Structural Determiants Of Adenophostin a Activity. Proposal and Synthetic Approach to new Adenophostin a Analogues

1D-myo-Inositol 1,4,5-trisfosfat (IP3) és un segon missatger que té un paper molt important en l'activitat dels magatzems de calci intracel·lulars així com en l'entrada de calci al citoplasma.Estímuls extracel·lulars tals com hormones, neurotransmissors or factors de creixement (primers missatgers) són capaços d'unir-se a receptors específics localitzats a la part exterior de la membrana cel·lular. Com a resultat d'aquesta unió té lloc l'activació de la fosfolipasa C localitzada a la membrana cel·lular. Aquesta, al seu torn, catalitza la hidrólisi de fosfolípids, alliberant-se diacilglicerol (DAG) i IP3 (segon missatger).L'any 1993, Takahashi i col·laboradors aïllaren d'un cultiu de Penicillium brevicompactum, dos potents gliconucleòtids trisfosfat: Adenofostina A i B. Aquests compostos són els agonistes més potents descrits fins ara, presentant activitats de 10 a 100 vegades superiors a les del propi IP3.Des d'un punt de vista químic, les adenofostines comparteixen amb l'IP3 l'agrupació bisfosfat trans-diequatorial flanquejada per un grup hidroxil a la posició C-2'' (veure figura). A més a més, les adenofostines són resistents als enzims que metabolitzen l'IP3 com per exemple IP3-fosfatasa i IP3-quinasa. S'han sintetizat molts anàlegs de les adenofostines amb la finalitat per una banda d'elucidar les característiques estructurals responsables de la seva activitat i per l'altra d'obtenir compostos més actius. Tantmateix, fins a dia d'avui, solament pocs anàlegs han superat l'activitat de l'IP3 i cap d'ells ha conseguit superar l'activitat de les adenofostines.Estudis d'estructura-activitat han permés dissenyar un model farmacófor per a l'adenofostina A. Les principals característiques del qual són:La unitat bisfosfat trans-diequatorial flanquejada pel grup 2''-OH, el qual és un punt clau en la'activitat de l'adenofostina i mimetitzaria la unitat 4,5-bisfosfat-6-OH de l' IP3.La presència de l'adenina (o qualsevol estructura equivalent) incrementa l'activitat respecte a la de l' IP3. En aquesta direcció, s'han proposat dos possibles papers per a l'adenina. Per una banda, l'adenina podria permetre un millor posicionament de 2'-fosfat mitjançant una conformació C2'-endo (paper indirecte). Per l'altra, l'adenina podria estar implicada directament en interaccions complementàries amb una regió localitzada prop del centre d'unió (paper directe) permetent d'aquesta manera evitar l'efecte del domini inibidor C-terminal. Concretament, s'ha proposat l'existència d'una interacció catió-entre l'adenina i un residu d'argininia (Arg 504).Un estudi recent dut a terme en col·laboració amb el Dr. Morère, ha mostrat que els receptors de la manosa-6-fosfat són capaços de reconéixer anàlegs de manosa que incorporen grups carboxilats isòsters. En concret, s'ha mostrat que els anàlegs carboxilats tenen la mateixa afinitat per receptor que la manosa-6-fosfat. A més a més, amb aquesta substitució (fosfat-carboxilat) és pot evitar la labilitat dels grups fosfat.Com s'ha mencionat anteriorment, les adenofostines són resistents als enzimes que metabolitzen l' IP3. En aquest sentit, és ben conegut que la presència d'un àtom de flúor a la posició 2' en un glicòsid incrementa l'estabilitat de l'enllaç glicosídic especialment davant la hidròlisi àcida.Amb aquests antecedents, es va proposar estudiar la capacitat del IP3R per reconéixer efetivament anàlegs d'adenofostina en els quals un o més grups fosfats han estat reemplaçats per unitats metilencarboxilat. D'altra banda, també es va proposar incrementar l'estabilitat de l'adenofostina mitjançant la introducció d'un àtom de fluor a la posició C-2''.D'aquesta manera, el present treball s'ha centrat en dos punts principals:El primer és confirmar les interaccions de l'adenina amb el receptor i el paper del fosfat 2' en l'activitat de l'adenofostina. En aquest sentit, s'ha dut a terme l'evaluació biològica de: IP3, adenofostina A, inositol 4,5-bisfosfate (IP2), and 2'-defosfo-adenophostina A. Els primers assaigs es van dur a terme utilitzant el receptor en la seva forma completa, el fragment corresponent al domini d'unió i aquest mateix fragment incorporant una mutació a la posició 568 (Arg a Gln). Aquest residu interacciona amb el fosfat 1 de l'IP3 i es creu que interaccionaria també amb el fosfat 2' de l'adenofostina. Els següents assajos es van realitzar utilitzant el mateix fragment anteriorment citat, però aquest cop incorporant una mutació a la posició 504 (Arg a Gln). Es creu que aquest residu podria formar una interacció tipus catió- "stacking" amb l'adenina. Del resultat d'aquestes evaluacions biològiques, es pot deduir que l'activitat de l'adenofostina es deguda principalment a la presència de l'adenina i, a més a més, la suposada òptima disposició del fosfat 2' no es determinant per a l'elevada afinitat de l'adenofostina. També s'ha confirmat la presència de la intercció catió- al centre d'unió del receptor.El segon punt de l'estudi presentat ha estat el disseny i la síntesi de nous anàlegs d'adenofostina basats en els resultats dels estudis biològics anteriorment mencionats.Així doncs, s'ha sintetitzat el precursor d'un anàleg d'adenofostina que incorpora un àtom de flúor a la posició C-2'' amb la finalitat de conferir-li major estabilitat a l'enllaç glicosídic i evaluar el paper del grup 2''-OH en la formació de ponts d'hidrogen. La introducció del flúor a l'estructura de l'adenofostina es va dur a terme mitjançant la fluoració electròfila del 3,4,6-tri-O-acetyl-D-glucal amb Selectfluor®. El qual, posteriorment, es va convertir en el corresponent bromur de glicosil.Per altra banda, l'adenosina va ser convenientment protegida i utilitzada com a acceptor de glicosil amb el fragment fluorat. Els següents passos posteriors a la glicosilació foren la manipulació de grups protectors amb la finalitat d'obtenir el substrat apropiat par a la introducció dels grups fosfat a les posicions desitjades (2', 3', 4'').Així també, considerant el paper secundari del fosfat 2' en l'activitat de l'adenofostina, ens vam centrar en la síntesi de dos nous anàlegs en els quals els grups fosfat de les posicions 3'' i 4'' van ser substituits per un grup metilencarboxilat. Així, a banda d'incorporar funcionalitats no metabolitzables, la substitució alternada permetria saber el paper de cadascún dels fosfats en la unió amb el receptor. L'estructura bàsica per als dos anàlegs es va obtenir de la glicosilació de l'adenosina convenientment protegida amb un tioglicosid que incorporava la unitat metilencarboxilat en la seva estructura. El methyl (4,6-O-benzilidene)-1-O--glucòsid va ser el matrial de partida per a la síntesi dels dos fragments de carbohidrat, els quals es van obtenir variant la seqüència de grups protectors utilitzada.La introducció del precursor de la unitat metilencarboxilat a les unitats de carbohidrat es va fer mitjançant al·lilació radicalària, obtenint-se els al·lil derivats amb la estereoquímica desitjada. La posterior ruptura oxidativa del grup al·lil donà lloc a l'àcid. Les etapes finals de la síntesi dels fragments de carbohidrat implicaven la hidròlisi de la posició anomèrica i la formació del tioglicòsid. Finalment, els tioglicòsids així obtinguts es van fer reacionar amb el derivat d'adenosina obtenint-se l'estructura bàsica per tots dos anàlegs. Després de vàries etapes de desprotecció, es van obtenir els substrats apropiats per a la fosforilació.En resum, el present treball ha permès:1. Establir les característiques estructurals que confereixen a les adenofostines la seva elevada activitat, fins i tot superior a la del propi IP3.2. Sintetitzar els precursors de tres nous anàlegs d'adenofostina els quals presenten modificacions estructurals que haurien de permetre: a) saber el paper independent de cadascún dels fosfats en el producte natural; i b) saber el paper del grup 2''-OH en les interaccions amb el receptor.During the past decades, much progress has been made in the knowlledge of calcium signalling and how cells employ calcium in order to regulate their processes. 1D-myo-Inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3) is a second messenger that plays an important role in intracellular calcium stores activity as well as in extracellular calcium entry. Extracellular stimuli such as hormones, neurotransmitters or growing factors (first messengers) are capable to bind to specific receptors located a the outer face of cell membrane. This bind results in an activation of Phospholipase C located on the cell membrane, which in turn catalyses the hydrolysis of phospholipids, releasing diacyl-glycerol (DAG) and IP3 (second messenger). In 1993, Takahashi et al. isolated from a Penicillium brevicompactum, culture, two potent glyconucleotides trisphosphate: Adenophostin A and B. These compounds are the most potent IP3 agonists ever reported until now, being from 10 to 100 fold times more active than IP3 itself.From a chemical point of view, Adenophostins share with IP3 a trans-diequatorial bis-phosphate moiety flanked by an hydroxyl group at C-2".(see Figure) Moreover, Adenophostins are resistent to enzymes that metabolize IP3 such as IP3-phosphatase and IP3-kinase. Many Adenophostin analogues have been synthesized in order to elucidate strucural features responsible of Adenophostin activity, and to obtain more active compounds. However, until now, only few analogues has overcome IP3 activity and none of them has reach Adenophostine activity. Structure-activity-relationship studies has allowed to design a pharmacophore model for Adenophostin A. Main features of this model are: The trans-diequatorial bis-phosphate moiety flanked by 2''-OH, which is a key point for Adenophostin biological activity, and mimics 4,5-bisphosphate-6-hydroxyl groups in IP3.The presence of adenine (or any equivalent structure) increases its activity respect to IP3. In that direction to possible adenine roles have been proposed. Adenine would allow to position 2'-phosphate in an optimal disposition through a C2'-endo conformation (indirect role). On the other hand, adenine could be directly involved in complementary interactions with a region located near the binding site (direct role) allowing to avoid the effect of C-terminal inhibitory domain. In particular, it is proposed the existence of a cation- interaction between adenine ring and an arginine residue (Arg504).A recent study carried out in collaboration with Dr. Morère, has allow to show that that mannose-6-phosphate receptors are capable of recognize mannose analogues incorporating carboxylate isoster groups. In particular, it has been showed that carboxyl analogues have same affinity for the receptor as mannose-6-phosphate. Moreover, with this substitution (phosphate-carboxylate) lability of phosphate groups can be avoided.As has been mencioned before, Adenophostins are resistent to IP3 metabolizing enzymes. In that direction, it is well known that the presence of a fluorine atom at 2' position of glycosides increases glycosidic bond stability specially towards acidic hydrolysis.With this background in mind, it was proposed to study whether IP3R are capable of recongnising effectively Adenophostin analogues in which one or more phosphate groups have been replaced by methylene carboxylate moieties. On the other hand, it was also proposed to increase Adenophostin stability by means of fluorine introduction at position C-2''.Present work has been focused in two points:The first one was focused in confirming the interactions of adenine with the receptor and the role of 2'-phosphate in Adenophostin activity. In this sense, biological avaluation of IP3, Adenophostin A, inositol 4,5-bisphosphate (IP2), and 2'-dephospho-Adenophostin A has been carried out. First assays were made with using full lenght receptor, binding domain fragment and binding domain fragment incorporating a mutation at position 568 (from Arg to Gln). This residue interacts with phosphate 1 of IP3 and it is supposed to interact with Adenophostin 2'-phosphate as well. Second assays were made using binding domain receptor fragment incorporating a mutation at position 504 (from Arg to Gln). This residue it is supposed to form a cation- stacking with adenine moiety. With this biological avaluations, it can be deduced that Adenophostin A activity is mainly due to the adenine presence, and moreover, the supposed optimal 2'-phosphate disposition is not determinant in Adenophostin high affinity. Furthermore, it has been confirmed the presence of cation- stacking interaction at the binding core.The second point of the present work has been the design and synthesis of new Adenophostin analogues based in biological study results and antecendents mentioned above.Thus, it has been synthesized the precursor of an Adenophostin analogue incorporatin a fluorine atom at C-2'' in order to confer more stability to the glycosydic bond and avaluate the role of 2''-OH in hydrogen bonding. The introduction of fluorine into Adenophostin structure was carried out by means of electrophilic fluorination with Selectfluor® of 3,4,6-tri-O-acetyl-D-glucal, which lately was transformed into the corresponding glycosyl bromide. On the other hand, adenosine was conveniently protected and used as glycosyl acceptor in the glycosylation with fluorinated building block. Next steps after glycosylation were protecting group manipulation in order to afford a suitable substrate for phosphate group introduction at desired positions (2', 3', 4''). Furthermore, considering the secundary role of 2'-phosphate in Adenophostin activity, we focused in the synthesis of two Adenophostin analogues in which phosphate groups at position 3'' and 4'' were replaced by a methylenecarboxylate moiety. Thus, a part from incorporate non metabolizable groups, alternate substitution would allow to know the independent role of each phosphate in receptor binding. Basic structure for two analogues was afforded from the glycosylation of conveniently protected adenosine with a thioglycoside derivative incorporating the methylenecarboxylate moiety in its structure. Methyl (4,6-O-benzylidene)-1-O--glucoside was used as starting material for both carbohydrate fragments, which were afforded depending on the protecting groups sequence used. Introduction of methylencarboxylate precursor into the scaffolds was made via radical allylation, affording allylderivatives with desired stereochemistry. The acid was obtained upon oxidative cleavage of allyl group. Lasts steps of the carbohydrate fragment synthesis involved the hydrolysis of anomeric position and thioglycoside synthesis. Finally, thioglycoside obtained was reacted with adenosine derivative affording the basic structure for both analogues. After several deprotection steps, apropiate substrates for phosphorilation at desired positions were afforded. In summary, the present work has allowed to:1. Stablish the structural features that confere to Adenophostins a activity higher than IP3.2. Synthesize three precursors of Adenophostin analogues presenting new structural modifications that would allow to a) know the independet role of each phosphate in the natural product and b) the role of 2''-OH in receptor interaction

Molecular schizophrenics as sensors and actuators

‘Sensornets’ are large-scale distributed sensing networks comprised of many small sensing devices equipped with memory, processors, and short-range wireless communications capabilities.1 These devices, assembled from building blocks known as ‘Motes’ can gather and share sensor data from multiple locations through in-built wireless communications capabilities. The vision of incorporating chemical and biological sensing dimensions into these platforms is very appealing, and the potential applications in areas critical to society are truly revolutionary.2 For example, the environment; sensors monitoring air and water quality will be able to provide early warning of pollution events arising at industrial plants, landfill sites, reservoirs, and water distribution systems at remote locations. The crucial missing part in this scenario is the gateway through which these worlds will communicate; how can the digital world sense and respond to changes in the real world? Unfortunately, it would appear from the lack of field deployable devices in commercial production that attempts to integrate molecular sensor science into portable devices have failed to bear the fruits promised; this problem is what we call ‘the chemo-/ bio-sensing paradox’.3 In this work, we shall discuss how sensors and sensing systems are likely to develop in the coming years, with a particular focus on the critical importance of new concepts in fundamental materials science to the realisation of these futuristic chemo-/bio-sensing systems. This work focuses on the fundamental challenges, such as the ability to control the characteristics and behaviour of polymers and fluids, and processes occurring at solid-liquid interfaces. We will highlight the key role that stimuli-responsive materials can play in producing new “adaptive” materials capable of exhibiting dramatic changes in properties by external stimuli, such as, photon irradiation.4 In particular, the photochromic processes of spirobenzopyran, figure 1. These materials have the potential to revolutionise the way we design chemical and biological sensing systems

Electrical analysis of new all-plastic electrochromic devices

New all-plastic electrochromic devices have been manufactured using commercial PEDOT foils and classical polymer electrolyte electrodeposition techniques. Several devices with different areas have been electrically characterized by using an impedance spectroscopy technique. After a brief description of the manufacturing process, we discuss electrical properties with the size of the device. Real and imaginary parts of the impedance have been plotted as a function of frequency. Some interesting conclusions have been derived from those plots, and some improvements in manufacturing process of this kind of devices are also proposed.Publicad

Application of F-WASPAS in the Ranking of Crops for Agro-Processing: The Case of Ikondo Ward in Njombe, Tanzania

The purpose of this work was to develop and apply a Fuzzy Weighted Aggregated Sum Product Assessment (F-WASPAS) method in ranking selected crops for agro-processing at Ikondo Ward in Njombe Region, Tanzania. The fuzzy technique for order preferences by similarity to ideal solution (TOPSIS) was applied in determining the fuzzy importance weights of criteria, while the fuzzy WASPAS successfully ranked the crops, and maize was ranked the highest. Keywords:    F-WASPAS, Linguistic variables, Fuzzy aggregation, Agro-processing, Decision making, Multi-Criteria Decision Making

PPAR<i>γ</i> agonist-loaded PLGA -PEG nanocarriers as a potential treatment for Alzheimer’s disease: in vitro and in vivo studies

Objective: The first aim of this study was to develop a nanocarrier that could transport the peroxisome proliferator-activated receptor agonist, pioglitazone (PGZ) across brain endothelium and examine the mechanism of nanoparticle transcytosis. The second aim was to determine whether these nanocarriers could successfully treat a mouse model of Alzheimer’s disease (AD). Methods: PGZ-loaded nanoparticles (PGZ-NPs) were synthesized by the solvent displacement technique, following a factorial design using poly (lactic-co-glycolic acid) polyethylene glycol (PLGA-PEG). The transport of the carriers was assessed in vitro, using a human brain endothelial cell line, cytotoxicity assays, fluorescence-tagged nanocarriers, fluorescence-activated cell sorting, confocal and transmission electron microscopy. The effectiveness of the treatment was assessed in APP/PS1 mice in a behavioral assay and by measuring the cortical deposition of β-amyloid. Results: Incorporation of PGZ into the carriers promoted a 50x greater uptake into brain endothelium compared with the free drug and the carriers showed a delayed release profile of PGZ in vitro. In the doses used, the nanocarriers were not toxic for the endothelial cells, nor did they alter the permeability of the blood–brain barrier model. Electron microscopy indicated that the nanocarriers were transported from the apical to the basal surface of the endothelium by vesicular transcytosis. An efficacy test carried out in APP/PS1 transgenic mice showed a reduction of memory deficit in mice chronically treated with PGZ-NPs. Deposition of β-amyloid in the cerebral cortex, measured by immunohistochemistry and image analysis, was correspondingly reduced. Conclusion: PLGA-PEG nanocarriers cross brain endothelium by transcytosis and can be loaded with a pharmaceutical agent to effectively treat a mouse model of AD

House prices and misallocation: the impact of the collateral channel on productivity

En este documento se investiga empíricamente el impacto de la heterogeneidad en el incremento de los precios de la vivienda a nivel municipal en la ineficiente asignación del capital dentro de las industrias manufactureras. Utilizando el extraordinario boom inmobiliario que tuvo lugar en España entre 2003 y 2007, mostramos cómo las empresas manufactureras expuestas a mayores shocks locales en los precios inmobiliarios y con una mayor proporción de activos inmobiliarios potencialmente colateralizables recibieron más crédito por parte del sector bancario, y que su tasa de inversión creció más intensamente. Usando la variación geográfica a nivel municipal tanto en los precios de la vivienda como en la oferta de suelo urbano previa al boom inmobiliario, documentamos que el canal creado por el aumento del valor del colateral fue más potente para las empresas localizadas en áreas geográficas con restricciones de suelo disponible donde los incrementos del precio de la vivienda fueron mayores. La interacción de las condiciones geográficas que conducen a booms inmobiliarios heterogéneos con el impacto de la revalorización del valor del colateral en la inversión da como resultado un incremento de la dispersión de la ratio capital-trabajo dentro de las industrias manufactureras. Un simple cálculo del escenario contrafactual sugiere que la mala asignación de los recursos causada por la revaloración del colateral de las empresas podría explicar entre un cuarto y la mitad de la caída de la productividad total de los factores experimentada por el sector manufacturero español durante el boom inmobiliario.This paper empirically investigates the impact of local house price booms on capital misallocation within manufacturing industries. Using the geographic variation provided by the salient Spanish housing boom (2003-2007), we show that manufacturing firms exposed to positive local house price shocks received more credit from banks and their investment grew more intensively when they had a larger proportion of collateralizable real estate assets. We exploit the geographical variation in both house prices and pre-boom urban land supply at municipality level to document that this collateral channel was exacerbated for firms located in urban land-constrained geographical areas where real estate appreciation was larger. The interaction of geographical conditions, that led to heterogeneous housing booms, with the collateral channel on investment resulted in an increasing dispersion of the capital-labor ratio within industries. A simple counterfactual calculation suggests that the misallocation generated by the collateral channel on investment could account for between one-quarter and half of the fall in TFP experienced in the Spanish manufacturing sector over the housing boom

Evaluating the macro-representativeness of a firm-level database : an application for the Spanish economy

La disponibilidad de una base de datos en el ámbito de empresa que sea representativa del sector productivo de una economía a escala agregada es una condición necesaria para realizar tanto análisis de política económica como investigación económica fiables en múltiples áreas. En este trabajo, se documenta la construcción de una nueva base de datos de empresas españolas utilizando información detallada a escala microeconómica proporcionada por las empresas al Registro Mercantil y al Banco de España. La comparación con los agregados que emergen de la Contabilidad Nacional sirve para ilustrar cómo la nueva base de datos de naturaleza microeconómica es capaz de replicar las tasas de crecimiento del producto, el empleo y la remuneración de asalariados del sector privado. Utilizando las estadísticas oficiales del Instituto Nacional de Estadística (INE), el análisis presentado muestra cómo la base de datos resultante cubre más del 80 % de las empresas registradas en el censo del DIRCE en el período 2000-2013 y, de manera más relevante, la base de datos es capaz de replicar la distribución de empresas por tamaño de la economía de mercado, excluyendo el sector financiero, de España. El mismo análisis de representatividad se realiza para el sector industrial, mostrando que este sector está particularmente bien representado en la nueva base de datosThe availability of a firm-level database that represents the productive sector of an economy at the aggregate level is a necessary condition to undertake both reliable policy analysis and economic research in multiple areas. In this paper, we document the construction of a new representative firm-level dataset for Spain using detailed micro-level information provided by fi rms to the Spanish Commercial Registry and the Bank of Spain. A comparison with National Accounts fi gures serves to illustrate that the new micro-dataset is able to replicate the growth rates of output, employment and wage bill of the private sector. Using official statistics from the National Institute of Statistics (INE), we show that the resulting dataset covers more than 80% of firms registered in the census over the years 2000-2013 and, more importantly, the resulting dataset replicates the firm size distribution of the Spanish non-financial market economy. The same representativeness analysis is done for the manufacturing sector indicating that this sector is particularly well-represented in the datase