Whole exome sequencing of Urothelial Bladder Cancer: identification of ARID1A and STAG2 as new, important, players

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 28-11-2014Despite the high incidence and economic cost of UBC, the molecular landscape of this tumor type remains relatively understudied. In this dissertation I describe the identification of novel genes involved in the development of UBC, using whole exome sequencing and a combination of targeted resequencing strategies. Our findings confirm previous studies pinpointing the chromatin remodeling pathway as frequently altered in UBC, including mutations in ARID1A, KDM6A, CREBBP, EP300, MLL, and MLL3. Moreover, we identified mutations in previously unreported genes belonging to this pathway (MLL2, ASXL2, and BPTF). Additionally, for the first time we found frequent mutations in DNA repair genes (ATM, ERCC2, and FANCA), as well as in subunits of the cohesin complex (STAG1, STAG2, SMC1A, and SMC1β). We did not identify significant differences in number or type of mutations according to tumor aggressiveness, patient age or smoking status. We analyzed mutations and loss of ARID1A expression to place them in the context of current bladder cancer molecular knowledge, finding they preferentially associated with the aggressive pathway of genetic progression. Regarding cohesin, we assessed the expression of its components in a cohort of 91 UBCs, finding low-frequency losses of SMC1, SMC3, RAD21, and PDS5B, as well as much more frequent losses of STAG2 expression. Intriguingly, we found that meiotic cohesin components SMC1β, REC8, and STAG3 are also expressed in UBC. We then focused on STAG2: mutations, predominantly truncating, were distributed all along the gene with a pattern characteristic of tumors suppressors, and were more frequent in non-aggressive UBCs. We also found evidence of genomic losses as a cause of STAG2 inactivation in a small subset of tumors. Loss of STAG2 was more common in non-aggressive tumors and associated with low proliferative index, mutations in FGFR3, and normal p53 expression. Importantly, STAG2 negative tumors frequently retained STAG1 expression, suggesting the competence of the cohesin complex. Contrary to what has been reported in other tumor types, STAG2 loss was not associated with aneuploidy in UBC tumors. Moreover, downregulating STAG2 in vitro did not cause significant changes in chromosome number or centromeric cohesion defects. As expected for a tumor suppressor, STAG2 overexpression impaired colony formation in vitro. Surprisingly, the same effect was seen upon STAG2 knockdown. RNA-sequencing of STAG2 knockdown cells did not reveal consistent transcriptional changes. Lastly, we found that loss of STAG2 associated with improved outcome in both NMIUBC and in MIUBC. However, it was an independent predictor of outcome only in the latter. Altogether, this work supports an important role of chromatin remodeling and cohesin components in UBC and contributes to refine the genetic events involved in UBC development/progression. Further studies are needed to unveil the mechanisms through which ARID1A and STAG2 alterations contribute to UBC and to determine whether they can improve the molecular taxonomy of this tumor and can be used in patient management.Pese a la alta incidencia y coste económico del cáncer de vejiga (CV), el panorama molecular de este tipo de tumor permanece relativamente poco estudiado. En este trabajo describo la identificación de nuevos genes involucrados en el desarrollo de CV usando secuenciación de exomas y una combinación de estrategias de resecuenciación dirigida. Nuestros hallazgos confirman estudios previos que apuntaban a que las vías de remodelación de la cromatina sufre alteraciones frecuentes en CV, incluyendo mutaciones en ARID1A, KDM6A, CREBBP, EP300, MLL, y MLL3 (Gui 2011). Además, hemos identificado alteraciones en genes no descritos que pertenecen a esta vía (MLL2, ASXL2, y BPTF). Por primera vez, hemos encontrado alteraciones frecuentes en genes involucrados en la reparación del ADN (ATM, ERCC2, y FANCA), así como en subunidades del complejo cohesina (STAG1, STAG2, SMC1A, y SMC1β). No hemos identificado diferencias significativas en el número o tipo de alteraciones de acuerdo a la agresividad del tumor o a la edad o exposición al tabaco del paciente. Hemos analizado más a fondo las mutaciones y pérdida de expresión de STAG2 para colocarlas en el contexto de las vías moleculares del CV conocidas, encontrando que se asocian preferentemente con la vía más agresiva de progresión genética. Para caracterizar en detalle el papel del complejo cohesina en CV, valoramos la expresión de los componentes del complejo en una población de 91 CV, hallando pérdidas poco frecuentes de SMC1, SMC3, RAD21, y PDS5B, así como pérdidas mucho más frecuentes de la expresión de STAG2. Curiosamente, hemos observado que SMC1β, REC8 y STAG3, componentes de la cohesina meiótica, también se expresan en CV. Hemos analizado las alteraciones y pérdida de expresión de STAG2 en una población más numerosa de CV, hallando tanto mutaciones como pérdidas genómicas que son responsables de la pérdida de expresión de STAG2 en CV. La mayoría de las mutaciones en STAG2 son truncantes, se distribuyen a lo largo de la secuencia de la proteína en un patrón característico de los supresores tumorales y son más frecuentes en los CV no agresivos. La pérdida de STAG2 es más común en los tumores no agresivos y se asocia a mutaciones en FGFR3, expresión normal de p53 y un índice proliferativo bajo. Los tumores que no expresan STAG2 suelen retener la expresión de STAG1, lo que sugiere que en este contexto el complejo cohesina permanece activo. La pérdida de STAG2 no se correlaciona con la diferenciación de las células uroteliales. Al contrario de lo que se ha reseñado en otros tipos de tumores, la pérdida de STAG2 no causa aenuploidía o defectos en la cohesión centromérica en líneas celulares o tumores de CV. Como se esperaría de un supresor tumoral, la sobreexpresión de STAG2 impide la formación de colonias in vitro. Sorprendentemente, al silenciar la expresión de STAG2 se observa el mismo efecto. Sin embargo, la secuenciación de RNA de células en las que se había silenciadoSTAG2 no reveló cambios transcripcionales consistentes. Por último, hemos descrito que la pérdida de STAG2 también se asocia con un mejor resultado en el CV invasivo. En conjunto, este trabajo apoya la importancia del papel de los remodeladores de cromatina y de los componentes de la cohesina en CV y contribuye a refinar los eventos genéticos involucrados en el desarrollo/progresión del CV. Hay que realizar más estudios para determinar si las alteraciones en ARID1A y STAG2 contribuyen a la taxonomía molecular del CV y para mejorar el manejo de los paciente

Análisis dinámico in situ de transmisores de presión capacitivos

Los sensores de presión capacitivos tipo Rosemount son ampliamente utilizados en las centrales nucleares para la medida de la presión, el caudal y el nivel. Están unidos a las líneas de proceso de la central mediante líneas sensoras siendo el mantenimiento del sistema sensor-línea fundamental para mantener la seguridad en la planta. La vigilancia in situ del sistema en su conjunto, sensor-línea, se suele realizar mediante la medida del tiempo de respuesta del transmisor de presión con las técnicas de análisis de ruido. Sin embargo, determinadas averías como la pérdida de aceite de su cámara interna no son detectables por medio de la medida del tiempo de respuesta, ya que éste apenas varía su valor en una fase incipiente del síndrome. No obstante, la mejora de la descripción dinámica del sensor podría servir para detectar dichas averías. En laboratorio se ha demostrado que la función de transferencia del sistema sensor-línea puede tener más de un polo real, y en consecuencia, el modelo de tres polos (dos polos complejos conjugados y uno real) utilizado hasta ahora en otros trabajos podría sustituirse por uno de cuatro o incluso cinco. En este trabajo se propone utilizar técnicas de vigilancia in situ basadas en el análisis de ruido y en el Dynamic Data System para ampliar la descripción dinámica del sensor y con ello mejorar las posibilidades de diagnóstico de averías como el síndrome de la pérdida de aceite del sensor en fases incipientes. Se han analizado varias medidas de planta con la metodología propuesta y se muestran los resultados obtenidos

La educación en la naturaleza como recurso para el aprendizaje ecosocial en Educación Infantil: Una propuesta de uso de la Dehesa Boyal en el CEIP Tempranales (San Sebastián de los Reyes, Madrid)

El objetivo de este Trabajo de Fin de Grado es proponer un proyecto de innovación basado en la educación en la naturaleza que dé respuesta a la necesidad de abordar aprendizajes ecosociales dentro del currículo de Educación Infantil. A través de este proyectose busca ampliar los conocimientos docentes acerca de la metodología de educación a la naturaleza, además de proporcionar recursos concretos para el desarrollo de hábitos ecosocialmente responsables, a través de actividades innovadoras en la Dehesa Boyal destinadas al alumnado de 5 años del CEIP Tempranales (San Sebastián de los Reyes,Madrid). Tras justificar la pertinencia de la temática elegida, se realiza una revisión de la bibliografía con el objetivo de delimitar los contenidos del aprendizaje ecosocial, destacar los beneficios de la educación en la naturaleza, realizar un breve recorrido histórico por las experiencias puestas en marcha y acotar los principios metodológicos subyacentes. Posteriormente, se lleva a cabo un análisis de las necesidades y destinatarios del proyecto, dando paso al proyecto de innovación, del que inicialmente se acotan los objetivos. Además, se describe brevemente la organización y contenido de las 24 sesiones que lo componen, 14 de las cuales implican salidas a la Dehesa Boyal con el alumnado entre octubre y junio. A continuación, se realiza una descripción en detalle de 5 de las situaciones de aprendizaje diseñadas, para finalizar con un pormenorizado plan para evaluar todos los aspectos del proyecto de innovación. Como cierre del trabajo, se realiza una reflexión sobre el grado de consecución de los objetivos planteados para el mismo, señalándose los puntos fuertes y débiles del proyecto y explorándose sus implicaciones a futuro.2022-2

Application of autoclave treatment for development of a natural wheat bran antioxidant ingredient

Producción CientíficaThe study evaluated the effect of autoclaving as a hydrothermal treatment on the quality and bioactivity of wheat bran (WB) with the objective of producing a natural ingredient with enhanced healthy properties. Nutritional, antioxidant, techno-functional and sensorial parameters were studied, and temperatures of 100, 115 and 130 °C were explored. Of these, 130 °C was found to be the best treatment, resulting in an ingredient with high storage stability, antioxidant properties, a four-fold increase in the concentration of free ferulic acid (compared with non-treated WB), and increased content of apigenin-6-C-arabinoside-8-C-hexoside, a flavonoid with reported antioxidant and antifungal properties. On the other hand, the autoclave treatment enhanced water absorption capacity and reduced WB pasting viscosity, mainly at higher temperature (130 °C), which would allow incorporation of the treated WB in liquid matrices such as juices, soups or milkshakes, among others. Although the glycemic index (GI) of the autoclaved samples increased, the use of intermediate particle size of 106 to 300 µm could contribute to the reduction of the glycemic load.European Union through FEADER project Biodough (PEP 2017-807) 2018–2020FEDER/Ministry of Science, Innovation and Universities-Spanish Agency of Research (AEI/Spain and FEDER/UE), grant number AGL2017-83718RITACYL and University of Valladolid and to MINECO/FEDER (AGL2015-63849-C2-2-R)Junta de Castilla y León/FEDER (VA165G18

ARID1A alterations are associated with FGFR3-wild type, poor-prognosis, urothelial bladder tumors

Urothelial bladder cancer (UBC) is heterogeneous at the clinical, pathological, genetic, and epigenetic levels. Exome sequencing has identified ARID1A as a novel tumor suppressor gene coding for a chromatin remodeling protein that is mutated in UBC. Here, we assess ARID1A alterations in two series of patients with UBC. In the first tumor series, we analyze exons 2–20 in 52 primary UBC and find that all mutant tumors belong to the aggressive UBC phenotype (high grade non-muscle invasive and muscle invasive tumors) (P = 0.05). In a second series (n = 84), we assess ARID1A expression using immunohistochemistry, a surrogate for mutation analysis, and find that loss of expression increases with higher stage/grade, it is inversely associated with FGFR3 overexpression (P = 0.03) but it is not correlated with p53 overexpression (P = 0.30). We also analyzed the expression of cytokeratins in the same set of tumor and find, using unsupervised clustering, that tumors with ARID1A loss of expression are generally KRT5/6-low. In this patient series, loss of ARID1A expression is also associated with worse prognosis, likely reflecting the higher prevalence of losses found in tumors of higher stage and grade. The independent findings in these two sets of patients strongly support the notion that ARID1A inactivation is a key player in bladder carcinogenesis occurring predominantly in FGFR3 wild type tumors.This work was supported in part by grant Consolider ONCOBIO from Ministerio de Economía y Competitividad, Spain; grants 00/0745, PI051436, PI061614, G03/174 and Red Temática de Investigación Cooperativa en Cáncer (grant RD06/0020-RTICC) from Instituto de Salud Carlos III; Asociación Española Contra el Cáncer; and EU FP7 grant agreement numbers 201663 (UROMOL) and 201333 (DECANBIO). CBM is recipient of a La Caixa International PhD Fellowshi

Summary of mutations found in the <i>ARID1A</i> resequencing study.

<p>Non-synonymous mutations found at a frequency ≥10% that were confirmed by Sanger sequencing are shown here.</p>*<p>denotes a truncating mutation.</p

Characteristics of the patients from whom fresh tumor was used for <i>ARID1A</i> sequence analysis.

<p>Characteristics of the patients from whom fresh tumor was used for <i>ARID1A</i> sequence analysis.</p

Relationship between ARID1A and cell differentiation markers, as detected using immunohistochemistry in tumor tissue microarrays.

<p>UBC cases were classified in three categories: LG-NMIBC (TaG1 and TaG2 tumors), HG-NMIBC (TaG3 and T1G3 tumors), and MI (≥T2 tumors). Non-hierarchical clustering of IHC scores for ARID1A, FGFR3, KRT5/6, KRT14, and KRT20 was performed. IHC scores are shown in a green-red color code. Color bars below the dendogram include information about tumor stage and grade (tones of blue) and <i>FGFR3</i> mutational status (grey/black) when known. White squares indicate that information for that parameter is not available.</p