Improving Protein Crystal Quality by the Without-Oil Microbatch Method: Crystallization and Preliminary X-ray Diffraction Analysis of Glutathione Synthetase from Pseudoalteromonas haloplanktis

Glutathione synthetases catalyze the ATP-dependent synthesis of glutathione from l-γ-glutamyl- l-cysteine and glycine. Although these enzymes have been sequenced and characterized from a variety of biological sources, their exact catalytic mechanism is not fully understood and nothing is known about their adaptation at extremophilic environments. Glutathione synthetase from the Antarctic eubacterium Pseudoalteromonas haloplanktis (PhGshB) has been expressed, purified and successfully crystallized. An overall improvement of the crystal quality has been obtained by adapting the crystal growth conditions found with vapor diffusion experiments to the without-oil microbatch method. The best crystals of PhGshB diffract to 2.34 Å resolution and belong to space group P212121, with unit-cell parameters a = 83.28 Å, b = 119.88 Å, c = 159.82 Å. Refinement of the model, obtained using phases derived from the structure of the same enzyme from Escherichia coli by molecular replacement, is in progress. The structural determination will provide the first structural characterization of a psychrophilic glutathione synthetase reported to date

Diclofenac-Induced Apoptosis in the Neuroblastoma Cell Line SH-SY5Y: Possible Involvement of the Mitochondrial Superoxide Dismutase

Diclofenac, a nonsteroidal anti-inflammatory drug, induces apoptosis on the neuroblastoma cell line SH-SY5Y through a mitochondrial dysfunction, affecting some antioxidant mechanisms. Indeed, the time- and dose-dependent increase of apoptosis is associated to an early enhancement of the reactive oxygen species (ROS). Mitochondrial superoxide dismutase (SOD2) plays a crucial role in the defence against ROS, thus protecting against several apoptotic stimuli. Diclofenac decreased the protein levels and the enzymatic activity of SOD2, without any significant impairment of the corresponding mRNA levels in the SH-SY5Y extracts. When cells were incubated with an archaeal exogenous thioredoxin, an attenuation of the diclofenac-induced apoptosis was observed, together with an increase of SOD2 protein levels. Furthermore, diclofenac impaired the mitochondrial membrane potential, leading to a release of cytochrome c. These data suggest that mitochondria are involved in the diclofenac-induced apoptosis of SH-SY5Y cells and point to a possible role of SOD2 in this process

Protein phosphorylation in yeast mitochondria

We describe the identification and submitochondrial localization of four protein kinases and of their target proteins in derepressed yeast mitochondria. The activity of one of the kinases depends on the presence of cyclic AMP (cAMP). It is soluble and localized in the mitochondrial intermembrane space. Its natural target is a polypeptide of 40 kDa molecular mass, which is bound to the inner membrane. Besides this natural target this kinase phosphorylates acidic heterologous proteins, like casein, with high efficiency. The other protein kinases identified so far are cAMP-independent. At least one is localized in the matrix having its natural substrates (49 and 24 kDa) in the same compartment. Two others are firmly bound to the inner membrane phosphorylating target proteins in the inner membrane (52·5 kDa) and in the intermembrane space (17·5 kDa), respectively

Ligand-based chemoinformatic discovery of a novel small molecule inhibitor targeting CDC25 dual specificity phosphatases and displaying in vitro efficacy against melanoma cells

CDC25 phosphatases are important regulators of the cell cycle and represent promising targets for anticancer drug discovery. We recently identified NSC 119915 as a new quinonoid CDC25 inhibitor with potent anticancer activity. In order to discover more active analogs of NSC 119915, we performed a range of ligand-based chemoinformatic methods against the full ZINC drug-like subset and the NCI lead-like set. Nine compounds (3, 5?9, 21, 24, and 25) were identified with Ki values for CDC25A, -B and -C ranging from 0.01 to 4.4 ?M. One of these analogs, 7, showed a high antiproliferative effect on human melanoma cell lines, A2058 and SAN. Compound 7 arrested melanoma cells in G2/M, causing a reduction of the protein levels of CDC25A and, more consistently, of CDC25C. Furthermore, an intrinsic apoptotic pathway was induced, which was mediated by ROS, because it was reverted in the presence of antioxidant N-acetyl-cysteine (NAC). Finally, 7 decreased the protein levels of phosphorylated Akt and increased those of p53, thus contributing to the regulation of chemosensitivity through the control of downstream Akt pathways in melanoma cells. Taken together, our data emphasize that CDC25 could be considered as a possible oncotarget in melanoma cells and that compound 7 is a small molecule CDC25 inhibitor that merits to be further evaluated as a chemotherapeutic agent for melanoma, likely in combination with other therapeutic compounds

Analysis of SOD3 and Akt in ascending aortic aneurysm

Ascending aortic aneurysm (AsAA) is divided into three different forms: syndromic, familial non-syndromic, and degenerative. Bicuspid aortic valve (BAV), occuring in 2% of the population, is the most frequent cardiac congenital abnormality, associated to AsAA. All the different forms of AsAAs are a consequence of cystic medial necrosis (CMN), characterized by apoptotic loss of smooth muscle cells (SMCs), fragmentation of elastic and collagen fibers and increased accumulation of mucoid material. The extracellular superoxide dismutase (SOD3) is a Cu/Zn enzyme, affecting redox state and homeostasis of extracellular matrix (ECM) (1). Moreover, the outsidein signalling from ECM modulates intracellular pathways regulating many cellular functions. The multifunctional Akt pathway affects survival and cellular proliferation and has important effects on the cardiovascular function. In this study we examined the relevance of SOD3 and Akt in AsAA pathogenesis. To this aim, the SOD3 and Akt protein levels were evaluated in normal ascending aortic tissues (n=6) and in tissues from AsAAs associated both to tricuspid aortic valve (TAV) (n=6) and BAV (n=6); moreover, we measured SOD3 activity in sera from healthy donors and patients with AsAA. Our data showed a reduction of SOD3 and phospho-Akt (pAkt) protein levels in AsAAs from BAV patients compared to normal donors; on the other hand, no differences emerged in SOD3 activity. Furthermore, immunohistochemical analysis performed on normal and pathological ascending aortic tissues showed a SOD3 immunostaining in both extracellular space and tunica media cells from normal ascending aortic tissues; conversely, no SOD3 immunostaining was detected in AsAAs tissues from both TAV and BAV patients. Our data show that SOD3 and pAkt could be associated to AsAA pathogenesis and suggest a link between ECM homeostasis and Akt survival pathway

A Computational Study of Elongation Factor G (EFG) Duplicated Genes: Diverged Nature Underlying the Innovation on the Same Structural Template

BACKGROUND: Elongation factor G (EFG) is a core translational protein that catalyzes the elongation and recycling phases of translation. A more complex picture of EFG's evolution and function than previously accepted is emerging from analyzes of heterogeneous EFG family members. Whereas the gene duplication is postulated to be a prominent factor creating functional novelty, the striking divergence between EFG paralogs can be interpreted in terms of innovation in gene function. METHODOLOGY/PRINCIPAL FINDINGS: We present a computational study of the EFG protein family to cover the role of gene duplication in the evolution of protein function. Using phylogenetic methods, genome context conservation and insertion/deletion (indel) analysis we demonstrate that the EFG gene copies form four subfamilies: EFG I, spdEFG1, spdEFG2, and EFG II. These ancient gene families differ by their indispensability, degree of divergence and number of indels. We show the distribution of EFG subfamilies and describe evidences for lateral gene transfer and recent duplications. Extended studies of the EFG II subfamily concern its diverged nature. Remarkably, EFG II appears to be a widely distributed and a much-diversified subfamily whose subdivisions correlate with phylum or class borders. The EFG II subfamily specific characteristics are low conservation of the GTPase domain, domains II and III; absence of the trGTPase specific G2 consensus motif "RGITI"; and twelve conserved positions common to the whole subfamily. The EFG II specific functional changes could be related to changes in the properties of nucleotide binding and hydrolysis and strengthened ionic interactions between EFG II and the ribosome, particularly between parts of the decoding site and loop I of domain IV. CONCLUSIONS/SIGNIFICANCE: Our work, for the first time, comprehensively identifies and describes EFG subfamilies and improves our understanding of the function and evolution of EFG duplicated genes

Meccanismi di regolazione dell'attività della superossido dismutasi in micro-organismi estremofili ed in mitocondri

Scopo del presente programma di ricerca è lo studio delle proprietà delle superossido dismutasi isolate dall'eubatterio psicrofilo Pseudoalteromonas haloplanktis (PhSOD) e da mitocondri animali (mitSOD). Insieme alla SOD dell'archeobatterio ipertermofilo Sulfolobus solfataricus (SsSOD), già disponibile ed ampiamente caratterizzata anche in alcune sue forme mutate (1-4), questi enzimi sono membri della stessa famiglia di SOD, che svolge un ruolo primario nel controllo del livello dei ROS in tutte le forme viventi. I tre enzimi possono quindi essere impiegati come modelli per studiare l'evoluzione della funzione antiossidante della SOD. Alcune precedenti ricerche sulla SsSOD e sulla mitSOD umana fanno supporre che l'attività di tale enzima ubiquitario possa essere soggetta a regolazione. Pertanto nella ricerca sarà data particolare enfasi all'individuazione di eventuali meccanismi di regolazione dell'espressione e dell'attività di tale enzima, anche mediante l'uso di colture cellulari. Infine, le tre SOD considerate funzionano in condizioni di temperatura molto diverse che vanno dai 4 - 20°C di P. haloplanktis fino agli 87°C di S. solfataricus. Pertanto questi modelli di enzimi estremofili sono anche utili per avere indicazioni sui meccanismi attraverso cui l'enzima si è evoluto per funzionare in organismi mesofili. La ricerca tratterà quindi le seguenti tematiche: 1. CARATTERIZZAZIONE DI UNA SUPEROSSIDO DISMUTASI PSICROFILA 2. REQUISITI STRUTTURALI PER L'ADATTAMENTO DELLE SOD A TEMPERATURE ESTREME 3. ESPRESSIONE ETEROLOGA DEL GENE PER LA SOD MITOCONDRIALE DI RATTO E DI SUE FORME MUTATE 4. MECCANISMI DI REGOLAZIONE DELLA SOD MITOCONDRIAL

Meccanismi molecolari e controllo dello stato redox in seguito all'infezione da Helicobacter pylori

Il microrganismo Helicobacter pylori, responsabile di varie patologie quali gastriti e ulcere, colonizza la mucosa gastrica grazie all’adattamento alla crescita nell’ambiente acido dello stomaco. L’infezione può rimanere a lungo asintomatica e, se non riconosciuta ed eradicata con opportune terapie antibiotiche, può essere responsabile dello sviluppo di adenocarcinomi e linfomi gastrici. Nei tessuti colonizzati dal batterio si osserva una forte risposta infiammatoria con incremento della produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS), nonché riduzione dei livelli di ossido nitrico, un importante protettore della mucosa gastrica. Pur essendo un microaerofilo, H. pylori è ben adattato alla difesa contro i ROS, essendo dotato di efficienti sistemi enzimatici di difesa, come la superossido dismutasi (HpSOD). D’altra parte, al processo infiammatorio partecipa il peptide Hp(2-20), un fattore chemiotattico secreto da H. pylori, che manifesta le sue proprietà antibatteriche grazie all’induzione della produzione di ROS da parte della NADPH ossidasi dei neutrofili. Con questo progetto si studieranno alcuni aspetti molecolari e funzionali relativi all’infezione da H. pylori, approfondendo il significato di alcune specifiche proprietà strutturali e funzionali di HpSOD e caratterizzando alcuni meccanismi molecolari coinvolti nel controllo del potenziale redox in linee cellulari di adenocarcinoma gastrico, anche dopo stimolazione con Hp(2-20). E’ noto che HpSOD, l’enzima chiave per la detossificazione dall’anione superossido, possiede, diversamente da altre Fe- e Mn-SOD, un’estensione amminoacidica nella regione C-terminale, il cui ruolo è però ancora sconosciuto; inoltre, in alcune condizioni di crescita l’enzima si ancora al rivestimento flagellare del batterio; infine, l’attività di HpSOD probabilmente contribuisce alla riduzione dei livelli di NO nello stomaco. Un obiettivo della ricerca riguarderà lo studio del ruolo dell’estensione C-terminale dell’enzima nel meccanismo di patogenicità. In particolare, grazie alla disponibilità di una forma ricombinante di HpSOD, si identificheranno eventuali modifiche covalenti a carico di residui dell’estensione C-terminale della HpSOD, ma anche di altri regioni dell’enzima, che giocano un ruolo nella relazione struttura-funzione di HpSOD. Tra le modifiche covalenti da ricercare saranno particolarmente studiate la nitrazione, la S-glutationilazione e la fosforilazione, anche perché già riportate per altre SOD. Un altro aspetto riguarda la possibile reattività nei riguardi di agenti modificanti di un residuo di cisteina (C189) localizzato nella regione C-terminale della HpSOD. Infatti la presenza di HpSOD sulla superficie cellulare del batterio renderebbe possibile l’interazione dell’enzima con componenti cellulari secreti dalla mucosa infiammata, che potrebbero portare alla farnesilazione o acilazione della HpSOD. Questo tipo di modifica, che coinvolge residui di cisteina della regione C-terminale, consente l’ancoraggio di altre proteine alla membrana plasmatica. Per tutte le modifiche identificate, si procederà alla valutazione degli effetti biochimici (attività specifica, sensibilità ad inibitori ed inattivatori, termostabilità), nonché a stabilire il loro eventuale ruolo nell’ancoraggio dell’enzima al rivestimento flagellare del batterio. Infine, sarà avviato un progetto di mutagenesi che miri a definire il ruolo dei residui della regione C-terminale di HpSOD, producendo anche una forma troncata dell’enzima priva di tale estensione. E’ già noto che l’effetto stimolatorio di Hp(2-20) sulla NADPH ossidasi di neutrofili è mediato dal legame del peptide ai recettori per formil-peptidi (FRP). Si cercherà di caratterizzare i meccanismi molecolari responsabili della generazione di superossido da parte della NADPH ossidasi in due linee cellulari di adenocarcinoma gastrico, MKN-28 e AGS, nonché in biopsie di pazienti con infezione cronica da H. pylori. Saranno ricercati i partners molecolari della cascata di segnalazione responsabile dell’incremento del processo di proliferazione cellulare, identificando innanzitutto i membri della famiglia dei recettori per formil-peptidi e la componente catalitica (Nox) della NADPH ossidasi espressa in queste cellule. Tale identificazione fornirà importanti informazioni sulla cascata intracellulare coinvolta nella regolazione delle varie isoforme di Nox, in seguito all’interazione Hp(2-20)/FPR. Successivamente saranno studiati i meccanismi di attivazione di Nox, analizzando le chinasi responsabili della fosforilazione e della traslocazione della subunità regolatoria di questo enzima, nonché i pathways responsabili della proliferazione cellulare in queste linee tumorali. Infine si valuterà anche la capacità di Hp(2-20) di attivare i fattori trascrizionali STAT3 e HIF-1alfa, responsabili dell’ aumento della trascrizione, e quindi della sintesi del fattore di crescita vascolare endoteliale (VEGF), promuovendo così l’angiogenesi