Towards the therapeutic use of regulatory T cells for the treatment of human autoimmune diseases

Tese de doutoramento, Medicina (Imunologia Clínica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2016Regulatory T Cells (Treg), constitutively expressing the transcription factor Foxp3/FOXP3, play a crucial role in maintaining self-tolerance, assuming particular relevance in the context of autoimmunity. Adoptive transfer of Treg has been shown to be highly efficient in the prevention and treatment of autoimmunity in rodents and clinical trials exploring Treg-based adoptive therapy in Type I Diabetes (T1D) are currently ongoing. These therapies require large numbers of Treg, stressing the importance of a better knowledge of the molecular and cellular requirements for human thymic and peripheral Treg development. Moreover, widespread application of Treg-based therapy dealt with several limitations regarding the stability and function of in vitro expanded populations for in vivo use. The creation of efficient protocols enabling stable FOXP3 acquisition by human non-regulatory cells could overcome the limited availability of thymus-derived (t)Treg and would facilitate the generation of antigen-specific Treg, an ideal candidate in autoimmune diseases (AID) setting. The overall objective of this work was to provide new insights into the principles dictating human thymic and peripheral Treg development and homeostasis, thus facilitating the progress of Treg-based immunotherapy. First, we proposed to investigate the capacity of human non-regulatory memory CD4+ T cells to differentiate in vitro into bona-fide FOXP3-expressing cells and to assess the role of the Notch signaling pathway in modulating this conversion. We showed that stable and functional bona-fide Treg can be generated from memory CD4+ T cells and that Delta like (DL)1-mediated Notch signaling activation enhanced this conversion. We additionally showed that DL1 increased Treg proliferation, reinforcing the possible role of Notch in the homeostasis of the human peripheral Treg compartment. Importantly, we also demonstrated that DL1 enhanced the expression of function-related molecules within these cells, contributing to the maintenance of their regulatory phenotype. In order to better clarify the principles governing Treg development in the human thymus, we investigated the role of common gamma-chain (c) cytokines in human tTreg differentiation. We identified interleukin (IL)-2 and IL-15 as key molecular determinants in this process and excluded a major function for IL-4, IL-7 and IL-21. Moreover, we revealed that IL-2 and IL-15 are expressed in a non-overlapping pattern in the human thymus, with the former produced mainly by mature αβ and γδ thymocytes and the latter by monocyte/macrophages and B lymphocytes. Overall, this work has provided a better understading of the core mechanisms governing human Treg differentiation and homeostasis that should facilitate the further establishment of Treg-based therapies.As Células T Reguladoras (T Regs), expressando constitutivamente o factor de transcrição Foxp3/ FOXP3, desempenham um papel crucial na manutenção da auto-tolerância, assumindo particular relevância no contexto de auto-imunidade. A transferência adoptiva de T Regs demonstrou ser altamente eficaz na prevenção e no tratamento de autoimunidade em roedores e ensaios clínicos explorando terapêuticas baseadas em T Regs na Diabetes Tipo I estão actualmente em curso. Estas terapias exigem um grande número de células, pelo que é essencial um melhor conhecimento dos requisitos moleculares e celulares para o desenvolvimento no timo humano e na periferia de T Regs. Além disso, a aplicação generalizada desta terapêutica tem ainda várias limitações no que respeita à estabilidade e função das populações expandidas in vitro para utilização in vivo. A criação de protocolos eficientes que permitam a aquisição estável de FOXP3 por células não-reguladoras poderá ultrapassar a disponibilidade limitada de T Regs de origem tímica e facilitar a geração de T Regs com especificidade antigénica, potencialmente ideais no contexto de doenças auto-imunes. O objetivo global deste trabalho foi investigar os princípios que ditam o desenvolvimento tímico e periférico e a homeostasia das T Regs humanas, facilitando assim o progresso da imunoterapia utilizando T Regs. Em primeiro lugar, propusemo-nos investigar a capacidade das células T CD4+ de memória não-reguladoras para se diferenciarem in vitro em células que expressam FOXP3, avaliando o papel da via de sinalização Notch na modulação desta conversão. Revelámos que T Regs estáveis e funcionais podem ser geradas a partir de células T CD4+ de memória isoladas do sangue periférico de indivíduos saudáveis e que a activação de Notch mediada por DL1 aumenta esta conversão. Adicionalmente, demonstrámos que DL1 aumenta a proliferação de T Regs circulantes, reforçando o possível papel de Notch na homeostasia do compartimento periférico de T Regs. Mostrámos também que DL1 aumenta a expressão de moléculas relacionadas com a função de T Regs circulantes, contribuindo para a manutenção do fenótipo das T Regs. Com a finalidade de clarificar os princípios que regem o desenvolvimento de T Regs no timo humano, investigámos o papel das citocinas que utilizam um receptor com cadeia gama comum na diferenciação de T Regs humanas. Identificámos as interleucinas IL-2 e IL-15 como determinantes moleculares chave neste processo, tendo sido excluída uma função de relevo para IL-4, IL-7 e IL-21. Mais ainda, revelámos que IL-2 e IL-15 são expressas num padrão não sobreposto no timo humano, sendo a primeira produzida principalmente por timócitos maduros αβ e γδ e a última por monócitos/ macrófagos e linfócitos B. Em conclusão, este trabalho proporcionou um melhor conhecimento dos mecanismos fundamentais que regem o desenvolvimento, a homeostasia e manipulação in vitro das T Regs em humanos, contribuindo para o estabelecimento das terapêuticas baseadas em T Regs

Bursaphelenchus antoniae sp. n. (Nematoda: Parasitaphelenchidae) associated with Hylobius sp. from Pinus pinaster in Portugal

Bursaphelenchus antoniae sp. n. is described and illustrated. Dauer juveniles were isolated from the body of the large pine weevil, Hylobius sp., collected from maritime pine (Pinus pinaster) stumps, in Portugal. Bursaphelenchus antoniae sp. n. was reared and maintained in P. pinaster wood segments and on Petri dish cultures of the fungi Botrytis cinerea and Monilinia fructicola. The new species is characterised by a relatively small body length of ca 583 μm (females) and 578 μm (males), a lateral field with two incisures, presence of a small vulval flap and a conoid female tail with a rounded or pointed terminus. Males have stout spicules with a disc-like cucullus and seven caudal papillae arranged as a single midventral precloacal papilla, one precloacal pair and two postcloacal pairs. In the character of the lateral field, B. antoniae sp. n. comes close to B. abietinus, B. rainulfi and B. hylobianum, whilst spicule characters place it within the piniperdae-group sensu Ryss et al. Morphologically, B. antoniae sp. n. is closest to B. hylobianum; the spicules of these two species having flattened, wing-like, alae on the distal third of the lamina. Bursaphelenchus antoniae sp. n. is distinguished from B. hylobianum on the arrangement of the caudal papillae (two vs three pairs). ITS-RFLP profiles and the failure to hybridise support the separation of the two species. Phylogenetic analysis of the new species, based on the 18S rDNA sequence, supports the inclusion of this new species in the B. hylobianum-group sensu Braasch. Sequence analysis of the 28S rDNA D2/D3 domain did not place the new species in a definite group

Real-time droplet monitoring for digital Polymerase Chain Reaction in microfluidic chip

Current cancer diagnosis techniques are often dependent on the collection of tumour tissue, involving invasive processes for the patient. Circulating Tumour DNA (ctDNA) emerges as an alternative resource for cancer detection and monitoring, that can be har vested from simple blood samples. Digital Polymerase Chain Reaction (dPCR) is a fast and sensitive technique for DNA amplification, suitable for low DNA concentrations such as ctDNA. Advances in microfluidics allow the partition of PCR samples into droplets based in water-in-oil emulsions, so that PCR amplification occurs within each droplet. In this way, the PCR reaction is a well controlled process with a low probability of contami nation and allowing a high throughput analysis. The aimed of this work was to develop droplet-based microfluidic device for application to dPCR technique coupled with real-time droplet monitoring. This work focused on the design and fabrication of a microfluidic device capable of producing a large number of uniform droplets with volumes in the nanoliter range and constant frequency. For this, a polydimethylsiloxane (PDMS) droplet generator device was developed, through photo and soft-lithography techniques, and tested with several oil/water flow rates ratios. Then, the droplets generated were characterized in terms of droplet size, velocity and frequency through the implementation of a powerful open-source software for real-time analysis. Several tests on different devices were carried out to evaluate the device reproducibility. Finally, the droplet generator was incorporated with a serpentine design, allowing the PCR cycles to occur in continuous flow. The results revealed that was possible to generate droplets with radius between 22-99 µm and a coefficient of variation bellow 10%. The correspondents volumes ranged between 90 pL-4.18 nL. Moreover, the velocities obtained situated between 0.05 mm/s-7.62 mm/s with droplet generating frequency of 2-50 Hz. Regarding to the droplet monitoring, the results of the workflows developed revealed similarity with the results obtained trough a widely used software for this purposes, with the advantage of allowing real-time analysis for a larger sample of results.As técnicas actuais usadas no diagnóstico de cancro, geralmente dependem da recolha de tecido tumoral, envolvendo processos invasivos para o paciente. O DNA tumoral circu lante (ctDNA) surge como alternativa para a detecção e monitorização do cancro, podendo ser extraído através de amostras de sangue. A reação em cadeia da polimerase de modo digital (dPCR) é uma técnica rápida e sensível para amplificação de DNA, adequado para baixas concentrações de DNA, como o ctDNA. Os avanços na microfluídica permitem a partição das amostras de PCR em gotas com base em emulsões de água em óleo, de modo que a amplificação por PCR ocorra dentro de cada gota. Deste modo, a reação de PCR é um processo bem controlado com baixa probabilidade de contaminação, permitindo uma análise de alto rendimento. Este trabalho teve como objetivo o desenho e a fabricação de um dispositivo de micro fluídica capaz de produzir um elevado número de gotas uniformes, cujos volumes se encontram na gama dos nanolitros, com frequência constante. Para tal, foi desenvolvido um dispositivo para geração de gotas em polidimetilsiloxano (PDMS), através de técnicas de fotolitografia e litografia suave, tendo sido testado com diversas taxas de fluxos entre óleo / água. Posteriormente, as gotas geradas foram caracterizadas em relação ao seu ta manho, velocidade e frequência através do software de análise de vídeo Bonsai. Diversos testes em diferentes dispositivos foram realizados de modo a avaliar a reprodutibilidade do dispositivo. Por último, o gerador de gotas foi incorporado com desenho da serpentina, permitindo que os ciclos de PCR ocorram em fluxo contínuo. Os estudos realizados revelaram que foi possível gerar gotas com raios entre 22-99 µm, e coeficiente de variação inferior a 10%. Os volumes correspondentes variaram entre 90 pL 4.18 nL. Além disso, as velocidades obtidas situaram-se entre 0.05 mm/s-7.62 mm/s com frequência de geração de gotas de 2-50 Hz. Relativamente à monitorização das gotas, os resultados dos workflows desenvolvidos revelaram similaridade com os resultados obtidos através de um software amplamente utilizado para estes fins, com a vantagem de permitir a análise em tempo real para uma amostra maior de resultados

Molecular mechanisms of disiccation tolerance in Fucus

Intertidal algae (brown, red and green) are three understudied and independent multicellular lineages possessing related intolerant and desiccation tolerant species, making them good models for desiccation tolerance research. Recent focus on distribution of Fucus vesiculosus under climate change led us to determine the upper thermal limits of this brown algae, using physiological indicators and gene expression responses to describe the induction and thermal characteristics of the heat-shock response in diverse populations. Ambient temperatures were poor predictors of the heat-stress experienced by intertidal algae, instead the microhabitats created by the algal canopy modulated the local thermal environment and influenced the stress response. Surprisingly, in the hottest microhabitat algae appeared to be protected from thermal stress by fast and intense desiccation. Proteomic research in brown algae has recently been facilitated by genomic resources, complete genome sequencing of model species and large-scale transcriptomic resources from Fucus species, and by technical advances in work on organisms with similar interfering compounds. We tested and optimized a protein extraction protocol suitable for intertidal Fucus algae and used it to investigate differential expression of proteins in response to desiccation, both by conventional 2DE and by DIGE. No significant changes of the protein profiles were detected after desiccation or rehydration, suggesting the importance of constitutive tolerance mechanisms, minimizing the metabolic cost of gene expression, while the desiccated state provides protection against heat stress. Studies of distinct field environments (desiccation-prone or –protected), of sequential emersion stress exposure and of laboratory desiccation under controlled conditions, all failed to identify robust protein expression changes attributable to desiccation tolerance. We characterized the first extractable proteome of F. vesiculosus by LC-MS/MS identification and annotation against brown algal protein databases, with considerable success despite limited functional annotation in brown algae proteins, and the presence of multiple proteins in some spots.Na zona entre marés existem diversas macroalgas (castanhas, verdes e vermelhas), pertencentes a três linhagens multicelulares independentes e pouco estudadas, contendo espécies tolerantes e espécies intolerantes à dessecação, o que faz delas bons modelas para o estudo da tolerância à dessecação. Recentemente, a atenção dada à distribuição de Fucus vesiculosus sob efeito das alterações climáticas levou-nos a querer determinar os limites subletais máximos de temperatura desta alga castanha, utilizando indicadores fisiológicos e alterações da expressão genética para descrever a temperatura de indução e o perfil da resposta ao choque térmico em diversas populações desta espécie. Vimos que conhecer a temperatura ambiente não é suficiente para antecipar o choque térmico sentido pela alga, ao mesmo tempo que os microhabitats formados pelo tapete de algas vão influenciar a temperatura local e afectar a resposta ao choque térmico. Surpreendentemente, no microhabitat mais quente as algas aparentavam estar protegidas do choque térmico pela dessecação rápida e intensa. Estudos de proteómica em algas castanhas foram facilitados recentemente graças a recursos genéticos, a sequenciação do genoma completo da espécie modelo, Ectocarpus siliculosus, numerosas sequências de transcriptos de Fucus, obtidas pelas novas técnicas de sequenciação e avanços técnicos no estudo de outros organismos com compostos secundários semelhantes que interferem com a qualidade e a quantidade das proteínas extraídas. Foi optimizado um protocolo de extracção de proteínas de algas do género Fucus, que foi utilizado para investigar a expressão diferencial de proteínas em resposta à dessecação tanto por 2DE convencional como por 2D-DIGE. Não foram detectadas alterações significativas nos perfis de proteínas na sequência da dessecação ou da rehidratação, o que sugere a importância de mecanismos constitutivos de tolerância, minimizando os custos metabólicos da expressão de novos genes, enquanto a dessecação protege do choque térmico. Estudos de campo, em locais de intensa dessecação ou protegidos, após exposição consecutiva ao stress de emersão, e após dessecação em condições controladas no laboratório, todos falharam na identificação de alterações robustas na expressão de proteínas envolvidas na tolerância à dessecação. Caracterizámos o primeiro proteoma extraível de F. vesiculosus, identificando as proteínas por LC-MS/MS e anotando utilizando as bases de dados de algas castanhas. Esta anotação foi bem-sucedida, apesar da fraca anotação funcional das proteínas de algas castanhas e da presença de múltiplas proteínas em alguns dos spots

Detailed morphobiometric studies of Bursaphelenchus xylophilus and characterisation of other Bursaphelenchus species (Nematoda: Parasitaphelenchidae) associated with Pinus pinaster in Portugal

Detailed studies on Bursaphelenchus xylophilus are provided in this contribution. Comparative observations between field and cultured populations of this species demonstrated significant size differences: cultured specimens overall displayed larger size in all morphometric parameters. A principal component analysis (PCA) of the individuals undergoing moulting allowed their separation in four groups namely J2-J3, J3-J4, J4F-F, and J4M-M; gonad length mean values of these four groups made possible to distinguish the non-moulting groups J2, J3, J4F, J4M and adults. Seven Bursaphelenchus species (B. hellenicus, B. leoni, B. pinasteri, B. sexdentati, B. teratospicularis, B. tusciae and B. xylophilus), associated with Pinus pinaster in Portugal, were charaterized, including biometrical measurements and ratios as well excised spicules observed under SEM; furthermore, B. hellenicus, B. pinasteri, B. sexdentati, B. tusciae and B. xylophilus were characterised on the basis of their ITS-RFLP profiles. B. sexdentati and B. xylophilus were the only species found in high numbers in some of the samples

Cidadania metropolitana, críticas do quotidiano e intervenção artística: ligando a arte e a sociologia

This proposal suggests an interdisciplinary approach encompassing the combination of urban sociological research and artistic intervention in urban settings. We will consider the integration of digital artworks in public spaces, chosen for their ability to generate engaging and innovative experiences as well as extending a virtual layer of meaning over real spaces. It is our premise that the aptitude for critical analysis and research of objects and tendencies within daily experience normally invisible through habitual perceptions that certain artistic interventions carry, might contribute to the development of an enriched relationship between art and the questioning processes typical of sociology, more specifically concerning its objective of deconstructing reality for analytical purposes. We will thus seek to demonstrate that such a critical analysis of daily existence, which can be found both on the artistic and sociological productions, might become a fertile ground for an emerging conscience and reflective appropriation of mundane social contexts (namely in urban settings), as well as give rise to a more engaged civil participation

A marketing plan for Oqtopus in the Spanish market

A Work Project, presented as part of the requirements for the Award of a Masters Degree in Management from the NOVA – School of Business and EconomicsThis is an academic work developed in the context of the Master Degree in Management lectured by the Nova School of Business and Economics. One of the goals of this work project was to apply some of the business and marketing concepts acquired during the master’s academic year. Within the Market Technology Transfers’ Field Lab, this thesis was an opportunity to simulate the real-life working environment in a company. To achieve this outcome I tried to put myself in the shoes of a Marketing Director that has to make a decision in what concerns to the brands or products he/she has under his/her responsibility. In this particular case, my mission for this work project was to develop a marketing plan for Oqtopus, one of Displax’s multi-touch products, for the Spanish market. In this sense, I will start with a brief presentation of Displax and it’s business, followed by the analysis of the macro and microenvironment of the company and the multitouch industry. Thereafter, I will introduce the strategic triangle and the marketing plan for Oqtopus. Finally, my research and study about the multi-touch industry, as well as the knowledge I achieved regarding Displax business due to the several contacts established through these months with Edigma/Displax Marketing Officer Pedro Fernandes, led me to include in this work my own considerations about what I consider relevant for Displax to carry on with its ambitious plan of growth, in a marketing context

Conflictos interparentales y desarrollo de la psicopatología en adolescentes y jóvenes adultos

La finalidad de este estudio fue examinar en que medida los conflictos maritales y el divorcio actúan como predictivos de psicopatología en jóvenes de familias tradicionales y divorciadas. Participaron 827 jóvenes portugueses de 13 a 25 anos. Fueron utilizados un cuestionario sociodemográfico, la Children’s Perception of Interparental Conflict Scale y el Brief Symptom Inventory. Fueron encontradas diferencias significativas en la psicopatología ante el género, la edad y la configuración familiar. Se constato que el desarrollo de la psicopatología se predice positivamente por la intensidad y la no resolución de los conflictos interparentales. Se concluyó que hijos de padres separados o divorciados tienen mayor percepción de frecuencia y intensidad del conflicto marital, pero muestran mayor nivel de resolucion de los conflictos interparentales y mayores niveles de psicopatología. Sin embargo, la configuración familiar no tiene efecto moderador en la interacción entre el conflicto marital y el desarrollo de la psicopatología.O objetivo deste estudo foi analisar em que medida os conflitos interparentais e o divórcio se apresentam como preditores do desenvolvimento de psicopatologia em jovens de famílias intactas e divorciadas. Participaram 827 jovens portugueses de 13 a 25 anos de idade. Foram utilizados um questionário sociodemográfico, o Children’s Perception of Interparental Conflict Scale e o Brief Symptom Inventory. Foram encontradas diferenças significativas da psicopatologia face ao gênero, idade e configuração familiar. Constatou-se que o desenvolvimento de psicopatologia é predito positivamente pela intensidade e falta de resolução dos conflitos interparentais. Concluiu-se que os filhos cujos pais se encontram separados ou divorciados têm maior percepção relativamente à frequência e intensidade de conflitos interparentais, porém apresentam maior nível de resolução dos conflitos interparentais e maiores níveis de psicopatologia. Contudo, a configuração familiar não exerce um efeito moderador na interação entre os conflitos interparentais e o desenvolvimento de psicopatologia.The objective in this study was to analyze to what extent inter parental conflicts and divorce act as predictors of psychopathological development in young people from intact and divorced families. The participants were 827 Portuguese young people between 13 and 25 years of age. A sociodemographic questionnaire, the Children’s Perception of Interparental Conflict Scale and the Brief Symptom Inventory were used. Significant difference in the psychopathology were found with regard to gender, age and family structure. As verified, the intensity and lack of solution of the inter parental conflicts positively predict the development of psychopathology. In conclusion, the children whose parents are separated or divorced perceive the frequency and intensity of inter parental conflicts more highly, but present a higher solution level of the inter parental conflicts and higher psychopathology levels. Nevertheless, the family structure has no moderating effect on the interaction between the inter parental conflicts and the development of pyschopathology