20 research outputs found
In vitro maturation of canine oocyte
Compared to other mammals, the canine oocyte offers a very unusual model of meiosis. Its maturation
in vitro, studied only over the past ten years, is still poorly controlled: low rate of metaphase II
(10 to 20% vs. over 90% in cattle), and high rate of degeneration in cultures (20 to 60%) despite attempts
to improve culture media. However, in dogs as well as in canidae threatened by extinction, in vitro
maturation is a key step for reproductive biotechnologies, such as in vitro fertilization and embryo production.
It is therefore urgent to improve our understanding of the canine oocyte to improve maturation
rates. We initiated studies on oocyte maturation in bitches. We examined the role of cAMP in
the resumption of meiosis in vitro in bitches, using substances which reduce (Rp-cAMP) or increase
(dbcAMP and forskolin) its level inside the oocyte. We also used denuded oocytes to prevent any cAMP
supply from the granulosa cells. With this model, we showed that cAMP might play a role in maintaining
meiosis, and that the resumption of meiosis may also be controlled by another pathway, possibly
involving calcium. Another of our research projects explores changes in the oocyte ultrastructure
during in vivo and in vitro maturation. Transmission electron microscopy may provide precise information
on possible cytoplasmic anomalies induced by maturation.
This fundamental work will eventually help us improve in vitro maturation of canine oocytes.L'ovocyte de chienne constitue
un modèle de méiose très particulier parmi les mammifères. Sa maturation in vitro, étudiée
depuis une dizaine d'années seulement, reste très mal maîtrisée : faible taux de métaphase
II (10 à 20 % contre plus de 90 % chez les bovins) et fort taux de dégénérescence en culture
(20 à 60 %) malgré les essais d'amélioration des milieux de culture. Or la maturation in
vitro est une étape indispensable pour avoir accès, tant chez le chien que chez les Canidés
en voie de disparition, aux biotechnologies de la reproduction (fécondation et production
d'embryons in vitro notamment). Il est indispensable de mieux comprendre la biologie de
l'ovocyte chez la chienne pour améliorer les taux de maturation. Nous nous sommes
intéressées, en premier lieu, au rôle de l'AMPc dans la reprise de la méiose in vitro. Nous
avons modulé la concentration intraovocytaire d'AMPc en soumettant les ovocytes à des
molécules qui la diminuent (Rp-AMPc) ou l'augmentent (dbAMPc et forskoline), ou en dénudant
l'ovocyte pour arrêter tout apport par les cellules du cumulus. Nous avons ainsi montré que
l'AMPc jouerait un rôle dans la poursuite de la méiose dont la reprise serait également
contrôlée par une autre voie, peut-être calcique. En parallèle, nous explorons l'évolution
de l'ultrastructure de l'ovocyte au cours de la maturation in vivo et in vitro, pour
détecter les anomalies cytoplasmiques qui peuvent apparaître au cours de la
maturation
Canine oocyte maturation, fertilization and early embryonic development
Canine reproduction has several distinctive features. Firstly, folliculogenesis is unusual as numerous
ovarian follicles contain several oocytes (polyovular follicles). Secondly, unlike in other mammalian species,
oocytes at the time of ovulation are still at an immature stage (prophase I, germinal vesicle stage),
and complete their maturation in the oviduct. This phenomenon is not easy to observe because the
canine oocyte has a high lipid content and its DNA is difficult to visualise. Fertilization of immature
oocytes has been observed in vitro, however in vivo, fertilization occurs in oocytes at the metaphase
II stage, approximately 50 hours after ovulation. The 2-pronuclei stage is reached 72-124 hours after
ovulation, and 2-cell embryos are present 96-168 hours after ovulation. The oviductal phase is long
and embryos enter the uterine cavity at the morula or early blastocyst stage 10-12 days following ovulation.
Implantation occurs 18 to 21 days after ovulation.
In spite of all these specificities, studies on canine reproduction were so far mainly clinical. However, current
research is focusing on fundamental knowledge, namely the mechanisms controlling oocyte
maturation in vivo, in the hope to improve the yield of oocyte maturation in vitro, which is still very low.Plusieurs aspects de la
reproduction sont particuliers à l'espèce canine. D'une part, la folliculogenèse est
singulière car chez la chienne, de nombreux follicules ovariens contiennent plusieurs
ovocytes (follicules poly-ovocytaires). D'autre part, contrairement à ce qui est observé
chez les autres femelles de mammifères, au moment de l'ovulation, l'ovocyte est encore à un
stade immature (prophase I, stade vésicule germinative ou VG) et la maturation ovocytaire se
poursuit ensuite dans l'oviducte. L'observation de ce phénomène est rendue complexe par le
fait que l'ovocyte canin est riche en lipides et que son ADN est donc difficile à
visualiser. In vitro, la fécondation d'ovocytes immatures a été observée mais in vivo, elle
a lieu au moment où les ovocytes ont atteint le stade métaphase II, environ 50 h après
l'ovulation. Les premiers pronoyaux sont présents 72 à 124 h après l'ovulation et les
premiers embryons au stade 2-cellules sont observés 96 à 168 h après l'ovulation. La période
de transit dans l'oviducte est longue et les embryons n'atteignent l'utérus qu'au stade
morula ou jeune blastocyste, 10 à 12 jours après l'ovulation et l'implantation a ensuite
lieu vers 18 à 21 jours. Globalement, malgré toutes ces particularités, les recherches sur
la reproduction dans l'espèce canine étaient jusqu'alors essentiellement cliniques. Les
travaux visent maintenant à améliorer les connaissances fondamentales, notamment concernant
les mécanismes contrôlant la maturation ovocytaire in vivo, pour pouvoir ensuite améliorer
les rendements de la maturation in vitro, actuellement très faibles
Embryo biotechnologies in dogs
There is very little data available on the specificities of oocyte and embryo biology in bitches. The main
difference with other mammals is the time of meiosis resumption: it does not occur before ovulation,
but in the oviduct 48 to 60 hours later. The factors responsible for this delay are not known, which may
explain why current in vitro maturation rates are so low (10 to 30%). Oocyte harvesting is also a major
limiting factor, as there is no effective protocol for the induction of cycles and superovulation. In vitro
fertilisation rates are equally low (10%), with a high rate of polyspermia. No puppy has yet been born
from an embryo produced in vitro. As for embryos produced in vivo, their collection is difficult due to
anatomical reasons and to the fact that superovulation cannot be induced. Embryo transfer to donor
bitches is also hindered by difficulties to synchronise ovulations between donor and recipient bitches.
Only 6 such trials have been reported in the literature, resulting in the birth of 45 puppies. In vitro cultures
are very rarely used, and only four puppies were born from somatic cell cloning with only few hours
of in vitro culture. Canine reproductive biotechnologies have thus largely fallen behind, due to a lack
of fundamental research to improve our understanding of its specific physiological mechanisms. This
deficit is all the more damaging that dogs are increasingly used as relevant biomedical models.La biologie de l'ovocyte et de
l'embryon canins, qui présentent des particularités spécifiques, est très mal connue. La
chienne se distingue principalement par les modalités de reprise de la méiose ovocytaire :
celle-ci n'a pas lieu au moment de l'ovulation, comme chez les autres femelles mammifères,
mais dans l'oviducte 48 à 60 heures après l'ovulation. Les facteurs responsables de ce
retard ne sont pas connus. Ceci explique sans doute pourquoi les taux de maturation in vitro
obtenus à l'heure actuelle sont faibles (10 à 30 %). La collecte des ovocytes est aussi un
facteur limitant majeur, en l'absence de protocole efficace d'induction des cycles et de
superovulation. Les rendements de fécondation in vitro sont également faibles (10 %), avec
un taux élevé de polyspermie. À l'heure actuelle, aucun chiot n'est encore né à partir d'un
embryon produit in vitro. Quant aux embryons produits in vivo, leur collecte est difficile
pour des raisons anatomiques et le rendement est limité par l'impossibilité d'induire des
superovulations; par ailleurs, leur transfert chez des femelles receveuses se heurte aux
difficultés de synchronisation des ovulations entre la femelle donneuse et les receveuses,
et la littérature ne décrit que six essais, qui ont abouti à la naissance de 45 chiots. Avec
un très faible recours à la culture in vitro, quatre naissances de chiots ont été obtenues
par clonage de cellules somatiques. Les biotechnologies de la reproduction sont donc
largement en retard dans l'espèce canine, qui souffre d'un manque de travaux fondamentaux
visant à mieux comprendre ses mécanismes physiologiques spécifiques. Ce déficit est d'autant
plus dommageable que le chien prend une place croissante et pertinente en tant que modèle
biomédical
Dystrophy-associated caveolin-3 mutations reveal that caveolae couple IL6/STAT3 signaling with mechanosensing in human muscle cells
Caveolin-3 is the major structural protein of caveolae in muscle. Mutations in the CAV3 gene cause different types of myopathies with altered membrane integrity and repair, expression of muscle proteins, and regulation of signaling pathways. We show here that myotubes from patients bearing the CAV3P28L and R26Q mutations present a dramatic decrease of caveolae at the plasma membrane, resulting in abnormal response to mechanical stress. Mutant myotubes are unable to buffer the increase in membrane tension induced by mechanical stress. This results in impaired regulation of the IL6/STAT3 signaling pathway leading to its constitutive hyperactivation and increased expression of muscle genes. These defects are fully reversed by reassembling functional caveolae through expression ofcaveolin-3. Our study reveals that under mechanical stress the regulation of mechan-oprotection by caveolae is directly coupled with the regulation of IL6/STAT3 signaling inmuscle cells and that this regulation is absent in Cav3-associated dystrophic patients
Caveolin-1 dolines form a distinct and rapid caveolae-independent mechanoadaptation system.
In response to different types and intensities of mechanical force, cells modulate their physical properties and adapt their plasma membrane (PM). Caveolae are PM nano-invaginations that contribute to mechanoadaptation, buffering tension changes. However, whether core caveolar proteins contribute to PM tension accommodation independently from the caveolar assembly is unknown. Here we provide experimental and computational evidence supporting that caveolin-1 confers deformability and mechanoprotection independently from caveolae, through modulation of PM curvature. Freeze-fracture electron microscopy reveals that caveolin-1 stabilizes non-caveolar invaginations-dolines-capable of responding to low-medium mechanical forces, impacting downstream mechanotransduction and conferring mechanoprotection to cells devoid of caveolae. Upon cavin-1/PTRF binding, doline size is restricted and membrane buffering is limited to relatively high forces, capable of flattening caveolae. Thus, caveolae and dolines constitute two distinct albeit complementary components of a buffering system that allows cells to adapt efficiently to a broad range of mechanical stimuli.We thank R. Parton (Institute for Molecular Biosciences, Queensland),
P. Pilch (Boston University School of Medicine) and L. Liu (Boston
University School of Medicine) for kindly providing PTRFKO cells and
reagents, S. Casas Tintó for kindly providing SH-Sy5y cells, P. Bassereau
(Curie Institute, Paris) for kindly providing OT setup, V. Labrador
Cantarero from CNIC microscopy Unit for helping with ImageJ analysis,
O. Otto and M. Herbig for providing help with RTDC experiments,
S. Berr and K. Gluth for technical assistance in cell culture, F. Steiniger
for support in electron tomography, and A. Norczyk Simón for providing
pCMV-FLAG-PTRF construct. This project received funding from the European Union Horizon 2020 Research and Innovation Programme
through Marie Sklodowska-Curie grant 641639; grants from the Spanish
Ministry of Science and Innovation (MCIN/AEI/10.13039/501100011033):
SAF2014-51876-R, SAF2017-83130-R co-funded by ‘ERDF A way
of making Europe’, PID2020-118658RB-I00, PDC2021-121572-100
co-funded by ‘European Union NextGenerationEU/PRTR’, CSD2009-
0016 and BFU2016-81912-REDC; and the Asociación Española Contra
el Cáncer foundation (PROYE20089DELP) all to M.A.d.P. M.A.d.P. is
member of the Tec4Bio consortium (ref. S2018/NMT¬4443; Comunidad
Autónoma de Madrid/FEDER, Spain), co-recipient with P.R.-C. of
grants from Fundació La Marató de TV3 (674/C/2013 and 201936-
30-31), and coordinator of a Health Research consortium grant from
Fundación Obra Social La Caixa (AtheroConvergence, HR20-00075).
M.S.-A. is recipient of a Ramón y Cajal research contract from MCIN
(RYC2020-029690-I). The CNIC Unit of Microscopy and Dynamic
Imaging is supported by FEDER ‘Una manera de hacer Europa’ (ReDIB
ICTS infrastructure TRIMA@CNIC, MCIN). We acknowledge the
support from Deutsche Forschungsgemeinschaft through grants
to M.M.K. (KE685/7-1) and B.Q. (QU116/6-2 and QU116/9-1). Work in
D.N. laboratory was supported by grants from the European Union
Horizon 2020 Research and Innovation Programme through Marie
Sklodowska-Curie grant 812772 and MCIN (DPI2017-83721-P). Work in
C.L. laboratory was supported by grants from Curie, INSERM, CNRS,
Agence Nationale de la Recherche (ANR-17-CE13-0020-01) and
Fondation ARC pour la Recherche (PGA1-RF20170205456). Work in
P.R.-C. lab is funded by the MCIN (PID2019-110298GB-I00), the EC (H20
20-FETPROACT-01-2016-731957). Work in X.T. lab is funded by the MICIN
(PID2021-128635NB-I00), ERC (Adv-883739) and La Caixa Foundation
(LCF/PR/HR20/52400004; co-recipient with P.R.-C.). IBEC is recipient of
a Severo Ochoa Award of Excellence from the MINECO. The funders had
no role in study design, data collection and analysis, decision to publish
or preparation of the manuscript. The CNIC is supported by the Instituto
de Salud Carlos III (ISCIII), the MCIN and the Pro CNIC Foundation, and is
a Severo Ochoa Center of Excellence (grant CEX2020-001041-S funded
by MICIN/AEI/10.13039/501100011033).S
EHD2 is a mechanotransducer connecting caveolae dynamics with gene transcription
Caveolae are small invaginated pits that function as dynamic mechanosensors to buffer tension variations at the plasma membrane. Here we show that under mechanical stress, the EHD2 ATPase is rapidly released from caveolae, SUMOylated, and translocated to the nucleus, where it regulates the transcription of several genes including those coding for caveolae constituents. We also found that EHD2 is required to maintain the caveolae reservoir at the plasma membrane during the variations of membrane tension induced by mechanical stress. Metal-replica electron microscopy of breast cancer cells lacking EHD2 revealed a complete absence of caveolae and a lack of gene regulation under mechanical stress. Expressing EHD2 was sufficient to restore both functions in these cells. Our findings therefore define EHD2 as a central player in mechanotransduction connecting the disassembly of the caveolae reservoir with the regulation of gene transcription under mechanical stress
La maturation de l'ovocyte canin in vivo et in vitro
La biologie de l'ovocyte canin est très différente de celle des autres espèces mammifères : en particulier, la fin de la maturation ovocytaire dans le follicule se déroule en présence d'une forte concentration en progestérone (lutéinisation préovulatoire) et l'ovulation libère un ovocyte en prophase I, qui n'atteindra le stade métaphase II qu'au bout de 48 à 60 heures de transit oviductal. Parallèlement, les taux de maturation obtenus in vitro chez la chienne sont très faibles. Le but de ce travail était de fournir une description ultrastructurale de la maturation ovocytaire canine in vivo (avant le pic de LH jusqu'à 105 heures post ovulation) et d'y comparer l'évolution des ovocytes mis en maturation in vitro. In vivo, nos résultats en microscopie électronique à transmission montrent que l'ovocyte canin suit globalement le modèle de maturation ovocytaire des mammifères, à l'exception de l'existence d'une période de réactivation transcriptionnelle entre 24 et 48 heures post ovulation. Nous avons mis en évidence, grâce à une étude quantificative de l'incorporation de BrUTP, une activité transcriptionnelle très intense pendant cette période, activité à la fois nucléoplasmique et nucléolaire. Ni le pic de LH ni l'ovulation ne se révèlent suivis de modifications ultrastructurales importantes. Ils ne sont associés respectivement qu'à l'expansion et à la recompaction du cumulus. Les signaux de régulation de la méiose chez la chienne restent donc inconnus. In vitro, l'examen ultrastructural montre que les ovocytes issus d'ovaires d'anoestrus sont très immatures. La comparaison avec les formes observées in vivo indique que les ovocytes qui n'achèvent pas leur méiose in vitro (VG et métaphase I) sont simplement interrompus dans leur maturation et ne présentent pas de formes aberrantes. Quant aux ovocytes ayant atteint le stade métaphase II in vitro, ils montrent un très faible degré de maturation cytoplasmique
ETUDE EXPERIMENTALE DE LE FONDATION EN NID ARTIFICIEL D'ODONTOMACHUS BAURI (FORMICIDAE PONERINAE)
La fondation des reines fécondées en nid artificiel est importante à maîtriser pour pouvoir étudier les fourmis en laboratoire. Pouvoir prédire le temps nécessaire pour obtenir une colonie adulte et le rendement de l'élevage sont donc des données fondamentales. Après une revue de la bibliographie consacrée à la biologie générale d'Odontomachus bauri et à sa reproduction, nous nous sommes intéressés à la durée des différents stades de développement du couvain (phases embryonnaire, larvaire et nymphale) ainsi qu'au rendement de ces trois stades. Pour cela nous avons suivi 5 fondatrices d'Odontomachus bauri en nid artificiel et suivi l'évolution de deux groupes d'oeufs pondus à la même date et confiées à des ouvrières orphelinées. Nous avons obtenu dans nos conditions de travail une ponte minimale de 1,5 neuf par jour et une durée de maturation totale du couvain de 56 jours. Seuls au maximum 16,25 % des neufs donnent naissance à des ouvrières.MAISONS-ALFORT-Ecole Vétérin (940462302) / SudocSudocFranceF
La maturation de l ovocyte canin in vivo et in vitro
PARIS-AgroParisTech Centre Paris (751052302) / SudocSudocFranceF
Ultrastructure of canine oocytes during in vivo maturation
Article online in advance of printInternational audienceThe aim of the present study was to describe the canine oocyte ultrastructural modifications during in vivo maturation, with precise reference to the timing of the LH surge and of ovulation. Twenty-five bitches were ovariectomized at specific stages between the onset of proestrus and the fifth day post-ovulation: 65 oocytes were observed by transmission electron microscopy (TEM), either before the LH surge (n = 10), between the LH surge and ovulation (n = 12) or after ovulation (n = 43). Prior to the LH surge, the oocyte nucleus had already begun its displacement to the vicinity of the oolemma and reticulated nucleoli were infrequent. The cytoplasm showed signs of immaturity (few organelles preferentially located in the cortical zone, "mitochondrial cloud", scarce cortical granules). The LH surge was immediately followed by cumulus expansion but the ovulation occurred 2 days later. Retraction of the transzonal projections and the meiotic resumption occurred after another 3 days (5 days after the LH peak). The ovulation was then followed by gradual cytoplasmic modifications. Nucleoli re-assumed a reticulated aspect around 24 hr post-ovulation. From 48 hr post-ovulation mitochondria and SER were very numerous and evenly distributed. In conclusion canine oocyte maturation began prior to the LH surge and no cytoplasmic or nuclear modifications followed immediately the LH surge and ovulation. This study suggests that two distinct signals are needed for the final in vivo maturation: one prior to the LH surge (to induce maturation) and another one, around 3 days post-ovulation (to induce meiotic resumption)