Nuevos enfoques en el diagnóstico, prevención y tratamiento de la mastitis bovina a través del uso de moléculas con acción antimicrobiana

El objetivo de esta tesis fue caracterizar el papel de lactoferrina (LF) y otros factores solubles endógenos, en la defensa de la glándula mamaria contra la infección. También, se buscó analizar la potencial aplicación de estos elementos para el diagnóstico y la predicción de la mastitis bovina y para la generación de ganado resistente a esta enfermedad. Para abordar estos objetivos se realizaron estudios bioquímicos, microbiológicos y epidemiológicos que se presentan en 4 apartados de resultados. En el primer apartado de resultados se propuso estudiar la relación entre el incremento de los niveles de LF asociados a la infección intramamaria y el agente causal involucrado. Los resultados obtenidos muestran que la concentración de LF aumenta con la infección clínica o subclínica y que la infección con Streptococcus uberis está asociada a mayores niveles de LF en leche. Además se demostró que Strep. uberis es capaz de inducir la síntesis de LF in vitro y que este microorganismos es resistente a LF, lo que estaría indicando una asociación entre la respuesta mediada por LF a la infección y la sensibilidad a LF de los patógenos. En el segundo apartado de resultados se profundizaron los hallazgos del primero realizando un estudio de cohorte de 80 vacas durante una lactancia completa. Los resultados obtenidos permitieron determinar que la respuesta de LF es mayor en los primeros días de lactancia; que los cuartos mamarios positivos para infecciones presentan también concentraciones de LF aumentadas antes y después de la infección y que cuartos con mayores concentraciones de LF durante el periparto presentan mayor riesgo de infectarse durante la lactancia. En el tercer apartado de resultados se analizó la actividad antimicrobiana de β- lactoglobulina (β-LG) sobre bacterias causantes de mastitis. Se demostró que β-LG inhibe el crecimiento in vitro de Staphylococcus aureus y Strep. uberis pero no el de Escherichia coli en forma dosis dependiente. Este espectro de inhibición parece complementario al de LF. Además, se hallaron diferencias de actividad específica entre dos variantes alélicas de β-LG: β- LG A y β-LG. Por último se demostró que LF y β-LG pueden actuar en conjunto para inhibir el crecimiento de Strep. uberis y Staph. aureus. En el cuarto apartado de resultados se realizaron digestiones enzimáticas de LF y los péptidos obtenidos fueron caracterizados bioquímica y microbiológicamente. Uno de estos péptidos, identificado como la molécula lactoferricina (LFcin), presentó mayor actividad antimicrobiana que LF y una cinética de inhibición diferente. El péptido LFcin fue expresado en forma recombinante como proteína de fusión con β-LG en células CHO. Esta proteína quimérica demostró alta actividad antimicrobiana contra Staph. aureus y Strep. uberis pero no contra E. coli. En conjunto, los resultados presentados en este trabajo de tesis aportan información relevante sobre el papel de LF y β-LG en la infección intramamaria y sobre la potencial aplicación diagnóstica y terapéutica de estos elementos

New approaches in the diagnosis, prevention and treatment of bovine mastitis by using molecules with antimicrobial activity

El objetivo de esta tesis fue caracterizar el papel de lactoferrina (LF) y otros factores solubles endógenos, en la defensa de la glándula mamaria contra la infección. También, se buscó analizar la potencial aplicación de estos elementos para el diagnóstico y la predicción de la mastitis bovina y para la generación de ganado resistente a esta enfermedad. Para abordar estos objetivos se realizaron estudios bioquímicos, microbiológicos y epidemiológicos que se presentan en 4 apartados de resultados. En el primer apartado de resultados se propuso estudiar la relación entre el incremento de los niveles de LF asociados a la infección intramamaria y el agente causal involucrado. Los resultados obtenidos muestran que la concentración de LF aumenta con la infección clínica o subclínica y que la infección con Streptococcus uberis está asociada a mayores niveles de LF en leche. Además se demostró que Strep. uberis es capaz de inducir la síntesis de LF in vitro y que este microorganismos es resistente a LF, lo que estaría indicando una asociación entre la respuesta mediada por LF a la infección y la sensibilidad a LF de los patógenos. En el segundo apartado de resultados se profundizaron los hallazgos del primero realizando un estudio de cohorte de 80 vacas durante una lactancia completa. Los resultados obtenidos permitieron determinar que la respuesta de LF es mayor en los primeros días de lactancia; que los cuartos mamarios positivos para infecciones presentan también concentraciones de LF aumentadas antes y después de la infección y que cuartos con mayores concentraciones de LF durante el periparto presentan mayor riesgo de infectarse durante la lactancia. En el tercer apartado de resultados se analizó la actividad antimicrobiana de β- lactoglobulina (β-LG) sobre bacterias causantes de mastitis. Se demostró que β-LG inhibe el crecimiento in vitro de Staphylococcus aureus y Strep. uberis pero no el de Escherichia coli en forma dosis dependiente. Este espectro de inhibición parece complementario al de LF. Además, se hallaron diferencias de actividad específica entre dos variantes alélicas de β-LG: β- LG A y β-LG. Por último se demostró que LF y β-LG pueden actuar en conjunto para inhibir el crecimiento de Strep. uberis y Staph. aureus. En el cuarto apartado de resultados se realizaron digestiones enzimáticas de LF y los péptidos obtenidos fueron caracterizados bioquímica y microbiológicamente. Uno de estos péptidos, identificado como la molécula lactoferricina (LFcin), presentó mayor actividad antimicrobiana que LF y una cinética de inhibición diferente. El péptido LFcin fue expresado en forma recombinante como proteína de fusión con β-LG en células CHO. Esta proteína quimérica demostró alta actividad antimicrobiana contra Staph. aureus y Strep. uberis pero no contra E. coli. En conjunto, los resultados presentados en este trabajo de tesis aportan información relevante sobre el papel de LF y β-LG en la infección intramamaria y sobre la potencial aplicación diagnóstica y terapéutica de estos elementos.The aim of this thesis was to characterize the role of lactoferrin (LF) and other soluble factors in the defense of the mammary gland against infections. Additionally, we aimed to analyze the potential application of these elements in the diagnosis and prediction of bovine mastitis and in the generation of disease resistant cattle. To address these objectives we carried out biochemical, microbiological and epidemiological studies that are presented in 4 sections of results. In the first section we examined the relationship between the increase in LF levels associated with intramammary infection and the involved etiologic agent. Our results showed that the LF concentration increases upon clinical or subclinical infection and that infection with Streptococcus uberis is associated with the highest levels of LF in milk. We also showed that the challenge with Strep. uberis induced the synthesis of LF in vitro and that this microorganism is resistant to LF which suggests an association between infection response mediated by LF and pathogen susceptibility to this protein. In the second section, we extended the findings made in section 1. To do that, we carried out a longitudinal study over 80 cows during a complete lactation. The results indicated that: 1) LF response to infection is greater in the early days of lactation than in later stages. 2) infected quarters presented augmented levels of LF at sample times before and after the time of infection 3) quarters with higher concentrations of LF during peripartum presented increased risk of becoming infected afterwards. In the third section we analyzed the antimicrobial activity of β-lactoglobulin (β-LG) towards mastitis-causing bacteria. We demonstrated that β-LG inhibits the growth of Staphylococcus aureus and Strep. uberis but not Escherichia coli in a dose-dependent manner. This inhibition spectrum was complementary to the observed for LF. We also found differences in specific activity between two allelic variants of β-LG: β-LG A and β-LG. Finally, we showed that LF and β-LG can act together to inhibit the growth of Strep. uberis and Staph. aureus. In the fourth section, we performed enzymatic digestions of LF and the resulting peptides were characterized by means of biochemical and microbiological methods. One of the peptides obtained, identified as the molecule lactoferricin (LFcin), showed higher antimicrobial activity and different inhibition kinetics compared to LF. LFcin was expressed as a recombinant fusion protein with β-LG. When expressed in CHO cells, this chimeric protein showed high antimicrobial activity against Staph. aureus and Strep. uberis but not against E. coli. Overall, the results presented in this thesis provide relevant information on the role of LF and β-LG in intramammary infection and on the potential application of these molecules in the fight against bovine mastitis.Fil:Chaneton, Luciano. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina

Antimicrobial activity of bovine β-lactoglobulin against mastitis-causing bacteria

Bovine mastitis is one of the most economically deleterious diseases affecting dairy herds and results from an infection of the udder by pathogenic microorganisms such as Staphylococcus aureus, Streptococcus uberis, and Escherichia coli. The mammary gland is capable of preventing and combating bacterial infection by means of a complex network of innate and adaptive immune mechanisms. Lactoferrin is an 86-kDa protein with antibacterial activity that plays a role in the mammary gland's defense against infection. β-Lactoglobulin (β-LG) is an 18-kDa protein that is present in most mammals but is notably absent in humans, rodents, and lagomorphs. Different genetic variants of this protein exist, with β-LG A and β-LG B being the most common. In spite of being well studied, the biological function of β-LG is not thoroughly understood, and most noticeably, no reports exist on the effects of the native protein on bacterial growth. Hence, the objective of this study was to assess the potential antibacterial activity of β-LG against mastitis agents. To do this, we purified β-LG from normal bovine milk using a mild, nondenaturing method and performed in vitro growth inhibition assays with Staph. aureus, E. coli, and Strep. uberis. β-Lactoglobulin inhibited the growth of Staph. aureus and Strep. uberis but had no effect on E. coli. The antimicrobial activity against Staph. aureus and Strep. uberis was concentration dependent and was elicited by the intact protein because Tricine-sodium dodecyl sulfate-PAGE and analytical gel filtration chromatography did not reveal the presence of short degradation peptides. Analysis of the genetic variants of β-LG showed that β-LG A has higher inhibitory activity against Staph. aureus and Strep. uberis than β-LG B. Coincubation of β-LG and lactoferrin resulted in an augmented antibacterial activity against Staph. aureus, suggesting an additive effect of the proteins. This result, along with the proteins' complementary spectrum of action, suggests that β-LG and lactoferrin may complement each other in the mammary gland's defenses against bacterial infection. © 2011 American Dairy Science Association.Fil: Chaneton, Luciano. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Pérez Sáez, Juan Manuel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Bussmann, Leonardo Edmundo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; Argentin

Actividad biológica de lactoglobulina bovina contra bacterias causantes de mastitis

La mastitis bovina es la enfermedad que mayores pérdidas económicas ocasiona en el ganado de tambo. Esta infección es causada principalmente por bacterias, siendo Staphylococcus aureus y Escherichia coli algunos de los patógenos de mayor importancia clínica.Fil: Chaneton, Luciano. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Pérez Sáez, Juan Manuel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; ArgentinaFil: Bussmann, Leonardo Edmundo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaLII Reunión Cientìfica Anual Sociedad Argentina de Investigación Clínica (SAIC)Mar del PlataArgentinaSociedad Argentina de Investigación ClinicaSociedad Argentina de InmunologíaSociedad Argentina de Fisiologí

Seasonal patterns of herbivory, leaf traits and productivity consumption in dry and wet Patagonian forests

1. Endemic herbivory can influence forest ecosystem function, but how annual productivity consumption relates to seasonal resource utilisation by folivore guilds remains poorly understood. 2. Monthly changes in leaf damage and foliage traits were monitored in 'dry' and 'wet'Nothofagus pumilio (Fagales: Nothofagaceae) deciduous forests in northern Patagonia, Argentina. Herbivore-induced leaf abscission was assessed and foliar productivity consumption was measured in the canopy and in litterfall harvests. 3. Seasonal damage ranged from 8% to 32% in dry forest, but remained below 5% in wet forest although foliar quality was higher in the latter. In dry forest, dominant guilds were temporally separated; leaf miners consumed younger foliage in spring to early summer, whereas leaf tiers prevailed in late summer to autumn. In wet forest, damage created by external chewers was concentrated in early summer. 4. Insect damage induced premature leaf abscission, especially in dry forest. Although foliar production in wet forest doubled that in dry forest, the percentage of productivity lost to folivores was higher in dry (14-20%) than in wet (1.2-1.8%) forest. 5. The overall greater impact of herbivory in dry forest canopies countered the expectation that consumption would increase with plant productivity and nutritional quality. Lower temperatures and a shorter growing season are likely to constrain folivory in wet forest stands.Fil: Mazía, Cristina Noemí. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Agronomía. Departamento de Producción Vegetal; ArgentinaFil: Chaneton, Enrique Jose. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Fisiológicas y Ecológicas Vinculadas a la Agricultura. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Agronomía. Instituto de Investigaciones Fisiológicas y Ecológicas Vinculadas a la Agricultura; ArgentinaFil: Dellacanonica, Cristina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Agronomía. Departamento de Producción Vegetal; ArgentinaFil: Dipaolo, Luciano. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Fisiológicas y Ecológicas Vinculadas a la Agricultura. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Agronomía. Instituto de Investigaciones Fisiológicas y Ecológicas Vinculadas a la Agricultura; ArgentinaFil: Kitzberger, Thomas. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Patagonia Norte. Instituto de Investigaciones en Biodiversidad y Medioambiente. Universidad Nacional del Comahue. Centro Regional Universidad Bariloche. Instituto de Investigaciones en Biodiversidad y Medioambiente; Argentin

Functionality of whey proteins covalently modified by allyl isothiocyanate. Part 1 physicochemical and antibacterial properties of native and modified whey proteins at pH 2 to 7

Whey protein isolate (WPI) (∼75% β-lactoglobulin (β-LG)) is frequently used in foods as a natural emulsifying agent. However, at an acidic pH value, its emulsification capacity is greatly reduced. The covalent attachment of natural electrophilic hydrophobic molecules to WPI proteins is a promising method for changing the physicochemical properties of WPI in favor of a higher functionality at acidic pH values. In the present study, different concentrations of allyl isothiocyanate (AITC) were covalently bound to WPI and the related changes in physicochemical properties (charge, aggregation, surface hydrophobicity and secondary structure) were monitored over a wide pH range (pH 2 to 7). In addition, the antibacterial activity against different strains of S. aureus and E. coli before and after AITC modification was assessed. The results showed that both whey proteins β-LG and α-lactalbumin (ALA) were modified by AITC. This modification remained stable during pH adjustment. Unbound AITC was successfully removed by the lyophilization process, which reduced the strong odor of the volatile AITC. A shift of the isoelectric point towards acidic conditions was observed. The hydrophobicity of the modified WPI increased significantly and the protein's secondary and tertiary structure was altered. In addition, a more loose protein folding was observed. These effects were less pronounced at pH 6 and 7. The relatively mild antibacterial effect of native WPI was not significantly influenced by the addition of AITC.</p