Investigating physical factors that regulate morphogenesis and fate of mouse embryonic midline sutures

Stem cells are crucial players during development, homeostasis and tissue regeneration and their interactions with the surrounding microenvironment are key to regulate stem cell fate. The skull's stem cell niches reside in the fibrous joints that connect flat bones of the skull. In the embryo, bone and sutures develop in concert to form a complex, multi-facted structure that requires interaction with multiple differentiating cell types to maintain balance between growth and differentiation. Disruption of this balance drives changes in size and shape of skull bones and can severely impact quality of life. Cranial sutures, often seen as simple extracellular matrix-rich structures bridging the rigid plates of the skull, are major actors in craniofacial morphogenesis of as they harmonize bone growth with expansion of the developing brain and participate in providing osteoblasts during repair. The complexity of the extracellular environment and the important role for sutures in skeletal development makes these niches a compelling structure to investigate how interactions with the surrounding microenvironment can modulate stem cells fate. The key role of sutures in development is highlighted by the numerous severe dysmorphisms arising from failure to maintain suture patency. The ability of the suture to respond to brain growth or trauma and the dysmophisms presented by patients with defective sutures is mediated by both biochemical and mechanical cues but the cell biology of these niches remains elusive, especially during their development. In particular, few studies have shed light on the underlying cellular behaviors behind microenvironmental regulation of cranial suture stem cell fate and what role mechanical inputs play in the establishment of this niche. In my thesis, I addressed gaps in our understanding of suture biology by characterizing the suture stem cell niche microenvironment and exploring how cell-ECM interactions serve as regulators of suture stem cell fate. Making use of various microscopy and analytical techniques I first characterized the composition of the microenvironment in a developing suture niche, such as organization of ECM, cytoskeleton and nuclear morphologies. My work builds on an incomplete transcriptional understanding of suture cell development, such that specific genetic markers are rarely useful for identifying distinct suture cell populations during its morphogenesis. By applying shape description tools to parse suture cells and test whether shape correlates to cell identity, we concluded that suture nuclei are distinct and less spherical than those of other cranial tissues. Using 'global' markers such as nuclear stains, I have also identified physical distinctions between suture nuclei and neighboring tissues, indicating that cell shape is an integral part of midline suture identity and can be used to explore coordination of fate choice and morphogenesis in this enigmatic structure. In addition, I present evidence that supports that maturation of extracellular matrix begins during early stages of suture development. In particular, embryonic midline sutures express high levels of fibrillary collagen, which contributes to the formation of a complex extracellular environment that provides the suture with physical properties distinct from those of developing bones. My work shows the presence of cell-ECM and cell-cell adhesions in the developing midline sutures, as well as a complex actin cytoskeleton that is, in part, mediated by physical stresses resultant from underlying brain expansion. Secondly, I aimed to address how perturbations in ECM composition can affect cell specification. To investigate the importance of ECM maturation in regulating suture cell fate I inhibited the function of lysyl oxidase, a collagen crosslinker, during embryonic development. Disruption of collagen crosslinking altered expression of collagen and ECM receptor encoding genes. In addition, this inhibition induced changes in the shape and size of collagen fibers in the embryonic midline suture and decreased tissue bulk stiffness relative to WT. These abnormal properties of the ECM impact tissue delineation in the cranial mesenchyme through nuclear shape analyses. This might be explained by observed changes in the composition of the nuclear envelop of suture cells as we find altered lamin concentration and localization upon lysyl oxidase inhibition. The work developed during myPhD steps away from the traditional genetic approaches used to study the embryonic suture and provides the first in-depth analysis of the physical properties of the developing midline suture at stages preceding known establishment of the niche. The various methods and analyses applied reveal a complex organization of embryonic suture ECM and its tight relationship with shape and fate in this tissue. This work serves as a foundation for future studies that can explore the mechanisms through which ECM regulates fate and development of the suture niche, and potentially skeletal development more generally

New insights into interferon-mediated immune responses elicited by Plasmodium liver stage infection. Unravelling the role of Viperin induction

Malaria is a mosquito-borne infectious disease caused by Plasmodium parasites. Despite the efforts being put into the malaria control, the development of efficient therapies has been hindered by the lack of knowledge on the parasite-elicited immune responses. Recent work showed that Plasmodium triggers an innate type I IFN response in the liver, resulting in the induction of interferonstimulated genes (ISGs). Viperin, an antiviral molecule, is one of the most induced ISGs in the host's antiplasmodial response. This thesis aims at characterizing the interferon-mediated immune responses triggered by Plasmodium liver stage infection, providing an integrated view of the potential cellular effectors of intrahepatic parasite control. A time course analysis throughout P. berghei infection revealed that type I and type II interferons-regulated expression of ISGs present two waves of induction coincident with different stages of the parasite's life cycle. A first peak occurs at 42 hours post-infection (hpi) and is followed by a higher peak of induction at 84 hpi, which was identified as potentially being mediated by innate lymphoid cells, whose functionality is yet to be explored. Furthermore, we proposed to unravel the role of Viperin induction during Plasmodium liver infection. In vivo bioluminescence measurements revealed that mice lacking Viperin exhibited a higher liver stage burden compared with wild type mice at 42 hpi. The investigation of the cellular mediators of Viperin's expression in the liver was also performed through qRT-PCR and flow cytometry, identifying the hepatocytes and monocytes as the major sources of Viperin at 42 and 84 hpi, respectively. This thesis reveals a cell population exhibiting the type I interferon signature that may act as effectors on controlling either a primary or secondary infection. Moreover, knowledge on the role of Viperin can significantly contribute to the design of new antiplasmodial strategies by increasing the knowledge on the host-parasite interactions

Intervenção da fisioterapia uroginecológica na incontinência urinária: uma revisão sistemática

Projeto de Graduação apresentado à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de Licenciada em FisioterapiaObjetivo: Determinar a efetividade da Fisioterapia Uroginecológica no tratamento de mulheres com Incontinência Urinária (IU). Metodologia: Pesquisa computadorizada nas bases de dados Pubmed/Medline, Ebsco e PEDro para identificar estudos randomizados controlados que avaliam várias técnicas de intervenção de Fisioterapia Uroginecológica na IU. Resultados: Nesta revisão foram incluídos 10 estudos envolvendo 836 indivíduos, com classificação metodológica de 6 na escala de PEDro. Dos 10 estudos incluídos nesta revisão, tendo em conta a intervenção da Fisioterapia Uroginecológica na IU, 6 avaliaram a Fisioterapia no treino dos músculos do pavimento pélvico (TMPP), 3 têm em conta a aplicação do biofeedback (BFB), 5 a aplicação de electroestimulação (EE) e 4 a utilização de cones vaginais. Conclusão: A Fisioterapia Uroginecológica é fundamental tanto para a redução das perdas urinárias quer na melhoria da qualidade de vida das mulheres.Objective: To determine the effectiveness of Urogynecologic Physiotherapy treatment in women with Urinary Incontinence (UI). Methodology: Research on computerized databases on Pubmed/Medline, Ebsco and PEDro to identify randomized controlled trials that evaluates various Urogynecologic Physiotherapy interventions in UI. Results: This review include 10 studies involving 836 patients, with arithmetic mean methodology classification of 6 on the PEDro scale. From 10 the studies included in this review, taking into account the intervention of Urogynecologic Physiotherapy at UI, 6 evaluated the Physiotherapy in pelvic floor muscle training (PFMT), 3 take into account the application of biofeedback (BFB), 5 application for electrical stimulation (EE), and 4 the use of vaginal cones. Conclusion: The Urogynecological Physiotherapy is essential both to reduce urinary losses either in improving the quality of life of their bearers

The role of fitness frequency-dependent in the evolution of antibiotic resistance

Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010Antibiotic resistance is, usually, associated with fitness costs for the bacteria. Therefore, it is expected that if one competes a resistant bacterial strain with an otherwise isogenic susceptible strain in an antibiotic free environment, resistant bacteria will be eliminated. Here, I report the occurrence of stabilizing frequency-dependent selection in 43% of a set of antibiotic resistant strains. Stabilizing frequency-dependent selection may promote the maintenance of a stable polymorphism between resistant and susceptible bacteria. If resistant bacteria are rare, their fitness is higher than that of the susceptible strain. If resistant bacteria are the majority in the competition assay, their fitness is smaller than that of the susceptible strain. This enables a stable coexistence between sensitive and resistant strains. Genetic and ecological causes of frequency-dependent selection were investigated. The demonstration of frequency-dependent selection involving drug resistance strains implies that antibiotic resistant bacteria will not be easily eliminated or reversed upon reduction of antibiotic use. This reveals a worrying scenario for the eradication of antibiotic resistance.Durante muito tempo foi admitido que as populações bacterianas seriam mantidas num estado monomórfico devido a dois fenómenos: competição exclusiva e selecção periódica. O principio da exclusão competitiva refere que duas ou mais espécies que competem pelos mesmos recursos não podem coexistir, uma vez que a espécie mais eficiente irá eliminar gradualmente todas as outras (Hardin, 1960). O processo de selecção periódica, em que a evolução de populações bacterianas num recurso limitante consiste numa série temporal de substituições por genótipos cada vez com maior sucesso reprodutivo ou fitness, é responsável por eliminar toda a variabilidade genética (Atwood, et al., 1951, Levin, 1981). A existência de polimorfismos seria, então, apenas uma etapa transitória no processo evolutivo. Contudo, o processo de competição entre espécies é muito mais complexo. O ambiente dos organismos, biótico e físico, é heterogéneo espacial e temporalmente. Portanto, as frequências dos diferentes genótipos numa população estão continuamente a sofrer alterações. Ao mesmo tempo, existem mecanismos responsáveis pela manutenção de polimorfismos nas populações bacterianas. A selecção dependente da frequência é um desses mecanismos. A selecção dependente da frequência já foi observada em organismos como Drosophila (Ayala, 1971), Escherichia coli (Levin, 1972, Helling, et al., 1987) e em vírus (Elena, et al., 1997, Yuste, et al., 2002). Num sistema biológico, em que a selecção dependente da frequência actua, o sucesso reprodutivo de um organismo está dependente da sua frequência. Este mecanismo pode resultar em dois cenários diferentes. Assim sendo, a selecção pode favorecer o genótipo mais comum, definindo-se como selecção dependente da frequência disruptiva. Por outro lado, se a selecção favorecer o genótipo mais raro, então estamos perante selecção dependente da frequência estabilizante. A selecção dependente da frequência disruptiva leva à eliminação de polimorfismos na população. Um genótipo, mesmo possuindo uma qualquer vantagem, apenas será seleccionado face a outro genótipo se a sua frequência se encontrar acima de um certo valor (Levin, 1988). Caso contrário, o genótipo é eliminado. A selecção dependente da frequência estabilizante, sobre a qual nos iremos focar neste trabalho, resulta num ponto de equilíbrio que permite a coexistência estável entre os genótipos. Se a frequência de um dos genótipos está abaixo do equilíbrio estável, o seu fitness relativamente ao outro genótipo será maior, permitindo-lhe aumentar a sua frequência. Se a sua frequência estiver acima do ponto de equilíbrio, o seu fitness será menor do que o outro genótipo em competição, e consequentemente irá ocorrer uma redução do seu número. No ponto de equilíbrio o fitness de ambos os genótipos é idêntico, levando a um polimorfismo estável. Vários estudos demonstram a coexistência de genótipos diferentes mesmo em ambientes simples. Algumas sugestões foram sendo dadas na tentativa de explicar os mecanismos ecológicos que permitem a coexistência: (i) Trade-off demográfico, em que cada genótipo é especializado num diferente nicho ecológico (Levin, 1972, Helling, et al., 1987, Turner, et al., 1996, Rozen & Lenski, 2000). Por exemplo, um dos genótipos possui um maior fitness quando a glucose no meio é abundante, enquanto o outro genótipo possui um fitness mais elevado quando a glucose é escassa (Turner, et al., 1996); (ii) Cross-feeding, em que o genótipo com maior sucesso excreta um metabolito resultante do seu metabolismo ou morte celular para o meio. O segundo genótipo é eficiente a utilizar este metabolito (Turner, et al., 1996, Rozen & Lenski, 2000); (iii) Interacção antagonista, em que durante a fase estacionária um dos genótipos devido a uma mutação ou a um efeito pleiotrópico de uma mutação é capaz de inibir o genótipo mais frequente, interferindo com o seu crescimento máximo (Lemonnier, et al., 2008). Os mecanismos ecológicos acima descritos não se excluem entre si. Aliás, a ocorrência de um trade-off demográfico está geralmente associado a uma interacção por cross-feeding (Rosenzweig, et al., 1994, Turner, et al., 1996). No presente estudo demonstro a ocorrência de selecção dependente da frequência em bactérias resistentes a antibióticos. A resistência aos antibióticos pode resultar de mutações genéticas e/ou aquisição de determinantes de resistência por transferência horizontal de genes (revisto emMartinez, et al., 2009). As mutações que conferem resistência podem alterar processos fisiológicos da célula (Andersson & Levin, 1999). De forma similar, quando a resistência está localizada em elementos genéticos móveis (plasmídeos, integrões ou transposões), a replicação e expressão dos seus genes é responsabilidade da bactéria hospedeira. Tal irá interferir no crescimento normal da bactéria (Bjorkman & Andersson, 2000). Assim, um fenótipo resistente acarreta na maioria das vezes, custos para a bactéria, fazendo com que sofra uma diminuição do seu fitness (Andersson, 2006). Neste trabalho, utilizei bactérias resistentes a três antibióticos diferentes: ácido nalidíxico, rifampicina e estreptomicina. Para estes antibióticos a resistência é causada por mutações cromossomais em genes envolvidos na replicação (Marcusson, et al., 2009) , transcrição (Reynolds, 2000) e tradução (Kurland, et al., 1996), respectivamente. Estudos anteriores têm demonstrado que, face às alterações fisiológicas inerentes à resistência, bactérias resistentes em competição com bactérias sensíveis e na ausência de antibióticos, possuem uma desvantagem competitiva (Gillespie, 2001, Trindade, et al., 2009). Deste modo, a simples redução no uso de antibióticos deveria erradicar o grave problema das resistências aos antibióticos. Ou seja, as estirpes resistentes seriam eliminadas. Contudo, o cenário apresenta-se muito mais complexo (Johnsen, et al., 2009). Existem vários processos que permitem manter bactérias resistentes na população ao reduzirem ou eliminarem o custo provocado pelas mesmas: mutações compensatórias (Bjorkman & Andersson, 2000), epistasia entre resistências a antibióticos (Trindade, et al., 2009), mutações sem custo (Ramadhan & Hegedus, 2005, Criswell, et al., 2006) e co-selecção de resistências a antibióticos (Enne, et al., 2004, Andersson & Hughes, 2010). A ocorrência de selecção dependente da frequência aqui apresentada poderá ser um outro fenómeno. Os resultados aqui apresentados mostram que 13 dos 30 clones espontâneos (43%) resistentes a antibióticos testados apresentam um fenótipo de dependência na frequência quando em competição com um clone sensível. É de notar que, para as mesmas mutações pontuais nos genes envolvidos na resistência ao antibiótico respectivo, os clones resistentes apresentavam um comportamento diferente durante a competição. Isto sugere que o fenótipo para a dependência na frequência seria causado, não pelas mutações para a resistência, mas por outra qualquer mutação a ocorrer no cromossoma. Contudo, tal hipótese não ficou demonstrada. Relativamente, ao mecanismo ecológico responsável pela dependência na frequência sugeri a ocorrência de um cross-feeding ou uma interacção antagonista. Relativamente, ao cross-feeding os resultados não foram esclarecedores. No entanto, a hipótese de uma interacção antagonista, apesar de ainda não testada, aponta-se esclarecedora: os clones resistentes seriam portadores de uma mutação capaz de inibir os clones sensíveis através de um contacto célula a célula. Os resultados mostram uma incidência elevada de selecção dependente da frequência (43%) nos clones resistentes aos antibióticos. Tal incidência pode ser reflexo do método utilizado para selecção dos clones, o qual poderá estar a favorecer a selecção de clones com estas características. Apesar desta hipótese não estar ainda esclarecida, e portanto, desconhecermos se a selecção dependente da frequência tem uma baixa ou elevada incidência nas populações bacterianas resistentes, este estudo vem reforçar que a simples redução ou mesmo eliminação do uso de antibióticos não é uma medida eficaz no combate às resistências aos antibióticos. A ocorrência de selecção dependente da frequência em bactérias resistentes irá possibilitar a sua manutenção nas populações bacterianas, mesmo em baixas frequências. Assim que se reintroduzir novamente o antibiótico a resistência irá emergir em larga escala (De Gelder, et al., 2004). A selecção dependente da frequência deve ser um mecanismo considerado no estudo das dinâmicas das populações bacterianas e, em particular, nas populações resistentes aos antibióticos. Deste modo, torna-se necessário o desenvolvimento de novas terapêuticas alternativas aos antibióticos no combate às infecções bacterianas. Tal necessidade está na base do recente desenvolvimento de terapêuticas profiláticas, tais como a interferência bacteriana, vacinas bacterianas e a terapia fágica