Bien que les procédés alternatifs développés, basés sur la culture cellulaire, offrent de nombreux avantages ils nécessitent encre des optimisations afin de pouvoir concurrencer sérieusement le processus traditionnel. Ainsi, les autorités régulatrices incitent les fabricants de vaccins à développer des outils analytiques en-ligne pour surveiller à la fois les paramètres critiques du procédé (CPP) et les attributs de qualité critiques (CQA) des produits dans les bioprocédés dans le cadre de la démarche Process Analytical Technology. Aujourd'hui, la technique de référence pour le dosage d’activité vaccinale est l’immunodiffusion radiale (SRID). Elle nécessite une production annuelle de réactifs potentiellement critique pour la libération des lots et ne peut pas être mis en œuvre pour du suivi de procédé. Les techniques de quantification physique (TRPS, virométrie, NTA…) récentes apparaissent plus appropriées que les dosages d'infectivité traditionnels pour du suivi en-ligne étant donné le ratio entre les particules virales totales et infectieuse de 10-10000. Cependant, ces techniques ne fournissent pas d’information concernant l’activité vaccinale. Au cours de cette thèse a été développé un test analytique pour la quantification de l'hémagglutinine (HA) et de virus bioactifs basé sur l'imagerie par résonance plasmonique de surface (SPRi). La méthode est basée sur la capture par affinité de HA par les glycanes possédant une extrémité terminale de type acide sialique. Les conditions ont été optimisées pour offrir une régénération de la surface afin d'effectuer des analyses séquentielles. Des échantillons de vaccins et de virus produits sur diverses plateformes/substrats de culture cellulaire ont été analysés sur le capteur dans le but d’évaluer les cinétiques de production virale. Ce test permet une évaluation rapide (<10 mins) de l’activité de l'hémagglutinine grippale avec une gamme analytique large (30 ng HA.mL-1-20 μg HA.mL-1). De plus, la technique offre une limite de détection (LOD) 100 fois inférieure à SRID, ainsi qu'une meilleure reproductibilité que la SRID et ses alternatives potentielles (<5% RSD vs 6-15%). Un tel test a également permis d'atteindre une LOD <106 particules virales infectieuses.mL-1. L'applicabilité de ce test pour le suivi en-ligne des bioprocédés a été validée par l’évaluations de cinétiques de production virales, offrant bonne corrélation avec la concentration en particules virales totales et la quantité totale en protéines HA dans deux lignées cellulaires de production. Nous avons également validé que ce test permettait une évaluation de l’activité pour du virus entier. Enfin, nous avons conçu et évalué une ligne d'échantillonnage et de purification automatisée pour l’évaluation en-ligne de la cinétique de production virale dans une culture cellulaire aviaire en suspension. Ce travail de thèse a ainsi permis de fournir un outil innovant pour le développement de nouveaux bioprocédés vaccinaux (suivi en-ligne, formulation, études de stabilité), soutenant l'initiative PA

Développement d'une nouvelle technique bioanalytique basée sur l'imagerie par résonance plasmonique de surface pour le suivi en-ligne de virus influenza dans les bioprocédés vaccinaux

Influenza virus seasonal epidemics, associated with the constant threat of new pandemic outbreak, challenge vaccine manufacturers to develop responsive processes that can outreach the limitations of traditional egg-based technology. However, while cell culture allows for more versatility regarding process development and monitoring, these alternatives still require optimization to seriously concurrence the traditional process. FDA’s Process analytical Technology (PAT) and Quality by Design (QbD) guidances impels vaccine manufacturers to implement on-line technologies to monitor both critical process parameters (CPP) and the bioproduct’s critical quality attributes (CQA) within bioprocesses. Today, Influenza vaccine potency is evaluated by single-radial immunodiffusion (SRID), which requires the annual production of strain-specific reagents that constitutes a potential bottleneck for the release of vaccine lots and cannot be implemented for in-process monitoring. On the other hand, while recent physical quantification techniques appear more relevant than traditional infectivity assays for influenza virus monitoring as the ratio of total to infectious influenza virus vary from 10-1000, they are not potency-indicating. During this thesis, we developed and evaluated a potency-indicating assay for rapid and label-free quantification of influenza hemagglutinin (HA) antigens and whole influenza viruses based on quantitative surface plasmon resonance imaging (SPRi). The method is based on affinity capture of hemagglutinin antigen by sialic-acid terminated glycans. Conditions were optimized for the regeneration of the surface, in order to run multiple sequential analyses. Influenza vaccine and virus samples derived from various cell culture platforms were processed onto the sensor to evaluate viral production kinetics. This assay offers a quantification of influenza hemagglutinin within minutes with a wide dynamic range (30 ng HA/mL-20 μg HA/mL). Also, the technique provides a limit of detection (LOD) 100 times lower than SRID, as well as a better reproducibility than SRID and its potential alternatives (<5% RSD vs 6-15%). Such a test also allowed to achieve a LOD <106 Infectious Viral Particles/mL. The applicability of this assay for in-process monitoring of influenza vaccine production has been validated by the determination of influenza virus production kinetics in good correlation with both total viral particle content and total HA protein content in two production cell lines. We validated the potency-indicating nature of this assay. Finally, we designed and evaluated an automated sampling and purification line for at-line (frequency of analysis : 1h-1) monitoring of bioactive influenza virus production kinetics in suspension cell culture. Thus, this work provides an innovative tool for the development of novel influenza vaccine bioprocesses, supporting the PAT initiativeLes épidémies saisonnières du virus de la grippe, associées à la menace constante d'une nouvelle pandémie, incitent les fabricants de vaccins à développer des procédés plus réactifs que le procédé traditionnel basé sur l’ovoculture. Bien que les procédés alternatifs développés, basés sur la culture cellulaire, offrent de nombreux avantages ils nécessitent encre des optimisations afin de pouvoir concurrencer sérieusement le processus traditionnel. Ainsi, les autorités régulatrices incitent les fabricants de vaccins à développer des outils analytiques en-ligne pour surveiller à la fois les paramètres critiques du procédé (CPP) et les attributs de qualité critiques (CQA) des produits dans les bioprocédés dans le cadre de la démarche Process Analytical Technology. Aujourd'hui, la technique de référence pour le dosage d’activité vaccinale est l’immunodiffusion radiale (SRID). Elle nécessite une production annuelle de réactifs potentiellement critique pour la libération des lots et ne peut pas être mis en œuvre pour du suivi de procédé. Les techniques de quantification physique (TRPS, virométrie, NTA…) récentes apparaissent plus appropriées que les dosages d'infectivité traditionnels pour du suivi en-ligne étant donné le ratio entre les particules virales totales et infectieuse de 10-10000. Cependant, ces techniques ne fournissent pas d’information concernant l’activité vaccinale. Au cours de cette thèse a été développé un test analytique pour la quantification de l'hémagglutinine (HA) et de virus bioactifs basé sur l'imagerie par résonance plasmonique de surface (SPRi). La méthode est basée sur la capture par affinité de HA par les glycanes possédant une extrémité terminale de type acide sialique. Les conditions ont été optimisées pour offrir une régénération de la surface afin d'effectuer des analyses séquentielles. Des échantillons de vaccins et de virus produits sur diverses plateformes/substrats de culture cellulaire ont été analysés sur le capteur dans le but d’évaluer les cinétiques de production virale. Ce test permet une évaluation rapide (<10 mins) de l’activité de l'hémagglutinine grippale avec une gamme analytique large (30 ng HA.mL-1-20 μg HA.mL-1). De plus, la technique offre une limite de détection (LOD) 100 fois inférieure à SRID, ainsi qu'une meilleure reproductibilité que la SRID et ses alternatives potentielles (<5% RSD vs 6-15%). Un tel test a également permis d'atteindre une LOD <106 particules virales infectieuses.mL-1. L'applicabilité de ce test pour le suivi en-ligne des bioprocédés a été validée par l’évaluations de cinétiques de production virales, offrant bonne corrélation avec la concentration en particules virales totales et la quantité totale en protéines HA dans deux lignées cellulaires de production. Nous avons également validé que ce test permettait une évaluation de l’activité pour du virus entier. Enfin, nous avons conçu et évalué une ligne d'échantillonnage et de purification automatisée pour l’évaluation en-ligne de la cinétique de production virale dans une culture cellulaire aviaire en suspension. Ce travail de thèse a ainsi permis de fournir un outil innovant pour le développement de nouveaux bioprocédés vaccinaux (suivi en-ligne, formulation, études de stabilité), soutenant l'initiative PA

Development of a new bioanalytical technique based on surface plasmon resonance imaging for the on-line monitoring of influenza viruses influenza viruses in vaccine bioprocesses

Les épidémies saisonnières du virus de la grippe, associées à la menace constante d'une nouvelle pandémie, incitent les fabricants de vaccins à développer des procédés plus réactifs que le procédé traditionnel basé sur l’ovoculture. Bien que les procédés alternatifs développés, basés sur la culture cellulaire, offrent de nombreux avantages ils nécessitent encre des optimisations afin de pouvoir concurrencer sérieusement le processus traditionnel. Ainsi, les autorités régulatrices incitent les fabricants de vaccins à développer des outils analytiques en-ligne pour surveiller à la fois les paramètres critiques du procédé (CPP) et les attributs de qualité critiques (CQA) des produits dans les bioprocédés dans le cadre de la démarche Process Analytical Technology. Aujourd'hui, la technique de référence pour le dosage d’activité vaccinale est l’immunodiffusion radiale (SRID). Elle nécessite une production annuelle de réactifs potentiellement critique pour la libération des lots et ne peut pas être mis en œuvre pour du suivi de procédé. Les techniques de quantification physique (TRPS, virométrie, NTA…) récentes apparaissent plus appropriées que les dosages d'infectivité traditionnels pour du suivi en-ligne étant donné le ratio entre les particules virales totales et infectieuse de 10-10000. Cependant, ces techniques ne fournissent pas d’information concernant l’activité vaccinale. Au cours de cette thèse a été développé un test analytique pour la quantification de l'hémagglutinine (HA) et de virus bioactifs basé sur l'imagerie par résonance plasmonique de surface (SPRi). La méthode est basée sur la capture par affinité de HA par les glycanes possédant une extrémité terminale de type acide sialique. Les conditions ont été optimisées pour offrir une régénération de la surface afin d'effectuer des analyses séquentielles. Des échantillons de vaccins et de virus produits sur diverses plateformes/substrats de culture cellulaire ont été analysés sur le capteur dans le but d’évaluer les cinétiques de production virale. Ce test permet une évaluation rapide (<10 mins) de l’activité de l'hémagglutinine grippale avec une gamme analytique large (30 ng HA.mL-1-20 μg HA.mL-1). De plus, la technique offre une limite de détection (LOD) 100 fois inférieure à SRID, ainsi qu'une meilleure reproductibilité que la SRID et ses alternatives potentielles (<5% RSD vs 6-15%). Un tel test a également permis d'atteindre une LOD <106 particules virales infectieuses.mL-1. L'applicabilité de ce test pour le suivi en-ligne des bioprocédés a été validée par l’évaluations de cinétiques de production virales, offrant bonne corrélation avec la concentration en particules virales totales et la quantité totale en protéines HA dans deux lignées cellulaires de production. Nous avons également validé que ce test permettait une évaluation de l’activité pour du virus entier. Enfin, nous avons conçu et évalué une ligne d'échantillonnage et de purification automatisée pour l’évaluation en-ligne de la cinétique de production virale dans une culture cellulaire aviaire en suspension. Ce travail de thèse a ainsi permis de fournir un outil innovant pour le développement de nouveaux bioprocédés vaccinaux (suivi en-ligne, formulation, études de stabilité), soutenant l'initiative PATInfluenza virus seasonal epidemics, associated with the constant threat of new pandemic outbreak, challenge vaccine manufacturers to develop responsive processes that can outreach the limitations of traditional egg-based technology. However, while cell culture allows for more versatility regarding process development and monitoring, these alternatives still require optimization to seriously concurrence the traditional process. FDA’s Process analytical Technology (PAT) and Quality by Design (QbD) guidances impels vaccine manufacturers to implement on-line technologies to monitor both critical process parameters (CPP) and the bioproduct’s critical quality attributes (CQA) within bioprocesses. Today, Influenza vaccine potency is evaluated by single-radial immunodiffusion (SRID), which requires the annual production of strain-specific reagents that constitutes a potential bottleneck for the release of vaccine lots and cannot be implemented for in-process monitoring. On the other hand, while recent physical quantification techniques appear more relevant than traditional infectivity assays for influenza virus monitoring as the ratio of total to infectious influenza virus vary from 10-1000, they are not potency-indicating. During this thesis, we developed and evaluated a potency-indicating assay for rapid and label-free quantification of influenza hemagglutinin (HA) antigens and whole influenza viruses based on quantitative surface plasmon resonance imaging (SPRi). The method is based on affinity capture of hemagglutinin antigen by sialic-acid terminated glycans. Conditions were optimized for the regeneration of the surface, in order to run multiple sequential analyses. Influenza vaccine and virus samples derived from various cell culture platforms were processed onto the sensor to evaluate viral production kinetics. This assay offers a quantification of influenza hemagglutinin within minutes with a wide dynamic range (30 ng HA/mL-20 μg HA/mL). Also, the technique provides a limit of detection (LOD) 100 times lower than SRID, as well as a better reproducibility than SRID and its potential alternatives (<5% RSD vs 6-15%). Such a test also allowed to achieve a LOD <106 Infectious Viral Particles/mL. The applicability of this assay for in-process monitoring of influenza vaccine production has been validated by the determination of influenza virus production kinetics in good correlation with both total viral particle content and total HA protein content in two production cell lines. We validated the potency-indicating nature of this assay. Finally, we designed and evaluated an automated sampling and purification line for at-line (frequency of analysis : 1h-1) monitoring of bioactive influenza virus production kinetics in suspension cell culture. Thus, this work provides an innovative tool for the development of novel influenza vaccine bioprocesses, supporting the PAT initiativ

SPRi-based hemagglutinin quantitative assay for influenza vaccine production monitoring

International audienc

High Risk of Anal and Rectal Cancer in Patients With Anal and/or Perianal Crohn’s Disease

International audienceBackground & AimsLittle is known about the magnitude of the risk of anal and rectal cancer in patients with anal and/or perineal Crohn’s disease. We aimed to assess the risk of anal and rectal cancer in patients with Crohn’s perianal disease followed up in the Cancers Et Surrisque Associé aux Maladies Inflammatoires Intestinales En France (CESAME) cohort.MethodsWe collected data from 19,486 patients with inflammatory bowel disease (IBD) enrolled in the observational CESAME study in France, from May 2004 through June 2005; 14.9% of participants had past or current anal and/or perianal Crohn’s disease. Subjects were followed up for a median time of 35 months (interquartile range, 29–40 mo). To identify risk factors for anal cancer in the total CESAME population, we performed a case-control study in which participants were matched for age and sex.ResultsAmong the total IBD population, 8 patients developed anal cancer and 14 patients developed rectal cancer. In the subgroup of 2911 patients with past or current anal and/or perianal Crohn’s lesions at cohort entry, 2 developed anal squamous-cell carcinoma, 3 developed perianal fistula–related adenocarcinoma, and 6 developed rectal cancer. The corresponding incidence rates were 0.26 per 1000 patient-years for anal squamous-cell carcinoma, 0.38 per 1000 patient-years for perianal fistula–related adenocarcinoma, and 0.77 per 1000 patient-years for rectal cancer. Among the 16,575 patients with ulcerative colitis or Crohn’s disease without anal or perianal lesions, the incidence rate of anal cancer was 0.08 per 1000 patient-years and of rectal cancer was 0.21 per 1000 patient-years. Among factors tested by univariate conditional regression (IBD subtype, disease duration, exposure to immune-suppressive therapy, presence of past or current anal and/or perianal lesions), the presence of past or current anal and/or perianal lesions at cohort entry was the only factor significantly associated with development of anal cancer (odds ratio, 11.2; 95% CI, 1.18-551.51; P = .03).ConclusionsIn an analysis of data from the CESAME cohort in France, patients with anal and/or perianal Crohn’s disease have a high risk of anal cancer, including perianal fistula–related cancer, and a high risk of rectal cancer