Influence de l'initiation de la traduction sur le changement programmé du cadre de lecture en -1 responsable de la synthèse des enzymes du virus de l’immunodéficience humaine de type 1

Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) est responsable du syndrome de l’immunodéficience acquise (SIDA). Il faut identifier de nouvelles cibles pour le développement d’agents anti-VIH-1, car ce virus développe une résistance aux agents présentement utilisés. Notre but est d’approfondir la caractérisation de l’étape du changement de cadre de lecture ribosomique en -1 (déphasage -1) nécessaire à la production du précurseur des enzymes du VIH-1. Ce déphasage est programmé et effectué par une minorité de ribosomes lorsqu’ils traduisent la séquence dite glissante à un endroit spécifique de l’ARN messager (ARNm) pleine-longueur du VIH-1. L’efficacité de déphasage est contrôlée par le signal stimulateur de déphasage (SSF), une tige-boucle irrégulière située en aval de la séquence glissante. La structure du SSF est déroulée lors du passage d’un ribosome, mais elle peut se reformer ensuite. Nous avons montré que des variations de l’initiation de la traduction affectent l’efficacité de déphasage. Nous avons utilisé, dans des cellules Jurkat-T et HEK 293T, un rapporteur bicistronique où les gènes codant pour les luciférases de la Renilla (Rluc) et de la luciole (Fluc) sont séparés par la région de déphasage du VIH-1. La Rluc est produite par tous les ribosomes traduisant l’ARNm rapporteur alors que la Fluc est produite uniquement par les ribosomes effectuant un déphasage. L’initiation de ce rapporteur est coiffe-dépendante, comme pour la majorité des ARNm cellulaires. Nous avons examiné l’effet de trois inhibiteurs de l’initiation et montré que leur présence augmente l’efficacité de déphasage. Nous avons ensuite étudié l’effet de la tige-boucle TAR, qui est présente à l’extrémité 5’ de tous les ARNm du VIH-1. TAR empêche la liaison de la petite sous-unité du ribosome (40S) à l’ARNm et module aussi l’activité de la protéine kinase dépendante de l’ARN double-brin (PKR). L’activation de PKR inhibe l’initiation en phosphorylant le facteur d’initiation eucaryote 2 (eIF2) alors que l’inhibition de PKR a l’effet inverse. Nous avons étudié l’effet de TAR sur la traduction et le déphasage via son effet sur PKR en utilisant TAR en trans ou en cis, mais à une certaine distance de l’extrémité 5’ afin d’éviter l’interférence avec la liaison de la 40S. Nous avons observé qu’une faible concentration de TAR, qui active PKR, augmente l’efficacité de déphasage alors qu’une concentration élevée de TAR, qui inhibe PKR, diminue cette efficacité. Nous avons proposé un modèle où des variations de l’initiation affectent l’efficacité de déphasage en modifiant la distance entre les ribosomes parcourant l’ARNm et, donc, la probabilité qu’ils rencontrent un SSF structuré. Par la suite, nous avons déterminé l’effet de la région 5’ non traduite (UTR) de l’ARNm pleine-longueur du VIH-1 sur l’efficacité de déphasage. Cette 5’UTR contient plusieurs régions structurées, dont TAR à l’extrémité 5’, qui peut interférer avec l’initiation. Cet ARNm a une coiffe permettant une initiation coiffe-dépendante ainsi qu’un site d’entrée interne des ribosomes (IRES), permettant une initiation IRES-dépendante. Nous avons introduit cette 5’UTR, complète ou en partie, comme 5’UTR de notre ARNm rapporteur bicistronique. Nos résultats démontrent que cette 5’UTR complète inhibe l’initiation coiffe dépendante et augmente l’efficacité de déphasage et que ces effets sont dus à la présence de TAR suivie de la tige-boucle Poly(A). Nous avons aussi construit un rapporteur tricistronique où les ribosomes exprimant les luciférases utilisent obligatoirement l’IRES. Nous avons observé que cette initiation par l’IRES est faible et que l’efficacité de déphasage correspondante est également faible. Nous avons formulé une hypothèse pour expliquer cette situation. Nous avons également observé que lorsque les deux modes d’initiation sont disponibles, l’initiation coiffe dépendante est prédominante. Finalement, nous avons étudié l’effet de la protéine virale Tat sur l’initiation de la traduction et sur l’efficacité de déphasage. Nous avons montré qu’elle augmente l’initiation de la traduction et que son effet est plus prononcé lorsque TAR est située à l’extrémité 5’ des ARNm. Nous proposons un modèle expliquant les effets de Tat sur l’initiation de la traduction par l’inhibition de PKR ainsi que par des changements de l’expression de protéines cellulaires déroulant TAR. Ces résultats permettent de mieux comprendre les mécanismes régissant le déphasage du VIH-1, ce qui est essentiel pour le développement d’agents anti-déphasage.The human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) is responsible for the acquired immune deficiency syndrome (AIDS). HIV-1 develops a resistance towards the inhibitors used to treat infected patients. It is thus important to identify new targets for the development of novel antiretroviral agents. The aim of our work was to better characterize the programmed -1 ribosomal frameshift which generates the precursor of HIV-1 enzymes. The frameshift occurs at a specific sequence of HIV-1 full-length messenger RNA (mRNA), the slippery sequence, and is performed by a minority of the ribosomes translating this mRNA. The frameshift efficiency is controlled by the frameshift stimulatory signal (FSS), an irregular stem-loop located downstream of the slippery sequence. FSS structure is unfolded by every ribosome translating this region and can refold afterwards. We showed that HIV-1 frameshift efficiency is affected by changes in the rate of translation initiation. We transfected Jurkat-T and HEK 293T cells with a bicistronic reporter that contains the frameshift region of HIV-1 between the Renilla luciferase (Rluc) and the firefly luciferase (Fluc) genes. Rluc is produced by all ribosomes translating this reporter whereas only ribosomes that make a –1 frameshift produce Fluc. The translation of the reporter is initiated via a cap-dependant mode, like the majority of cellular mRNAs. We first determined the effect of three inhibitors of translation initiation. We showed that their presence increases the frameshift efficiency. We next determined the impact of the TAR stem loop, which is located at the 5’end of every HIV-1 mRNA. TAR is known to impair the binding of the small subunit of the ribosome (40S) to the mRNA. TAR also modulates the activity of the double-stranded RNA-dependent protein kinase (PKR). When PKR is activated, it phosphorylates the eukaryotic initiation factor 2 (eIF2), inhibiting translation initiation. The inhibition of PKR has the opposite effect. We studied the effect of TAR on PKR by positioning TAR at a distance of the 5’ end where it cannot interfere with the binding of the 40S. Our results showed that a small amount of TAR, which activates PKR, increases the frameshift efficiency whereas a large amount of TAR, which inhibits PKR, decreases it. A model is presented where the variations of translation initiation modulate HIV-1 frameshift efficiency by altering the distance between the elongating ribosomes. This influences the probability that these ribosomes encounter or not a folded FSS. We next observed the effect of the 5’ untranslated region (UTR) of HIV-1 full length mRNA on its frameshift efficiency. This 5’UTR contains several structured parts, including TAR at the 5’end, which can inhibit translation initiation. This mRNA has a cap and an internal ribosome entry site (IRES) and could then use a cap dependent and an IRES-dependent mode of translation initiation. We replaced the 5’UTR of our bicistronic reporter mRNA by the complete 5’UTR of HIV-1 full-length mRNA or a part of it. Our results showed that the presence of the complete 5’UTR inhibits cap-dependent initiation of translation and increases the frameshift efficiency. Those effects are mostly due to the presence of TAR followed by a Poly(A) stem-loop. We also constructed a tricistronic reporter where the ribosomes translating the luciferases have to use an IRES-dependent initiation mode. The rate of this initiation was low and the frameshift efficiency obtained was also low. We proposed a hypothesis accounting for this situation. We also observed that when both initiation modes are available, the cap-dependent mode seems to be highly favored. Finally, we studied the impact of the Tat viral protein on translation initiation and frameshift efficiency. We showed that the presence of Tat increases translation initiation and decreases the frameshift efficiency. Those effects are more important when TAR is present at the 5’end of mRNA. We propose a model explaining the effects of Tat on translation initiation by the inhibition of PKR and by changes in the expression of cellular proteins that are able to unfold TAR. Our results allow us to better understand the mechanisms controlling HIV-1 frameshift, which will help in the development of drugs targeting the HIV-1 frameshift

Exploring use of unsupervised clustering to associate signaling profiles of GPCR ligands to clinical response.

Signaling diversity of G protein-coupled (GPCR) ligands provides novel opportunities to develop more effective, better-tolerated therapeutics. Taking advantage of these opportunities requires identifying which effectors should be specifically activated or avoided so as to promote desired clinical responses and avoid side effects. However, identifying signaling profiles that support desired clinical outcomes remains challenging. This study describes signaling diversity of mu opioid receptor (MOR) ligands in terms of logistic and operational parameters for ten different in vitro readouts. It then uses unsupervised clustering of curve parameters to: classify MOR ligands according to similarities in type and magnitude of response, associate resulting ligand categories with frequency of undesired events reported to the pharmacovigilance program of the Food and Drug Administration and associate signals to side effects. The ability of the classification method to associate specific in vitro signaling profiles to clinically relevant responses was corroborated using β2-adrenergic receptor ligands.This research was supported by a research contract from Pfizer Inc. and grants from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (Grant 311997 to G.P.) and the Canadian Institutes of Health Research MOP 324876 (to G.P.), MOP 102630 (to M.B. and O.L.) and Foundation grant (FDN-148431) to MB. MB holds a Canada Research Chair in Signal Transduction and Molecular Pharmacology. Dr Lichtarge’s research was supported by National Institutes of Health (NIH 2R01 GM066099; NIH 5R01 GM079656). B.B. was supported by a studentship from Fonds de Recherche en Santé du Québec. P.D. was supported by a MITACS fellowship

The presence of the TAR RNA structure alters the programmed -1 ribosomal frameshift efficiency of the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) by modifying the rate of translation initiation

HIV-1 uses a programmed -1 ribosomal frameshift to synthesize the precursor of its enzymes, Gag-Pol. The frameshift efficiency that is critical for the virus replication, is controlled by an interaction between the ribosome and a specific structure on the viral mRNA, the frameshift stimulatory signal. The rate of cap-dependent translation initiation is known to be altered by the TAR RNA structure, present at the 5′ and 3′ end of all HIV-1 mRNAs. Depending upon its concentration, TAR activates or inhibits the double-stranded RNA-dependent protein kinase (PKR). We investigated here whether changes in translation initiation caused by TAR affect HIV-1 frameshift efficiency. CD4+ T cells and 293T cells were transfected with a dual-luciferase construct where the firefly luciferase expression depends upon the HIV-1 frameshift. Translation initiation was altered by adding TAR in cis or trans of the reporter mRNA. We show that HIV-1 frameshift efficiency correlates negatively with changes in the rate of translation initiation caused by TAR and mediated by PKR. A model is presented where changes in the rate of initiation affect the probability of frameshifting by altering the distance between elongating ribosomes on the mRNA, which influences the frequency of encounter between these ribosomes and the frameshift stimulatory signal

The presence of the TAR RNA structure alters

the programmed-1 ribosomal frameshift efficiency of the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) by modifying the rate of translation initiatio