Selectivity for maltose and maltodextrins of maltoporin, a pore-forming protein of E. coli outer membrane

AbstractHomogeneous maltoporin (lamB protein), an Escherichia coli outer membrane spanning protein, was incorporated in phospholipid planar bilayers. It generates aqueous channels distinct from those formed by the non-specific porin (OmpF) or by phosphoporin (phoE protein). The single conductance, 150 pS in 1 M NACl, is much smaller than that of the porins. The channels, which are poorly selective for cations and voltage independent, are specifically inhibited by maltose and maltodextrins. This inhibition, observed in the absence of maltose binding protein, demonstrates that the selectivity of maltoporin for maltose and maltodextrins is an intrinsic property of the protein

Ankyrin G Membrane Partners Drive the Establishment and Maintenance of the Axon Initial Segment

International audienceThe axon initial segment (AIS) is a highly specialized neuronal compartment that plays a key role in neuronal development and excitability. It concentrates multiple membrane proteins such as ion channels and cell adhesion molecules (CAMs) that are recruited to the AIS by the scaffold protein ankyrin G (ankG). The crucial function of ankG in the anchoring of AIS membrane components is well established, but a reciprocal role of membrane partners in ankG targeting and stabilization remained elusive. In rat cultured hippocampal neurons and cortical organotypic slices, we found that shRNA-mediated knockdown of ankG membrane partners (voltage-gated sodium channels (Nav) or neurofascin-186) led to a decrease of ankG concentration and perturbed the AIS formation and maintenance. These effects were rescued by expressing a recombinant AIS-targeted Nav or by a minimal construct containing the ankyrin-binding domain of Nav1.2 and a membrane anchor (mABD). Moreover, overexpressing mABD in mature neurons led to ankG mislocalization. Altogether, these results demonstrate that a tight and precocious association of ankG with its membrane partners is a key step for the establishment and maintenance of the AIS

Protein kinase CK2 contributes to the organization of sodium channels in axonal membranes by regulating their interactions with ankyrin G

In neurons, generation and propagation of action potentials requires the precise accumulation of sodium channels at the axonal initial segment (AIS) and in the nodes of Ranvier through ankyrin G scaffolding. We found that the ankyrin-binding motif of Nav1.2 that determines channel concentration at the AIS depends on a glutamate residue (E1111), but also on several serine residues (S1112, S1124, and S1126). We showed that phosphorylation of these residues by protein kinase CK2 (CK2) regulates Nav channel interaction with ankyrins. Furthermore, we observed that CK2 is highly enriched at the AIS and the nodes of Ranvier in vivo. An ion channel chimera containing the Nav1.2 ankyrin-binding motif perturbed endogenous sodium channel accumulation at the AIS, whereas phosphorylation-deficient chimeras did not. Finally, inhibition of CK2 activity reduced sodium channel accumulation at the AIS of neurons. In conclusion, CK2 contributes to sodium channel organization by regulating their interaction with ankyrin G

The Somatostatin 2A Receptor Is Enriched in Migrating Neurons during Rat and Human Brain Development and Stimulates Migration and Axonal Outgrowth

The neuropeptide somatostatin has been suggested to play an important role during neuronal development in addition to its established modulatory impact on neuroendocrine, motor and cognitive functions in adults. Although six somatostatin G protein-coupled receptors have been discovered, little is known about their distribution and function in the developing mammalian brain. In this study, we have first characterized the developmental expression of the somatostatin receptor sst2A, the subtype found most prominently in the adult rat and human nervous system. In the rat, the sst2A receptor expression appears as early as E12 and is restricted to post-mitotic neuronal populations leaving the ventricular zone. From E12 on, migrating neuronal populations immunopositive for the receptor were observed in numerous developing regions including the cerebral cortex, hippocampus and ganglionic eminences. Intense but transient immunoreactive signals were detected in the deep part of the external granular layer of the cerebellum, the rostral migratory stream and in tyrosine hydroxylase- and serotonin- positive neurons and axons. Activation of the sst2A receptor in vitro in rat cerebellar microexplants and primary hippocampal neurons revealed stimulatory effects on neuronal migration and axonal growth, respectively. In the human cortex, receptor immunoreactivity was located in the preplate at early development stages (8 gestational weeks) and was enriched to the outer part of the germinal zone at later stages. In the cerebellum, the deep part of the external granular layer was strongly immunoreactive at 19 gestational weeks, similar to the finding in rodents. In addition, migrating granule cells in the internal granular layer were also receptor-positive. Together, theses results strongly suggest that the somatostatin sst2A receptor participates in the development and maturation of specific neuronal populations during rat and human brain ontogenesis

Ankyrin G restricts ion channel diffusion at the axonal initial segment before the establishment of the diffusion barrier

Ion channel immobilization by ankyrin G is regulated by casein kinase 2 in immature hippocampal neurons

Etude des mécanismes moléculaires et cellulaires gouvernant la compartimentation des canaux sodium neuronaux

AIX-MARSEILLE2-BU Méd/Odontol. (130552103) / SudocPARIS-BIUP (751062107) / SudocSudocFranceF

Mécanismes moléculaires de la compartimentation des canaux sodiques au segment initial et aux noeuds de Ranvier (mise en évidence du rôle de la caséine kinase 2)

La physiologie du neurone est sous-tendue par sa morphologie et son organisation spécifique en sous-domaines. Dans les axones myélinisés, la région proximale, nommée segment initial constitue le site d initiation du potentiel d action (PA). Les noeuds de Ranvier permettent la conduction saltatoire du PA jusqu à la terminaison synaptique. Ces deux sous-domaines sont caractérisés par une concentration en canaux ioniques (canaux sodiques et canaux potassiques), en protéines d adhérence (neurofascine 186 et NrCAM) et en protéines adaptatrices du cytosquelette (ankyrine G et spectrine bIV). Si la formation des noeuds de Ranvier nécessite un contact étroit avec les cellules myélinisantes, l assemblage des composants du segment initial repose exclusivement sur la présence de l ankyrine G. Nous avions précédemment identifié un motif de 27 résidus, dit motif AIS, qui gouverne l adressage et l agrégation des canaux sodiques au segment initial de l axone. Fortement conservé au sein de la famille des canaux sodiques, le motif AIS interagit directement avec le domaine Membrane Binding Domain (MBD) de l ankyrine G. Or, plusieurs données de la littérature suggéraient que l interaction directe entre le motif AIS et le domaine MBD de l ankyrine ne suffisait pas à concentrer les canaux sodiques dans la membrane axonale. L objectif principal de mes travaux de thèse visait à rechercher l existence d un mécanisme additionnel. Dans un premier temps, nous avons déterminé les éléments structuraux qui gouvernent la compartimentation d un canal ionique chimérique (Kv2.1-Nav1.2) dans les neurones d hippocampe en culture. C est l action conjointe du glutamate E1111 et des sérines S1112, S1124 et S1126 du motif AIS qui est critique pour l accumulation du canal Kv2.1-Nav1.2 au segment initial. L application d un test de phosphorylation in vitro a montré que les sérines identifiées (S1112, S1124 et S1126) sont phosphorylées par la sérine/thréonine caséine kinase 2 (CK2). Nous avons évalué l impact du degré de phosphorylation du motif AIS dans l interaction avec le domaine MBD des ankyrines B et G par la méthode de Résonance Plasmonique de Surface. En l absence de phosphorylation CK2, l association entre les deux partenaires est de faible affinité (KD = 1,2 +- 0,4 10-6 M). Après phosphorylation in situ, l affinité augmente d un facteur 1000 (KD = 1,2 +- 0,4 10-9 M). Cet effet nécessite la phosphorylation par la CK2 d au moins deux serines (S1124 et S1126.). Des immunomarquages montrent que la sous-unité catalytique de la CK2 est fortement concentrée au segment initial et aux noeuds de Ranvier in vivo et dans les cultures de neurones d hippocampe. Enfin, Kv2.1-Nav1.2 agit comme un dominant négatif de la concentration des canaux sodiques endogènes au segment initial. Cet effet est annulé lorsque les sites de phosphorylation par la CK2 sont neutralisés en alanine. L ensemble de ces données montre que l accumulation des canaux sodiques au segment initial et aux noeuds de Ranvier est régulée par la concentration locale de la CK2. Cette kinase augmente l affinité des canaux sodiques pour l ankyrine G favorisant ainsi leur accumulation et leur ancrage au cytosquelette.AIX-MARSEILLE2-BU Méd/Odontol. (130552103) / SudocSudocFranceF

Mécanismes cellulaires et moléculaires de la ségrégation des canaux sodium neuronaux au segment initial de l'axone

Le segment initial de l'axone (SI), situé à la jonction entre le soma et l'axone, se distingue notamment par la ségrégation des canaux sodium voltage-dépendant (Nav), de l'ankyrine G et de la IV-spectrine. Dans les neurones d'hippocampe en culture, Nav1.2 est ségrégé et ancré au SI. Pour caractériser les mécanismes responsables de cette compartimentation, nos objectifs étaient d'identifier : (1) les déterminants et partenaires moléculaires impliqués (2) la/les voie(s) d'adressage au SI. En se basant sur l'expression de protéines chimériques, nous avons identifié la région liant les domaines transmembranaires II et III de Nav1.2 (Nav1.2 II-III) comme suffisante pour ségréger une protéine non polarisée au SI. Nav1.2 II-III porte deux motifs distincts et indépendants : (1) un motif de tri et d'ancrage au SI conservé dans tous les Nav1 et liant l'ankyrine G (2) un motif d'endocytose. En utilisant le système double hybride dans la levure, Nav1.2 II-III comme appât, nous avons identifié plusieurs partenaires potentiels de Nav1.2 au SI. La protéine Schwannomin Interacting protein 1 (SCHIP-1) a été identifiée et son interaction avec Nav1.2 II-III confirmée in vitro. SCHIP-1 est enrichie au SI des neurones d'hippocampe en culture et in vivo au SI et aux nœuds de Ranvier. Sa fonction reste encore à définir. L'analyse du trafic d'une protéine ségrégée au SI nous a permis d'établir un modèle d'adressage : (1) la protéine adressée initialement à la membrane somato-dendritique (2) diffuse jusqu'au SI où elle est piégée par l'ankyrine G (3) sa ségrégation au SI s'achève par l'endocytose des protéines insérées dans les domaine somato-dendritique et axonal distal.AIX-MARSEILLE2-BU Méd/Odontol. (130552103) / SudocPARIS-BIUP (751062107) / SudocSudocFranceF