Variações alélicas e combinações KIR2DL4 e HLA-G em casais submetidos a tratamento de reprodução assistida

Orientadora : Profª Drª Maria da Graça BicalhoTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 29/10/2015Inclui referências : f.113-132Resumo: Os genes HLA codificam produtos proteicos que participam do reconhecimento de moléculas próprias e não próprias. Este sistema gênico codifica proteínas com propriedades imunológicas similares, mas estruturalmente diferentes, e classificadas em proteínas HLA de classe I, II e III. O gene HLA-G codifica uma proteína classe I não-clássica (Ib) que se encontra expressa principalmente nas células do trofoblasto e tem suma importância na imunotolerância da interface materno-fetal, tendo como importante receptor KIR2DL4 expresso nas células uNK. KIR2DL4 pertence ao grupo de genes KIR, e apresenta motivos e funções de inibição e ativação. Neste contexto, acredita-se que casais bem sucedidos na implantação do embrião e casais mal sucedidos nas técnicas de reprodução assistida (TRA) apresentariam variantes alélicas e genotípicas do gene KIR2DL4 e nos SNPs da região 3'URR de HLA-G associadas ao sucesso ou insucesso implantacionais. Portanto, o presente estudo investigou a influência de variantes alélicas de KIR2DL4 e combinações genotípicas KIR-HLA-G no sucesso da implantação do embrião em casais com necessidade do TRA e em respectivo grupo controle. O estudo foi subdividido em duas partes: na primeira parte, para investigar a diversidade do gene HLA-G, foram considerados 33 casais submetidos ao TRA (n=66) e 120 casais que conceberam naturalmente (grupo controle, n=240). Já na segunda parte, para avaliar a diversidade do gene KIR2DL4 e a combinação genotípica com HLA-G, amostras de 42 casais submetidos ao TRA (n=84), de 120 casais com concepção natural - controles (n=240) e de 35 mulheres grávidas (n=35) foram genotipadas. A genotipagem foi realizada com o auxílio da técnica de PCR; os alelos, genótipos e haplótipos foram comparados entre os grupos por meio do Teste Exato de Fisher realizado no programa GENEPOP; os Odds ratio (OR) foram calculados no BIOESTAT 5.0 com um intervalo de confiança de 95%; e as estimativas das frequências haplotípicas foram calculadas no ARLEQUIN. Observou-se que mesmo com a estratificação dos grupos por gênero e/ou sucesso/insucesso no TRA, apenas o haplótipo HLA-G*010101b/HLA-G*01:01:01 diferiu significativamente após correção de Bonferroni: a frequência deste haplótipo estava mais elevada no grupo controle que no grupo de casais submetidos ao TRA. O alelo KIR2DL4*00102 foi significativamente mais frequente em casais controle e em casais com sucesso no TRA; o alelo KIR2DL4*011 foi observado com maior frequência em casais caso; e o genótipo KIR2DL4*00102 /KIR2DL4*00801 foi mais frequente no grupo controle. Na comparação de haplótipos, o haplótipo 3 (HLA - G*010101a/HLA - G*01:01:01/KIR2DL4*00102) esteve significativamente mais frequente em casais controles, já o haplótipo 4 (HLA-G*010102a/HLA-G*01:01:02/KIR2DL4*00102) apresentou maior frequência em homens controle, enquanto o haplótipo 5 (HLA-G*010102a/HLA-G*01:01:02/KIR2DL4*00501) foi mais frequente em mulheres com sucesso no TRA. Entre os genótipos do casal, o genótipo materno HLA-G*01:01/HLA-G*01:03 e o paterno HLA-G*01:01/HLA-G*01:01 apresentaram, significativamente, maior frequência nos casais controle. No genótipo F1 observou-se maior frequência de HLA-G*01:01/HLA- G*01:01 em filhos de casais controle, já o genótipo HLA- G*01:01/HLA-G*01:05N em filhos de casais caso. Este conjunto de resultados sugere a influência da variabilidade dos genes KIR2DL4 e HLA-G na fertilidade do casal e também no sucesso implantacional observado após TRA. Palavras-chave: Interface materno-fetal, proteína HLA-G, receptor KIR2DL4, reprodução humana, susceptibilidade haplotípicaAbstract: HLA genes encode protein products that take part in the recognition of proper and non-proper molecules. This gene system encodes proteins with similar immunological properties, but structurally different, and classified in HLA proteins of class I, II and III. HLA-G gene encodes a non-classical class I protein (Ib) mainly expressed in trophoblastic cells, and which present a great importance in immune tolerance of the fetus-maternal interface, having as an important receptor KIR2DL4 expressed in the uNK cells. KIR2DL4 belongs to a group of KIR genes, and has inhibition and activation motifs and functions. In this context, we believe that successful couples in embryo implantation and unsuccessful couples in assisted reproduction techniques (ART) would show allele and genotype variants of KIR2DL4 gene and SNPs in the 3'URR region of HLA-G associated with the successful or unsuccessful implantation. Thus, the present study investigated the influence of allele variants in KIR2DL4 and KIR-HLA-G genotype combinations in the success of embryo implantation in couples who needed ART and in the respective control group. The study was subdivided in two parts: in the first one, to investigate the diversity of HLA-G gene, we considered 33 couples submitted to ART (n=66) and 120 couples who conceived naturally (control group, n-240). In the second part, to evaluate the diversity of KIR2DL4 gene and the genotype combination with HLA-G, samples of 42 couples submitted to ART (n=84), of 120 couples who conceived naturally - controls (n=240) and 35 pregnant women (n=35) were genotyped. Genotyping was performed with the aid of PCR technique; alleles, genotypes and haplotypes were compared between groups by the Fisher Exact Test performed in the program GENEPOP; Odds ratio (OR) were calculated in BIOESTAT 5.0 with a confidence interval of 95%; and the estimates of haplotype frequencies were calculated in ARLEQUIN. We observed that even after group stratification by gender and/or successful/unsuccessful ART, only the HLA-G*010101b/HLA-G*01:01:01 haplotype significantly differed after Bonferroni correction: the frequency of this haplotype was higher in the control group than in the group of couples submitted to ART. The allele KIR2DL4*00102 was significantly more frequent in control couples and in successful couples in ART; the allele KIR2DL4*011 was more frequent in case couples; and the genotype KIR2DL4*00102 /KIR2DL4*00801 was more frequent in the control group. In haplotypes comparison, the haplotype #3 (HLA - G*010101a/HLA - G*01:01:01/KIR2DL4*00102) was significantly more frequent in control couples, the haplotype #4 (HLA-G*010102a/HLA-G*01:01:02/KIR2DL4*00102) presented a higher frequency in control men, while the haplotype #5 (HLA-G*010102a/HLA-G*01:01:02/KIR2DL4*00501) was more frequent in successful women in ART. Among the couples' genotypes, the maternal genotype HLA-G*01:01/HLA-G*01:03 and the paternal genotype HLA-G*01:01/HLA-G*01:01 presented, significantly, higher frequency in control couples. In F1 genotype, we observed higher frequency of HLA-G*01:01/HLA- G*01:01 in children of the control couples, and the genotype HLA- G*01:01/HLA-G*01:05N in children of the case group couples. This set of results suggests the influence in the variability of KIR2DL4 and HLA-G genes in the couple fertility as well as in implantation success observed after ART

SNPs na Região Promotora 5'URR e INS/DEL de 14pb no EXON 8 do GENE HLA-G e sua influência na implantação do embrião em casais submetidos a tratamento de reprodução assistida

Sem Resum

Variações alélicas e combinações KIR2DL4 e HLA-G em casais submetidos a tratamento de reprodução assistida

Orientadora : Profª Drª Maria da Graça BicalhoTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 29/10/2015Inclui referências : f.113-132Resumo: Os genes HLA codificam produtos proteicos que participam do reconhecimento de moléculas próprias e não próprias. Este sistema gênico codifica proteínas com propriedades imunológicas similares, mas estruturalmente diferentes, e classificadas em proteínas HLA de classe I, II e III. O gene HLA-G codifica uma proteína classe I não-clássica (Ib) que se encontra expressa principalmente nas células do trofoblasto e tem suma importância na imunotolerância da interface materno-fetal, tendo como importante receptor KIR2DL4 expresso nas células uNK. KIR2DL4 pertence ao grupo de genes KIR, e apresenta motivos e funções de inibição e ativação. Neste contexto, acredita-se que casais bem sucedidos na implantação do embrião e casais mal sucedidos nas técnicas de reprodução assistida (TRA) apresentariam variantes alélicas e genotípicas do gene KIR2DL4 e nos SNPs da região 3'URR de HLA-G associadas ao sucesso ou insucesso implantacionais. Portanto, o presente estudo investigou a influência de variantes alélicas de KIR2DL4 e combinações genotípicas KIR-HLA-G no sucesso da implantação do embrião em casais com necessidade do TRA e em respectivo grupo controle. O estudo foi subdividido em duas partes: na primeira parte, para investigar a diversidade do gene HLA-G, foram considerados 33 casais submetidos ao TRA (n=66) e 120 casais que conceberam naturalmente (grupo controle, n=240). Já na segunda parte, para avaliar a diversidade do gene KIR2DL4 e a combinação genotípica com HLA-G, amostras de 42 casais submetidos ao TRA (n=84), de 120 casais com concepção natural - controles (n=240) e de 35 mulheres grávidas (n=35) foram genotipadas. A genotipagem foi realizada com o auxílio da técnica de PCR; os alelos, genótipos e haplótipos foram comparados entre os grupos por meio do Teste Exato de Fisher realizado no programa GENEPOP; os Odds ratio (OR) foram calculados no BIOESTAT 5.0 com um intervalo de confiança de 95%; e as estimativas das frequências haplotípicas foram calculadas no ARLEQUIN. Observou-se que mesmo com a estratificação dos grupos por gênero e/ou sucesso/insucesso no TRA, apenas o haplótipo HLA-G*010101b/HLA-G*01:01:01 diferiu significativamente após correção de Bonferroni: a frequência deste haplótipo estava mais elevada no grupo controle que no grupo de casais submetidos ao TRA. O alelo KIR2DL4*00102 foi significativamente mais frequente em casais controle e em casais com sucesso no TRA; o alelo KIR2DL4*011 foi observado com maior frequência em casais caso; e o genótipo KIR2DL4*00102 /KIR2DL4*00801 foi mais frequente no grupo controle. Na comparação de haplótipos, o haplótipo 3 (HLA - G*010101a/HLA - G*01:01:01/KIR2DL4*00102) esteve significativamente mais frequente em casais controles, já o haplótipo 4 (HLA-G*010102a/HLA-G*01:01:02/KIR2DL4*00102) apresentou maior frequência em homens controle, enquanto o haplótipo 5 (HLA-G*010102a/HLA-G*01:01:02/KIR2DL4*00501) foi mais frequente em mulheres com sucesso no TRA. Entre os genótipos do casal, o genótipo materno HLA-G*01:01/HLA-G*01:03 e o paterno HLA-G*01:01/HLA-G*01:01 apresentaram, significativamente, maior frequência nos casais controle. No genótipo F1 observou-se maior frequência de HLA-G*01:01/HLA- G*01:01 em filhos de casais controle, já o genótipo HLA- G*01:01/HLA-G*01:05N em filhos de casais caso. Este conjunto de resultados sugere a influência da variabilidade dos genes KIR2DL4 e HLA-G na fertilidade do casal e também no sucesso implantacional observado após TRA. Palavras-chave: Interface materno-fetal, proteína HLA-G, receptor KIR2DL4, reprodução humana, susceptibilidade haplotípicaAbstract: HLA genes encode protein products that take part in the recognition of proper and non-proper molecules. This gene system encodes proteins with similar immunological properties, but structurally different, and classified in HLA proteins of class I, II and III. HLA-G gene encodes a non-classical class I protein (Ib) mainly expressed in trophoblastic cells, and which present a great importance in immune tolerance of the fetus-maternal interface, having as an important receptor KIR2DL4 expressed in the uNK cells. KIR2DL4 belongs to a group of KIR genes, and has inhibition and activation motifs and functions. In this context, we believe that successful couples in embryo implantation and unsuccessful couples in assisted reproduction techniques (ART) would show allele and genotype variants of KIR2DL4 gene and SNPs in the 3'URR region of HLA-G associated with the successful or unsuccessful implantation. Thus, the present study investigated the influence of allele variants in KIR2DL4 and KIR-HLA-G genotype combinations in the success of embryo implantation in couples who needed ART and in the respective control group. The study was subdivided in two parts: in the first one, to investigate the diversity of HLA-G gene, we considered 33 couples submitted to ART (n=66) and 120 couples who conceived naturally (control group, n-240). In the second part, to evaluate the diversity of KIR2DL4 gene and the genotype combination with HLA-G, samples of 42 couples submitted to ART (n=84), of 120 couples who conceived naturally - controls (n=240) and 35 pregnant women (n=35) were genotyped. Genotyping was performed with the aid of PCR technique; alleles, genotypes and haplotypes were compared between groups by the Fisher Exact Test performed in the program GENEPOP; Odds ratio (OR) were calculated in BIOESTAT 5.0 with a confidence interval of 95%; and the estimates of haplotype frequencies were calculated in ARLEQUIN. We observed that even after group stratification by gender and/or successful/unsuccessful ART, only the HLA-G*010101b/HLA-G*01:01:01 haplotype significantly differed after Bonferroni correction: the frequency of this haplotype was higher in the control group than in the group of couples submitted to ART. The allele KIR2DL4*00102 was significantly more frequent in control couples and in successful couples in ART; the allele KIR2DL4*011 was more frequent in case couples; and the genotype KIR2DL4*00102 /KIR2DL4*00801 was more frequent in the control group. In haplotypes comparison, the haplotype #3 (HLA - G*010101a/HLA - G*01:01:01/KIR2DL4*00102) was significantly more frequent in control couples, the haplotype #4 (HLA-G*010102a/HLA-G*01:01:02/KIR2DL4*00102) presented a higher frequency in control men, while the haplotype #5 (HLA-G*010102a/HLA-G*01:01:02/KIR2DL4*00501) was more frequent in successful women in ART. Among the couples' genotypes, the maternal genotype HLA-G*01:01/HLA-G*01:03 and the paternal genotype HLA-G*01:01/HLA-G*01:01 presented, significantly, higher frequency in control couples. In F1 genotype, we observed higher frequency of HLA-G*01:01/HLA- G*01:01 in children of the control couples, and the genotype HLA- G*01:01/HLA-G*01:05N in children of the case group couples. This set of results suggests the influence in the variability of KIR2DL4 and HLA-G genes in the couple fertility as well as in implantation success observed after ART

SNPs na Região Promotora 5'URR e INS/DEL de 14pb no EXON 8 do GENE HLA-G e sua influência na implantação do embrião em casais submetidos a tratamento de reprodução assistida

Sem Resum

Micronucleus assay : a biomarker of genotoxic damage in exfoliated oral mucosa cells

O objetivo deste trabalho é fazer uma revisão de literatura a respeito do ensaio dos micronúcleos, explicando o seu significado e sua aplicação em células esfoliadas da mucosa bucal. Micronúcleo (MN) é um núcleo acessório, originado a partir de fragmentos de cromossomo ou de cromossomos inteiros que não são incluídos no núcleo principal durante a mitose. MNs surgem por alterações genéticas espontâneas ou são induzidos por agentes genotóxicos. A análise dos micronúcleos tem sido utilizada como uma ferramenta importante de biomonitoramento de populações. Estudos demonstram que consumidores de fumo e álcool, assim como grupos expostos a determinados agentes em função de sua ocupação ou estilo de vida apresentam um elevado número de MNs nas células bucais esfoliadas.The aim of this study is to summarise the literature on micronucleus assay, explaining its meaning and its application in exfoliated oral mucosal cells. Micronuclei (MN) is an extra nuclei, originated from chromosome fragments or whole chromosomes that are not included in the main nuclei during mitosis. MNs arise from spontaneous genetic damage or are induced by genotoxic agents. MN analysis has been used as an important tool to biomonitore populations exposed to life-style agents. Studies demonstrate that tobacco and alcohol users, as well as occupationally exposed groups present increased number of MNs in exfoliated oral mucosa cells. Despite the fact that the role of MN frequency has not yet been fully understood, the MNs assay is considered to be an effective biomarker of oral squamous cell carcinoma risk factors effects

Comparação de marcadores plasmáticos de dano muscular após a realização de exercício de força com e sem oclusão vascular em homens fisicamente ativos e saudáveis

O objetivo principal do treinamento resistido com pesos é promover a quebra da homeostase do organismo. Desde que dentro dos limites fisiológicos, o organismo gera o fenômeno da supercompensação, alcançando um novo nível de aptidão física. Diversas técnicas são usadas para alcançar o condicionamento físico, e a oclusão vascular (kaatsu training) surge como uma opção permeada por benefícios para sedentários e portadores de patologias, mas ainda com poucas evidências para a população treinada. O objetivo desse trabalho foi comparar a magnitude de dano muscular no exercício resistido com e sem oclusão vascular em indivíduos treinados. Participaram 7 homens saudáveis e treinados. Foi utilizada a rosca bíceps no banco scotch, com 5 séries de repetições máximas com cargas de 40% de 1RM com a oclusão e 80% sem a oclusão. Foram coletadas amostras de sangue antes, imediatamente após, 24h e 48h após o exercício, com mensuração da CK, TGO e TGP. Não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas na CK em nenhum dos momentos analisados, em ambas as técnicas. Com a TGO foram encontradas diferenças significaticas em ambas, imediatamente após, sem alterações nos demais momentos. A TGP teve o mesmo comportamento apenas no exercício sem oclusão. O nível de adaptação, o volume e o tipo de exercícios pode ser um fator de interferência quanto a comparação dos resultados. Conclui-se que em indivíduos treinados, exercícios de baixa itensidade com a oclusão vascular e de alta intensidade sem essa técica, causam magitude de dano muscular semelhante quando mensurado por meio de marcadores plasmáticos. ABSTRACTComparison of plasma markers of muscle damage after the exercise of strength with and without vascular occlusion in physically active and healthy menThe main goal of resistance training is to promote the breakdown of the body's homeostasis. Since within the physiological limits, the organism generates the phenomenon of supercompensation, reaching a new level of physical fitness. Several techniques are used to achieve physical conditioning, and vascular occlusion (kaatsu training) emerges as an option permeated by benefits for sedentary and pathological patients, but still with little evidence for the trained population. The objective of this study was to compare the magnitude of muscle damage in resistance exercise with and without vascular occlusion in trained individuals. 7 healthy and trained men participated. The biceps curl in the scotch bench was used, with 5 sets of maximal repetitions with loads of 40% of 1RM with occlusion and 80% without occlusion. Blood samples were collected before, immediately after, 24h and 48h after exercise, with measurement of CK, TGO and TGP. No statistically significant differences were found in CK in any of the analyzed moments, in both techniques. With the TGO, significant differences were found in both, immediately after, without changes in the other moments. TGP had the same behavior only in the non-occlusion exercise. The level of adaptation, the volume and the type of exercises can be an interference factor when comparing the results. It is concluded that in trained individuals, low intensity exercises with vascular occlusion and high intensity without this technique cause a similar magnitude of muscle damage when measured by plasmatic markers

Micronucleus assay : a biomarker of genotoxic damage in exfoliated oral mucosa cells

O objetivo deste trabalho é fazer uma revisão de literatura a respeito do ensaio dos micronúcleos, explicando o seu significado e sua aplicação em células esfoliadas da mucosa bucal. Micronúcleo (MN) é um núcleo acessório, originado a partir de fragmentos de cromossomo ou de cromossomos inteiros que não são incluídos no núcleo principal durante a mitose. MNs surgem por alterações genéticas espontâneas ou são induzidos por agentes genotóxicos. A análise dos micronúcleos tem sido utilizada como uma ferramenta importante de biomonitoramento de populações. Estudos demonstram que consumidores de fumo e álcool, assim como grupos expostos a determinados agentes em função de sua ocupação ou estilo de vida apresentam um elevado número de MNs nas células bucais esfoliadas.The aim of this study is to summarise the literature on micronucleus assay, explaining its meaning and its application in exfoliated oral mucosal cells. Micronuclei (MN) is an extra nuclei, originated from chromosome fragments or whole chromosomes that are not included in the main nuclei during mitosis. MNs arise from spontaneous genetic damage or are induced by genotoxic agents. MN analysis has been used as an important tool to biomonitore populations exposed to life-style agents. Studies demonstrate that tobacco and alcohol users, as well as occupationally exposed groups present increased number of MNs in exfoliated oral mucosa cells. Despite the fact that the role of MN frequency has not yet been fully understood, the MNs assay is considered to be an effective biomarker of oral squamous cell carcinoma risk factors effects

Teste dos Micronúcleos – Um Biomarcador de Dano Genotóxico em Células Descamadas da Mucosa Bucal

O objetivo deste trabalho é fazer uma revisão de literatura a respeito do ensaio dos micronúcleos, explicando o seu significado e sua aplicação em células esfoliadas da mucosa bucal. Micronúcleo (MN) é um núcleo acessório, originado a partir de fragmentos de cromossomo ou de cromossomos inteiros que não são incluídos no núcleo principal durante a mitose. MNs surgem por alterações genéticas espontâneas ou são induzidos por agentes genotóxicos. A análise dos micronúcleos tem sido utilizada como uma ferramenta importante de biomonitoramento de populações. Estudos demonstram que consumidores de fumo e álcool, assim como grupos expostos a determinados agentes em função de sua ocupação ou estilo de vida apresentam um elevado número de MNs nas células bucais esfoliadas