Characterization of RNA Helicase CshA and Its Role in Protecting mRNAs and Small RNAs of Staphylococcus aureus Strain Newman

The toxin MazFsa in Staphylococcus aureus is a sequence-specific endoribonuclease that cleaves the majority of the mRNAs in vivo but spares many essential mRNAs (e.g., secY mRNA) and, surprisingly, an mRNA encoding a regulatory protein (i.e., sarA mRNA). We hypothesize that some mRNAs may be protected by RNA-binding protein(s) from degradation by MazFsa. Using heparin-Sepharose-enriched fractions that hybridized to sarA mRNA on Northwestern blots, we identified among multiple proteins the DEAD box RNA helicase CshA (NWMN_1985 or SA1885) by mass spectroscopy. Purified CshA exhibits typical RNA helicase activities, as exemplified by RNA-dependent ATPase activity and unwinding of the DNA-RNA duplex. A severe growth defect was observed in the cshA mutant compared with the parent when grown at 25°C but not at 37°C. Activation of MazFsa in the cshA mutant resulted in lower CFU per milliliter accompanied by a precipitous drop in viability (∼40%) compared to those of the parent and complemented strains. NanoString analysis reveals diminished expression of a small number of mRNAs and 22 small RNAs (sRNAs) in the cshA mutant versus the parent upon MazFsa induction, thus implying protection of these RNAs by CshA. In the case of the sRNA teg049 within the sarA locus, we showed that the protective effect was likely due to transcript stability as revealed by reduced half-life in the cshA mutant versus the parent. Accordingly, CshA likely stabilizes selective mRNAs and sRNAs in vivo and as a result enhances S. aureus survival upon MazFsa induction during stress

A type IV modification-dependent restriction enzyme SauUSI from Staphylococcus aureus subsp. aureus USA300

A gene encoding a putative DNA helicase from Staphylococcus aureus USA300 was cloned and expressed in Escherichia coli. The protein was purified to over 90% purity by chromatography. The purified enzyme, SauUSI, predominantly cleaves modified DNA containing 5mC and 5-hydroxymethylcytosine. Cleavage of 5mC-modified plasmids indicated that the sites S5mCNGS (S = C or G) are preferentially digested. The endonuclease activity requires the presence of adenosine triphosphate (ATP) or dATP whereas the non-hydrolyzable γ-S-ATP does not support activity. SauUSI activity was inhibited by ethylenediaminetetraacetic acid. It is most active in Mg++ buffers. No companion methylase gene was found near the SauUSI restriction gene. The absence of a cognate methylase and cleavage of modified DNA indicate that SauUSI belongs to type IV restriction endonucleases, a group that includes EcoK McrBC and Mrr. SauUSI belongs to a family of highly similar homologs found in other sequenced S. aureus, S. epidermidis and S. carnosus genomes. More distant SauUSI orthologs can be found in over 150 sequenced bacterial/archaea genomes. Finally, we demonstrated the biological function of the type IV REase in restricting 5mC-modified plasmid DNA by transformation into clinical S. aureus strain SA564, and in restricting phage λ infection when the endonuclease is expressed in E. col

Small RNA teg49 Is Derived from a sarA Transcript and Regulates Virulence Genes Independent of SarA in Staphylococcus aureus

Expression of virulence factors in Staphylococcus aureus is regulated by a wide range of transcriptional regulators, including proteins and small RNAs (sRNAs), at the level of transcription and/or translation. The sarA locus consists of three overlapping transcripts generated from three distinct promoters, all containing the sarA open reading frame (ORF). The 5= untranslated regions (UTRs) of these transcripts contain three separate regions 711, 409, and 146 nucleotides (nt) upstream of the sarA translation start, the functions of which remain unknown. Re- cent transcriptome-sequencing (RNA-Seq) analysis and subsequent characterization indicated that two sRNAs, teg49 and teg48, are processed and likely produced from the sarA P3 and sarA P1 transcripts of the sarA locus, respectively. In this report, we utilized a variety of sarA promoter mutants and cshA and rnc mutants to ascertain the contributions of these factors to the generation of teg49. We also defined the transcriptional regulon of teg49, including virulence genes not regulated by SarA. Phenotypically, teg49 did not impact biofilm formation or affect overall SarA expres- sion significantly. Comparative analyses of RNA-Seq data between the wild-type, teg49 mutant, and sarA mutant strains indicated that 133 genes are significantly upregulated while 97 are downregulated in a teg49 deletion mutant in a sarA- independent manner. An abscess model of skin infection indicated that the teg49 mutant exhibited a reduced bacterial load compared to the wild-type S. aureus. Overall, these results suggest that teg49 sRNA has a regulatory role in target gene regulation independent of SarA. The exact mechanism of this regulation is yet to be dissected

Plasmid-mediated quinolone resistance in Aeromonas allosaccharophila recovered from a Swiss lake

Objectives To search for plasmid-mediated qnr genes among waterborne environmental Aeromonas spp. recovered from Switzerland. Methods Isolates presenting MICs of nalidixic acid or ciprofloxacin ≥1 mg/L were screened for qnr genes by a multiplex PCR approach followed by sequencing. Plasmids were transferred by transformation, and further analysis of the genetic structures surrounding the qnrS2 gene was carried out by PCR and sequencing. Results A qnrS2 gene was identified from a single Aeromonas allosaccharophila isolate (Lugano lake, Lugano), as part of a mobile insertion cassette located on a broad host range IncU-type plasmid. This plasmid co-harboured a class 1 integron containing the aac(6′)-Ib-cr, blaOXA-1, catB3 and arr-3 gene cassettes. Conclusions These findings strengthen further the role of Aeromonas spp. as a reservoir of antimicrobial resistance determinants in the environmen

Neurodevelopmental Correlates of Brain Magnetic Resonance Imaging Abnormalities in Extremely Low-birth-weight Infants

Objective: To evaluate the relationship between impaired brain growth and structural brain abnormalities at term-equivalent age (TEA) and neurodevelopment in extremely low-birth-weight (ELBW) infants over the first 2 years. Methods: ELBW infants born from 2009 through 2018 and undergoing brain magnetic resonance imaging (MRI) at TEA were enrolled in this retrospective cohort study. MRI scans were reviewed using a validated quali-quantitative score, including several white and gray matter items. Neurodevelopment was assessed at 6, 12, 18, and 24 months using the Griffiths scales. The independent associations between MRI subscores and the trajectories of general and specific neurodevelopmental functions were analyzed by generalized estimating equations. Results: One hundred-nine ELBW infants were included. White matter volume reduction and delayed myelination were associated with worse general development (b = -2.33, P = .040; b = -6.88, P = .049 respectively), social skills (b = -3.13, P = .019; b = -4.79, P = .049), and eye-hand coordination (b = -3.48, P = .009; b = -7.21, P = .045). Cystic white matter lesions were associated with poorer motor outcomes (b = -4.99, P = .027), while white matter signal abnormalities and corpus callosum thinning were associated with worse nonverbal cognitive performances (b = -6.42, P = .010; b = -6.72, P = .021, respectively). Deep gray matter volume reduction correlated with worse developmental trajectories. Conclusions: Distinctive MRI abnormalities correlate with specific later developmental skills. This finding may suggest that TEA brain MRI may assist with neurodevelopmental prediction, counseling of families, and development of targeted supportive interventions to improve neurodevelopment in ELBW neonates

RsaI, a multifaceted regulatory RNA, modulates the metabolism of the opportunistic pathogen Staphylococcus aureus RsaI, un ARN régulateur aux multiples facettes, module le métabolisme du pathogène opportuniste Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus est une bactérie commensale retrouvée chez environ 30 % des individus sains dont elle colonise la peau et la muqueuse nasale. Cependant, c’est également une bactérie pathogène opportuniste responsable d’infections diverses telles que orgelet, ostéomyélite, endocardite, ou encore septicémie en envahissant un grand nombre de tissus et d’organes. Cette bactérie est capable de s’adapter à des conditions hostiles et variées, telles que carence nutritive et stress osmotique, oxydant, ou thermique, ainsi qu’à la réponse immunitaire de l’hôte, car elle produit une grande diversité de facteurs de virulence. La synthèse de ces facteurs est finement régulée par des protéines et des ARN régulateurs majoritairement non codants, souvent désignés par l’abréviation sARN (dérivée de l’anglais, small RNA). Les facteurs de transcription et les systèmes à deux composants contrôlent l’expression des gènes impliqués non seulement dans le métabolisme, mais aussi dans la réponse au stress et la virulence [1]. Par exemple, la protéine du contrôle catabolique (carbon catabolite control protein A, CcpA) a un rôle essentiel dans le choix de la source carbonée en régulant le métabolisme central de la bactérie ainsi que la virulence [2, 3]. CcpA se fixe à une séquence promotrice spécifique appelée cre (catabolite-responsive element), qui est très conservée chez les bactéries à Gram positif [2]. Quant aux sARN, ils interagissent principalement avec leurs ARN messagers (ARNm) cibles. L’hybridation peut conduire à la stabilisation/déstabilisation de l’ARNm ou à l’activation/répression de sa traduction [4]. Nous avons montré que la transcription du sARN RsaI (RNA Staphylococcus aureus I) est réprimée par CcpA en présence de glucose [5]. L’induction de la synthèse de RsaI signale que la concentration en glucose diminue dans le milieu extracellulaire et que la croissance des bactéries est ralentie. En interagissant avec ses ARNm cibles ou d’autres sARN, il permet à la population bactérienne de modifier son métabolisme lorsque la source carbonée primaire est consommée

Rôle des résidus d'antibiotiques dans l'environnement hydrique sur la sélection et la diffusion de bactéries résistantes des genres "Aeromonas", "Acinetobacter" et "Legionella"

Les résidus d'antibiotiques et les bactéries résistantes sont déversées en quantités variées dans l'environnement, en conséquence d'une utilisation massive et souvent indiscriminée de ces substances dans les domaines médicaux, vétérinaires et en agrochimie. Les eaux de surface sont le réceptacle majeur de ces polluants et représentent également les sources d'eau directement ou indirectement utilisées pour la consommation humaine et animale. L'objectif de ce travail de thèse, effectué dans le cadre du Programme National de Recherche 49 "Antibiotic Resistance", a été d'évaluer, à l'aide d'outils empruntés à la bactériologie classique et à la microbiologie moléculaire, le rôle des résidus d'antibiotiques présents dans l'environnement hydrique sur l'émergence et / ou la persistance de bactéries résistantes. La recherche a été concentrée sur trois genres bactériens pathogènes pour l'homme et l'animal, à savoir les Aeromonas, les Acinetobacter et les Legionella et trois familles d'antibiotiques, les bêta-lactames, les quinolones / fluoroquinolones et les macrolides, abondamment utilisées en médecine humaine. L'analyse phénotypique de la résistance dans les divers milieux hydriques a mis en évidence la présence de souches résistantes dans les eaux les plus contaminées. Des Aeromonas résistants aux quatre générations de céphalosporines ont pu être isolés des eaux usées des hôpitaux et des stations d'épuration, tandis que les souches d'origine clinique se sont avérées beaucoup plus sensibles. Au contraire, les Acinetobacter de l'environnement hydrique sont apparus moins résistants que ceux d'origine humaine. Pour les Legionella, les valeurs des CMI différaient en fonction du type génétique de la souche (Sequence-based Type) et non de l'origine. Une corrélation statistique significative entre concentrations de ciprofloxacine et souches résistantes isolées a pu être mise en évidence dans les eaux usées des hôpitaux. L'effet éventuel de faibles concentrations hydriques de ceftriaxone, de ciprofloxacine et d'érythromycine sur la sélection et l'induction d'Aeromonas, d'Acinetobacter et de Legionella résistants a été étudié in vitro et in situ, ce dernier, par l'utilisation d'un bio réacteur reproduisant la phase biologique d'épuration des eaux (boues activées). Dans certains cas, ces faibles concentrations d'inducteurs ont pu modifier, in vitro, le profil de résistance de souches d'Aeromonas et d'Acinetobacter. Dans d'autres cas, des concentrations supérieures d'antibiotiques ont été nécessaires pour induire une résistance. Les nouveaux profils induits restent stables dans le temps. Par la technique d'électrophorèse sur gel en gradient de dénaturation (DGGE) et par l'utilisation de sondes moléculaires fluorescente (FISH), les effets qualitatifs et quantitatifs des résidus d'antibiotiques ajoutés dans le bio réacteur sur les trois populations considérées et sur la communauté microbienne totale présentes dans les boues activées ont pu être évalués. Enfin, l'étude de la diffusion des intégrons de classe 1 chez les souches d'Aeromonas et d'Acinetobacter provenant des divers environnements hydriques a été effectuée et mise en relation avec leur lieux d'isolement. Certains gènes de résistance ont pu être déterminés par séquençage

Public Procurement and Labour Rights:Towards Coherence in International Instruments of Procurement Regulation

This book investigates patterns of fragmentation and coherence in the international regulatory architecture of public procurement. In the context of the major international instruments of procurement regulation, the book studies the achievement of social and labour policies, the most controversial and problematic instrumental uses of public procurement practices. This work offers an innovative comparative approach, discussing the ways in which the different international instruments-namely the EU Procurement Directives, the WTO Agreement on Government Procurement, the UNCITRAL Model Law and the World Bank's Procurement Framework-are able to implement labour and social purposes and, at the same time, ensure a regulatory balance with the principles of efficiency and non-discrimination. Scholarly, rigorous and timely, this will be important reading for international trade lawyers and procurement practitioners