Biochemical characterization of the human Cyclin-dependent kinases Cdk7 and Cdk10

Protein kinases comprise a large superfamily of enzymes regulating a plethora of cellular processes. Dysregulation of protein kinases, such as loss of activity, hyperactivity or mislocalisation, is often accompanied with severe malignancies. The family of Cyclin-dependent kinases (CDKs) has been first described for their regulation of the mitotic cell cycle. However, of the 21 CDK family members found in man only the CDKs 1, 2, 4, and 6 are directly involved in cell cycle regulation. Another subset regulates gene expression at the level of transcription and transcription associated processes, whereas several other CDKs have no established function yet. Common to all Cyclin-dependent kinases is the requirement of the association with a regulatory cyclin subunit for activation. In addition to cyclin binding, phosphorylation of the kinase within an activation segment, called T-loop, is required for kinase activation. Cdk7 forms a ternary complex with Cyclin H and the protein Mat1. Cdk7 is involved in both cell cycle regulation and transcription. Cdk7 phosphorylates the T-loop of the cell cycle CDKs 1, 2, 4, and 6 leading to their activation. Additionally, Cdk7 is involved in transcription initiation as it associates with the general transcription factor TFIIH. Within recent years, pharmacologic inhibition of Cdk7 has emerged as a promising therapeutic target in cancer treatment. Cdk7 has been studied for almost three decades, but nonetheless regulation of Cdk7 kinase activity at a molecular level is not understood in detail. In contrast to Cdk7, only very few studies address the functional role of Cdk10 to date. Concomitantly, the regulatory cyclin subunit of Cdk10, Cyclin M, has not been identified until 2013. In cancer, Cdk10 is mostly described as a negative regulator of cell cycle progression and reduced Cdk10 levels were found to confer tamoxifen resistance in breast cancer. In this thesis, the human cyclin-dependent kinases Cdk7 and Cdk10 in complex with their regulatory subunits have been analysed by biochemical and biophysical techniques. In contrast to other CDKs, Cdk7 is phosphorylated at two sites within its T-loop, Ser164 and Thr170. Of these two sites, Thr170 resembles the canonical activation residue which is conserved among CDKs. The second phosphorylation site at Ser164 has been implicated in stability and activity regulation of Cdk7 but no apparent function has been attributed to this phosphorylation mark so far. A focus of the first part of this thesis was to study the effect of Cdk7 Ser164 phosphorylation on kinase activity and complex formation using recombinant protein. By mutational analyses, in which Cdk7 Ser164 was replaced by a non-phosphorylatable alanine, it could be shown that phosphorylation of Cdk7 is required for full activity of the ternary Cdk7/CycH/Mat1 complex. Importantly, the Cdk7 S164E mutation, which was introduced in order to mimic the Cdk7 Ser164 phosphorylation, did not recapitulate the effect of Ser164 phosphorylation in wild type Cdk7 preparations. However, the effect of Ser164 phosphorylation within ternary complexes could be restored in the Cdk7 S164E mutant by truncation of the Cyclin H C-terminus to amino acid 291 (CycH 1-291). Surprisingly, the Cdk7 S164A mutant failed to bind the truncated CycH (1-291) protein in co-purification experiments. This result was unexpected as the Cyclin H C-terminus is supposed to be unstructured and does not contain any canonical feature for Cdk/Cyclin interaction. Together, these data suggest an inhibitory regulatory element residing in the C-terminus of Cyclin H which is reallocated upon Cdk7 Ser164 phosphorylation. Despite its discovery 25 years ago, only little is known about the Cyclin-dependent kinase 10 (Cdk10) and its cellular functions. In the second part of this thesis, human recombinant Cdk10/CycM from Sf9 insect cells was analysed for activity and substrate specificity. Moreover, new substrates of Cdk10/CycM were identified by mass spectrometry analyses. Expression of wild type Cdk10/CycM complexes in Sf9 cells resulted in active kinase complexes without special needs to activate the kinase recombinantly. Initial activity measurements in radioactive kinase assays using recombinant substrates revealed in vitro kinase activity towards the typical CDK substrates c-MYC and RNA polymerase II C-terminal domain (CTD). In order to identify new Cdk10 substrates by mass spectrometry, an in vitro chemical genetic screen was performed. To this end, the Cdk10 gatekeeper residue methionine 117 was mutated to glycine resulting in an analogue-sensitive Cdk10 M117G mutant. The Cdk10 M117G mutation enlarges the ATP binding pocket which allows Cdk10 to tolerate bulky ATP-analogues as substrates. Due to their size, these ATP-analogues are not used by native, cellular kinases which confers specificity of the labelling reaction to the mutant Cdk10 M117G/CycM complex. To discriminate and purify Cdk10 M117G/CycM phosphorylated proteins from other phosphoproteins in the lysate, ATP-gamma-S analogues were used which allows for the specific enrichment by a covalent capture and release protocol. Mass spectrometric identification of thio-phosphorylated proteins from cell lysates and nuclear extracts was performed in collaboration with Prof. Dr. Henning Urlaub at the Max Planck Institute for Biophysical Chemistry in Göttingen. In total, 66 putative Cdk10/CycM substrates were identified. Analysis of the biological function by GO-term analysis shows an enrichment of RNA regulatory and translation related proteins. Six of the putative substrates were selected and validated as Cdk10/CycM substrates in vitro using recombinant proteins in kinase activity measurements. In this thesis a new regulatory mechanism for Cdk7 activity regulation was discovered. Given the central role of Cdk7 in cell cycle and transcription regulation as well as its pharmacological relevance as a target in cancer, mechanisms that alter Cdk7 activity are of major importance to understand the physiological and pathological roles of Cdk7. Future studies shall be performed to address the regulation by Cdk7 Ser164 phosphorylation in vivo. In case of Cdk10, this study will facilitate future investigations by providing a protocol for the recombinant expression and purification of Cdk10/CycM complexes. Moreover, the thesis contains a rich dataset of Cdk10 substrates, which will help to elucidate the biological function of this kinase complex.Die Familie der Proteinkinasen umfasst im Menschen 518 verschiedene Mitglieder welche eine Vielzahl zellulärer Prozesse und Signalwege regulieren. Fehlregulation von Kinasen wie beispielsweise Mutationen, die zu Verlust oder Hyperaktivität der enzymatischen Aktivität führen sind häufig mit Krankheiten assoziiert. Die Familie der Zyklin-abhängigen Kinasen (engl. Cyclin-dependent kinase, CDK) ist bekannt für die Regulation der zellulären Proliferation. Allerdings haben von den 21 CDKs, die im Menschen vorhanden sind nur vier, nämlich Cdk1, 2, 4 und 6 einen direkten Einfluss auf die Regulation des Zellzyklus. Andere Vertreter dieser Gruppe regulieren die Transkription der DNA. Gemeinsam ist diesen Kinasen, dass sie erst durch Bindung einer regulatorischen Untereinheit, dem Zyklin, in eine Aktive Konformation überführt werden. Zudem ist für die Aktivität eine Phosphorylierung im Aktivierungssegment, dem T-loop, nötig. In Zellen assoziiert die Kinase Cdk7 mit ihrer regulatorischen Untereinheit Zyklin H (engl. Cyclin H, CycH) sowie einem weiteren, stabilisierend wirkendem Protein, Mat1. Innerhalb der CDKs kommt Cdk7 eine Sonderstellung zu, da es einerseits die Zellzyklus CDKs 1, 2, 4 und 6 durch Phosphorylierung im T-loop aktiviert und andererseits als Teil des allgemeinen Transkriptionsfaktors TFIIH unmittelbar an der Regulation der Transkription beteiligt ist. Zudem kommt Cdk7 eine in den letzten Jahren wachsende Bedeutung für die Therapie verschiedener Krebserkrankungen zu. Trotz des großen Interesses sind die molekularen Grundlagen für die Regulation von Cdk7 jedoch noch immer nur unzureichend verstanden. Im Gegensatz zu Cdk7, welches in den vergangenen Jahrzehnten Gegenstand intensiver Forschung war ist die Zyklin-abhängige Kinase 10 (Cdk10) bisher kaum erforscht. Die identifizierung der regulatorischen Zyklin-Untereinheit erfolgte zudem erst 2013. In Krebsmodellen fungiert Cdk10 meist als ein negativer Regulator des Zellzyklus und verminderte Cdk10 Expressionslevel wurden als mögliche Ursache für Tamoxifenresistenz bei Brustkrebs identifiziert. In dieser Doktorarbeit wurden die humanen Zyklin-abhängigen Kinasen Cdk7 und Cdk10, sowie deren regulatorische Untereinheiten heterolog exprimiert und mittels biochemischer und biophysikalischer Methoden untersucht. Im Gegensatz zu anderen CDKs wird Cdk7 an zwei Stellen, Ser164 und Thr170, innerhalb seines Aktivierungssegments phosphoryliert. Dabei handelt es sich bei Thr170 um die kanonische Phosphorylierungsstelle für die Aktivierung der Kinase, welche auch in den anderen CDKs konserviert ist. Der zusätzlichen Phosphorylierung von Cdk7 an Ser164 wurde eine Rolle für die Stabilität, sowie die Aktivität der Kinase zugeschrieben. Allerdings konnte in bisherigen Studien keine Eindeutige molekulare Funktion dieser post-translationalen Modifikation gefunden werden. Ein Fokus dieser Arbeit war der Einfluss der Cdk7 Ser164 Phosphorylierung auf die Kinaseaktivität, sowie die Komplexbildung von Cdk7 mit seinen regulatorischen Untereinheiten. Cdk7 Serin164 wurde dazu durch die Aminosäure Alanin, welche nicht phosphoryliert werden kann oder die Aminosäure Glutamat, welche eine konstitutive Phosphorylierung simuliert, ersetzt. Beide Punktmutanten wurden dann mit an Ser164/Thr170 doppelt phosphoryliertem wildtyp Cdk7 Präparationen verglichen. Es zeigte sich, dass die zusätzliche Phosphorylierung an Cdk7 Ser164 notwendig für die volle Aktivität von heterotrimeren Cdk7/CycH/Mat1Komplexen ist. Auf die Aktivität heterodimerer Cdk7/CycH Komplexe hatte die phosphorylierung hingegen keinen Einfluss. Die Ser164 Mutationen hatten keinen Einfluss auf die Bindungsaffinität des Cdk7/CycH Komplexes an Mat1. Interessanterweise, ließ sich die Phosphorylierung von Cdk7 Ser164 nicht durch die Punktmutation von Serin164 zu Glutamat adäquat imitieren. Allerdings führte eine C-terminale Trunkierung von Cyclin H an Aminosäure 291 (CycH 1-291) zu einer gesteigerten Aktivität in trimeren Cdk7S164E/CycH (1-291)/Mat1 Komplexen, die mit der von wildtyp Cdk7 vergleichbar war. Überaschenderweise führte die Entfernung des C-Terminus von Cyclin H zu einem kompletten Verlust der Bindung an die Cdk7 S164A Mutante. Dies ist insofern überraschend als das sich im C-terminale Abschnitt von Cyclin H keine Elemente befinden, die für die Cdk/Zyklin Interaktion beschrieben sind. Zusammen weisen diese Daten darauf hin, dass der C-terminus von Cyclin H, in Verbindung mit Cdk7 Ser164 Phosphorylierung, eine unerwartete Rolle bei der Cdk7/CycH Bindung und der Aktivitätsregulation von ternären Cdk7/CycH/Mat1 Komplexen einnimmt. Trotz der ersten Beschreibung von Cdk10 vor bereits 25 Jahren ist wenig über die zelluläre Funktion der Zyklin-abhängigen Kinase Cdk10 bekannt. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde humane recombinant hergestellte Cdk10/CycM Komplexe auf ihre Aktivität und Substratspezifität hin untersucht. Zudem wurden neue Substrate von Cdk10/CycM mittels Massenspektrometrie. Initiale Aktivitätsmessungen mit wildtyp Cdk10/CycM zeigten eine in vitro Aktivität gegenüber der RNA polymerase II C-terminalen Domäne, sowie des Transkriptionfaktors c-MYC. Bisher sind lediglich die Proteine ETS-2, sowie PKN2 als Cdk10 Substrate beschrieben. Zur Erweiterung des Substratspektrums wurden in dieser Arbeit neue Cdk10 Substrate in vitro mittels Massenspektrometrie bestimmt. Dazu wurde per Punktmutation von Cdk10 Methionin zu Glycin eine Analog-sensitive Cdk10/CycM Mutante generiert. Die Punktmutation vergrößert die ATP Bindungstasche und erlaubt so die Verwendung von N6-modifizierten ATP-Analogen, welche nicht von nativen Kinasen verwendet werden können. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung von N6-modifiziertem ATP-gamma-S zu einer bio-orthogonalen thio-phosphorylierung, die die spätere Diskriminierung und Anreicherung der Cdk10 M117G/CycM Substrate ermöglicht. In Aktivitätstests konnte gezeigt werden, dass die Punktmutation Cdk10 M117G nicht zu einem Verlust der Kinaseaktivität führt. Zudem konnte die sensitivität gegenüber N6-modifizierter ATP-Analoga bestätigt werden. Die Anreicherung der thio-phosphorylierten Substrate, sowie die Massenspektrometrische identifizierung etwaiger Cdk10/CycM substrate erfolgte in Kollaboration mit Prof. Dr. Henning Urlaub vom Max Planck Institut für Biophysikalische Chemie in Göttingen. Insgesamt konnten 66 neue Cdk10/CycM Substrate identifiziert werden. Die Analyse der biologischen Funktion mittels GO-term zeigte eine Anreicherung für RNA modifizierende und translatorische Prozesse. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Phosphorylierung von Cdk7 an Ser164 für die volle Aktivität des trimeren Cdk7/CycH/Mat1 Komplexes notwendig ist. In Anbetracht der zentralen Rolle von Cdk7 für Zellzyklus und Transkription sollten zukünftige Studien den phosphorylierungsstatus von Cdk7 in ihre Analyse einbeziehen. Im Falle von Cdk10/CycM liefert diese Arbeit erste Einblicke in das Substratspektrum dieser Kinase, sowie in die damit verbundenen zellulären Prozesse. Zudem ermöglicht das entwickelte Protokoll für die rekombinante Darstellung des Cdk10/CycM Komplexes eine wichtige Basis für weitere Studien

Nichtlineare Registrierung von Diffusions-Tensor-Bildern

Viele Wissenschafts- und Ingenieursdisziplinen, wie Mikroskopie, medizinische Diagnostik, Astronomie oder Maschinenbau, nutzen die Methoden und Techniken der Bildverarbeitung, um bestimmte Objekte darzustellen, zu zählen, zu vermessen und Ähnliches. Eine häufig genutzte Technik in der digitalen Bildverarbeitung ist die Bildregistrierung. Darunter versteht man Methoden, die es ermöglichen, zwei oder mehrere Bilder derselben Szene, oder zumindest ähnlicher Szenen, bestmöglich in Übereinstimmung miteinander zu bringen. Mit anderen Worten, beim Registrierungsproblem geht es darum, eine Übereinstimmung zwischen den Punkten zweier oder mehrerer Bilder herzustellen

Methylierte Arsen- und Antimonspezies in Böden und Sedimenten

Die Konzentrationen methylierter As- und Sb-Verbindungen (MAs- und MSb-Verbingungen) in Böden und Sedimenten (93 Proben) liegen im Bereich von 10 - 10 μg/kg. Die dominierenden Spezies sind Monomethylarsen (MMAs), Dimethylarsen (DMAs) und Monomethylantimon (MMSb) sowie Dimethylantimon) DMSb. Die höchsten Konzentrationen treten in Böden und Sedimenten auf, welche entweder eine deutliche Förderung der Bodenbiologie erfahren (z.B. Äcker) oder eine starke Belastung mit anorganischem As und Sb zeigen (z.B. Spülteich der Bleierzgewinnung). Standorte, welche keiner direkten anthropogenen Kontamination mit As und Sb unterliegen traten Konzentrationen < 20 μg/kg auf. Für das Vorkommen von MAs und MSb im Feststoffanteil von Böden und Sedimenten, als auch in echter Lösung des Sedimentporenwassers (Mikrofiltration), liegt ein statistisch signifikanter Zusammenhang vor. Im Gegensatz zu den MAs-Spezies erfahren die MSb-Spezies im Frühjahr in einem Ackerboden eine Speziesmuster Verschiebung hin zum DMSb. Der Gehalt an MSb-Spezies in sedimentbürtigen Schwebstoffen der Ruhr steht in einer direkten Beziehung zum Winterhochwasser und ist am deutlichsten durch die Verlagerung von Sediment- und Bodenmaterial aus dem Einzugsgebiet der Ruhr (Niederschläge und Schneeschmelze) beeinflusst. MAs Spezies in den schwebstoffbürtigen Sedimenten zeigen die stärkste Beeinflussung durch die Frühjahrsalgenblüte. Dies ist ein Beleg der besseren Metabolisierung von As im Vergleich zu Sb durch Süßwasseralgen. In verschiedenen Inkubationsexperimenten, unter anderem mit dem Sediment Or Fauna Incubation Experiment (SOFIE®, EU-patent 1018200 / 02077121.8), wird das gesamte Muster an methylierten As und Sb Spezies (mono-, di-, trimethyl-,) im 0,1 μm filtrierten Porenwasser belegt (im Bereich von 1 μg/l). Dies ist der erste Nachweis dieser Spezies in echter Lösung des Porenwassers und unterstreicht die Umweltrelevanz des Methylierungsprozesses bei der Verlagerung der Metalloide. Die Methylierung erfolgt für beide Elemente sowohl aerob, als auch anaerob. Im Gegensatz zu den Speziesmustern im Feststoffanteil, sind die Muster in den Porenwässern der Inkubationsversuche eindeutig durch das Auftreten zweifach methylierter Spezies dominiert. Neben der signifikanten Korrelation zwischen MAs und MSb im Porenwasser und im Feststoffanteil, wird ein statistischer Zusammenhang zwischen der Sb Konzentration der einen Probenentnahme und der MSb Konzentration der darauf folgenden Probenentnahme belegt. Dies legt den zeitlichen Rahmen zwischen der höchsten Verlagerbarkeit/Verfügbarkeit der anorganischen Spezies bis zu der Verlagerung der methylierten Spezies auf 10 - 20 Tage fest. Weitere Zusammenhänge zwischen dem Auftreten von Sb-Spezies im Porenwasser und Begleitparametern waren nicht zu belegen. Für As wird ein Zusammenhang zwischen dem As(III) Gehalt und dem Gehalt an MMAs dokumentiert. Das parallele Auftreten von As(III) und MMAs in echter Lösung des Porenwassers zeigt, dass ein zählbarerer Anteil der beiden Spezies nicht einer weiteren Umwandlung durch eine Methylierung unterworfen ist, sondern von den Organismen unter nativen Bedingungen an die Umgebung abgegeben wird. Auch hier spricht die gute Übereinstimmung mit den Zeitpunkten der höchsten biologischen Aktivität gegen eine maßgebliche anorganische Umwandlung der Spezies. Für eine Beurteilung der Umweltrelevanz der im Screening- und Laborversuchsteil ermittelten Konzentrationen an MAs und MSb, wurden Selenastrum capricornutum, Wolffia arrhiza und Lemna minor mit As- und Sb-Spezies belastet. Als Merkmal für die Schädigung der Organismen wurde für die Grünalge die Reduktion der photochemischen Effizienz des PSII genutzt und für die höheren Pflanzen die Reduktion des Wachstums über die Anzahl der Fronds. Die höchste Toxizität zeigten As(III) und MMAs(III). Die beiden As-Spezies zeigen EC-Werte im Bereich von 1 mg/l. Die EC-Werte von TMSb(V) und As(V) sind im Bereich von 10 - 10 mg/l. Sb(III), Sb(V), MMA(V), DMAs(V) und TMAs(V) zeigen EC-Werte deutlich über 10 mg/l. Für As(III) muss von einer Unterbewertung der Toxizität ausgegangen werden, da eine 50 %ige Oxidation des As(III) nach ~ 5 Tagen, unter den herrschenden Versuchsbedingungen, erfolgte. Deutlich höher in der Umweltrelevanz als die akute Toxizität ist eine Verlagerung methylierter As- und Sb- Verbindungen in echter Lösung (0,1 μm filtriert) über das Porenwasser zu beurteilen. Für Antimon traten im filtrierten Porenwasser und dem Freiwasser in 15 von 63 Fällen prozentuale Anteile der MSb am Sb > 10% auf. Dies lag für MAs- Spezies in 6 von Fällen 55 vor. Somit kommt der Methylierung insbesondere bei der Verlagerung des Antimons in Böden und Sedimenten eine wesentliche Rolle zu

Mechanical Characterisation of Cables in Different Loading Directions

The mechanical characterisation of cables can help improving the production and lifetime of various products, for example a robotic arm. Cables however form a class of composite structures, that is highly anisotropic and dissipates energy due to the reorientation of its constituents which is superimposed by the dissipation due to the deformation of the polymer components. Cables also have a degree of randomness in their structure. Moreover, the stiffness in one loading direction is coupled to the stiffness in another loading direction. In this work, experimental investigations on the mechanical properties of the cables are presented. An experimental setup has been constructed to test the cables in tensile, torsion and the bending directions individually as well as coupled to each other. Free bending tests were conducted where axial forces were compensated during the bending to dissociate the tensile and the bending properties of the cables. To apply larger tensile and torsional loads on cables a commercial testing device was also used. To characterise the influence of bending on torsion, free bending tests were conducted with a combination of torsional load. Thus, a complete mechanical characterisation of a cable is presented

Avaliação da integridade de ácaros de Demodex spp. coletados por impressão por fita adesiva

A demodicidose é uma das doenças mais frequentemente diagnosticadas na clínica de pequenos animais. Ela ocorre quando a população de ácaros residentes nos folículos pilosos e glândulas sebáceas aumenta de forma exacerbada. Possui duas formas de apresentação clínica: localizada e generalizada. A primeira é mais frequente em animais entre três e seis meses de idade, e na maioria dos casos a remissão é espontânea. A segunda acomete principalmente animais entre três e 18 meses de idade, e requer tratamento. O diagnóstico é feito por meio de exame parasitológico de pele no qual observam-se grande número de ácaros adultos ou uma maior proporção de formas imaturas. Dentre as possíveis formas de realização deste exame, a fita adesiva destacase pela facilidade na execução, ser atraumática, e poder ser realizada em locais mais delicados. Muitas vezes a rotina clínica não permite que as amostras sejam analisadas imediatamente após colheita, por isso o presente estudo teve como objetivo avaliar a integridade de ácaros de Demodex spp., coletados por meio de impressão por fita adesiva, em intervalos de 24 horas pós-colheita por cinco dias. Foram analisadas 25 amostras positivas provenientes da rotina de atendimento do DERMATOVET/ HCVUFRGS, sendo que 15 (n=60%) eram de animais que estavam em tratamento, e 10 (n=40%) de animais que foram diagnosticados no momento da consulta. Quando considerada como positiva a amostra com no mínimo um ácaro classificado como “íntegro”, a durabilidade média das amostras foi de 0,96 dias. Já quando considerado como positiva a presença de no mínimo um ácaro classificado como “degradado”, a durabilidade média das amostras foi de 2,6 dias. As amostras positivas de ácaros “íntegros” do grupo que não estava em tratamento tiveram durabilidade média de dois dias, enquanto nas amostras positivas de ácaros “degradados” do mesmo grupo foi de 3,9 dias. No grupo que estava em tratamento, a durabilidade média dos ácaros “íntegros” foi de 0,26 dias, enquanto a dos ácaros “degradados” foi de 1,73 dias. Portanto, os ácaros classificados como “íntegros” tem uma maior (e mais rápida) degradação do que aqueles classificados como “degradados”, especialmente se a amostra for oriunda de um cão em tratamento. Por fim, pode-se concluir que é possível haver um prazo na avaliação das amostras após a colheita, desde que esse tempo não seja superior a 48 horas para amostras oriundas de animais sem tratamento acaricida e 24 horas para amostras provenientes de animais sob terapia acaricida. Após estes períodos, os ácaros já não estão mais em condições íntegras, levando a uma dificuldade de visualização do parasito, e maior chance de resultados falso-negativos.Demodicosis is one of the most frequently diagnosed disease in the small animal clinic. It occurs when the population of mites living in hair follicles and sebaceous glands increases in an exacerbated form. It has two clinical forms: localized and generalized. The first one is most common in animals between three and six months old, and in most cases has spontaneous remission. The second one affects mainly animals between three and 18 months of age, and requires treatment. The diagnosis is made either by demonstrating large numbers of adult mites or by finding an increased ratio of immature forms. Among the different ways to perform the diagnosis, the acetate tape impression is distinguished by being easy to perform, atraumatic, and possible to be performed in most delicate places. Many times in the clinical routine is not possible to analize the samples right away, so this paper aimed to evaluate the integrity of Demodex spp. mites, collected through acetate tape impression at intervals of 24 hours post collection for five days. Twenty five positive samples from routine care of DERMATOVET / HCV-UFRGS were analyzed, 15 (n = 60%) were from animals that were treated, and 10 (n = 40%) from animals that have been diagnosed at the time of the appointment. During the five days, the mites were classified as "integrate" and "degraded," and the average durability of the first positive samples was 0.96 days, and the second was 2.6 days. By affecting different forms cell membranes, causing increased fragility in the parasite samples from animals that were not in treatment were compared with those from animals that were in treatment. Positive samples of mites "integrate" from the group that was not treated had an average durability of two days, while positive samples of mites "degraded" from the same group had an average durability of 3.9 days. In the group that was treated, the average durability of the "integrate" mites was 0.26 days, while that of "degraded" mites was 1.73 days. Therefore, mites classified as "integrate" has greater (and more rapid) degradation than those classified as "degraded", especially if the sample is derived from a dog being treated. Finally, we can conclude that it is possible to be a "delay" in the evaluation of samples after collection, if this time do not exceed more than 48 hours for samples from animals without acaricide treatment, and 24 hours for samples from animals under acaricide therapy. After these periods, the mites are no longer in intact conditions, making difficult the parasite observation, and a higher chance of false-negative results

A multiscale DEM–FEM coupled approach for the investigation of granules as crash-absorber in ship building

This paper covers a numerical analysis of a novel approach to increasing the crashworthiness of double hull ships. As proposed in Schöttelndreyer (Füllstoffe in der Konstruktion: ein Konzept zur Verstärkung vonSchiffsseitenhüllen, Technische Uni-versitt Hamburg, Hamburg, 2015), it involves the usage of granular materials in the cavity of the double hull ship. For the modeling of this problem, the discrete element method (DEM) is used for the granules while the finite element method is used for the ship’s structure. In order to account for the structural damage caused by collision, a gradient-enhanced ductile damage model is implemented. In addition to avoid locking, an enhanced strain-based formulation is used. For large-scale problems such as the one in the current study, modeling of all granules with realistic size can be computationally expensive. A two-scale model based on the work of Wellmann and Wriggers (Comput Methods Appl Mech Eng 205:46–58, 2012) is applied—and the region of significant localization is modeled with the DEM, while a continuum model is used for the other regions. The coupling of both discretization schemes is based on the Arlequin method. Numerical homogenization is used to estimate the material parameters of the continuum region with the granules. This involves the usage of meshless interpolation functions for the projection of particle displacement and stress onto a background mesh. Later, the volume-averaged stress and strain within the representative volume element is used to estimate the material parameters. At the end, the results from the combined numerical model are compared with the results from the experiments given in Woitzik and Düster (Ships Offshore Struct 1–12, 2020). This validates both the accuracy of the numerical model and the proposed idea of increasing the crashworthiness of double hull vessels with the granular materials. © 2021, The Author(s)

Functional characterization of the human Cdk10/Cyclin Q complex

Cyclin-dependent kinases (CDKs) are key players in cell cycle regulation and transcription. The CDK-family member Cdk10 is important for neural development and can act as a tumour suppressor, but the underlying molecular mechanisms are largely unknown. Here, we provide an in-depth analysis of Cdk10 substrate specificity and function. Using recombinant Cdk10/CycQ protein complexes, we characterize RNA pol II CTD, c-MYC and RB1 as in vitro protein substrates. Using an analogue-sensitive mutant kinase, we identify 89 different Cdk10 phosphosites in HEK cells originating from 66 different proteins. Among these, proteins involved in cell cycle, translation, stress response, growth signalling, as well as rRNA, and mRNA transcriptional regulation, are found. Of a set of pan-selective CDK- and Cdk9-specific inhibitors tested, all inhibited Cdk10/CycQ at least five times weaker than their proposed target kinases. We also identify Cdk10 as an in vitro substrate of Cdk1 and Cdk5 at multiple sites, allowing for a potential cross-talk between these CDKs. With this functional characterization, Cdk10 adopts a hybrid position in both cell cycle and transcriptional regulation