Single-molecule conformational dynamics of viroporin ion channels regulated by lipid-protein interactions

Classic swine fever is a highly contagious and often fatal viral disease that is caused by the classical swine fever virus (CSFV). Protein p7 of CFSV is a prototype of viroporin, a family of small, highly hydrophobic proteins postulated to modulate virus-host interactions during the processes of virus entry, replication and assembly. It has been shown that CSFV p7 displays substantial ion channel activity when incorporated into membrane systems, but a deep rationalization of the size and dynamics of the induced pores is yet to emerge. Here, we use high-resolution conductance measurements and current fluctuation analysis to demonstrate that CSFV p7 channels are ruled by equilibrium conformational dynamics involving protein-lipid interactions. Atomic force microscopy (AFM) confirms the existence of a variety of pore sizes and their tight regulation by solution pH. We conclude that p7 viroporin forms subnanometric channels involved in virus propagation, but also much larger pores (1–10 nm in diameter) with potentially significant roles in virus pathogenicity. Our findings provide new insights into the sources of noise in protein electrochemistry and demonstrate the existence of slow complex dynamics characteristic of crowded systems like biomembrane surfaces

Molecular Recognition of the Native HIV-1 MPER Revealed by STED Microscopy of Single Virions

Antibodies against the Membrane-Proximal External Region (MPER) of the Env gp41 subunit neutralize HIV-1 with exceptional breadth and potency. Due to the lack of knowledge on the MPER native structure and accessibility, different and exclusive models have been proposed for the molecular mechanism of MPER recognition by broadly neutralizing antibodies. Here, accessibility of antibodies to the native Env MPER on single virions has been addressed through STED microscopy. STED imaging of fluorescently labeled Fabs reveals a common pattern of native Env recognition for HIV-1 antibodies targeting MPER or the surface subunit gp120. In the case of anti-MPER antibodies, the process evolves with extra contribution of interactions with the viral lipid membrane to binding specificity. Our data provide biophysical insights into the recognition of the potent and broadly neutralizing MPER epitope on HIV virions, and as such is of importance for the design of therapeutic interventions.This study was supported by the Spanish MINECO (BIO2015-64421-R (MINECO/ FEDER UE) to J.L.N.) and the Basque Government (IT838-13 to J.L.N.). P.C., E.R., and S. I. received pre-doctoral fellowships from the Basque Government. P.C. would like to acknowledge the European Biophysical Societies’ Association (EBSA) for receiving an EBSA Bursary for a working visit to a laboratory in an EBSA country. J.C., D.W., and C. E. greatly acknowledge support by the MRC (grant number MC_UU_12010/unit programs G0902418 and MC_UU_12025), the Wellcome Trust (grant 104924/14/Z/14 and Strategic Award 091911 (Micron)), MRC/BBSRC/EPSRC (grant MR/K01577X/1), BBSRC (Deutsche Forschungsgemeinschaft (Research unit 1905 “Structure and function of the peroxisomal translocon”)), the Wolfson Foundation (for initial funding of the Wolfson Imaging Centre Oxford), the EPA Cephalosporin Fund and the John Fell Fund. T.S. is a recipient of a Canada Graduate Scholarship Master’s Award and a Vanier Canada Graduate Scholarship from the Canadian Institutes of Health Research. This work was supported by operating grant NIH-150414 (J.-P.J.) from the Canadian Institutes of Health Research. This research was undertaken, in part, thanks to funding from the Canada Research Chairs program (J.-P.J.). We acknowledge valuable technical assistance from Miguel García-Porra

Functional Delineation of a Protein–Membrane Interaction Hotspot Site on the HIV-1 Neutralizing Antibody 10E8

Antibody engagement with the membrane-proximal external region (MPER) of the envelope glycoprotein (Env) of HIV-1 constitutes a distinctive molecular recognition phenomenon, the full appreciation of which is crucial for understanding the mechanisms that underlie the broad neutralization of the virus. Recognition of the HIV-1 Env antigen seems to depend on two specific features developed by antibodies with MPER specificity: (i) a large cavity at the antigen-binding site that holds the epitope amphipathic helix; and (ii) a membrane-accommodating Fab surface that engages with viral phospholipids. Thus, besides the main Fab–peptide interaction, molecular recognition of MPER depends on semi-specific (electrostatic and hydrophobic) interactions with membranes and, reportedly, on specific binding to the phospholipid head groups. Here, based on available cryo-EM structures of Fab–Env complexes of the anti-MPER antibody 10E8, we sought to delineate the functional antibody–membrane interface using as the defining criterion the neutralization potency and binding affinity improvements induced by Arg substitutions. This rational, Arg-based mutagenesis strategy revealed the position-dependent contribution of electrostatic interactions upon inclusion of Arg-s at the CDR1, CDR2 or FR3 of the Fab light chain. Moreover, the contribution of the most effective Arg-s increased the potency enhancement induced by inclusion of a hydrophobic-at-interface Phe at position 100c of the heavy chain CDR3. In combination, the potency and affinity improvements by Arg residues delineated a protein–membrane interaction site, whose surface and position support a possible mechanism of action for 10E8-induced neutralization. Functional delineation of membrane-interacting patches could open new lines of research to optimize antibodies of therapeutic interest that target integral membrane epitopes.This study was supported by the Spanish MCIN (Grants PID2021-126014OB-I00 MCIN/AEI/FEDER, UE to JLN and BA; and PID2021-122212OA-I00 MCIN/AEI/FEDER, UE to ER), Basque Government (Grant: IT1449-22) and JSPS KAKENHI 20H03228 (to J.M.M.C.)

Focal accumulation of aromaticity at the CDRH3 loop mitigates 4E10 polyreactivity without altering its HIV neutralization profile

Broadly neutralizing antibodies (bnAbs) against HIV-1 are frequently associated with the presence of autoreactivity/polyreactivity, a property that can limit their use as therapeutic agents. The bnAb 4E10, targeting the conserved Membrane proximal external region (MPER) of HIV-1, displays almost pan-neutralizing activity across globally circulating HIV-1 strains but exhibits nonspecific off-target interactions with lipid membranes. The hydrophobic apex of the third complementarity-determining region of the heavy chain (CDRH3) loop, which is essential for viral neutralization, critically contributes to this detrimental effect. Here, we have replaced the aromatic/hydrophobic residues from the apex of the CDRH3 of 4E10 with a single aromatic molecule through chemical modification to generate a variant that preserves the neutralization potency and breadth of 4E10 but with reduced autoreactivity. Collectively, our study suggests that the localized accumulation of aromaticity by chemical modification provides a pathway to ameliorate the adverse effects triggered by the CDRH3 of anti-HIV-1 MPER bnAbs.This study was supported by the following Grants: European Commission (790012 SI H2020-MSCA-IF-2017) (E.R.); US NIAID, NIH grant R01 AI143563 (M.B. Z.); James B. Pendleton Charitable Trust (M.B.Z.); JSPS grant 20H03228 (J. M.M.C.); Spanish MCIU (RTI2018-095624-B-C21; MCIU/AEI/FEDER, UE) (J.L.N.), Basque Government (IT1196-19) (J.L.N.). C.E. acknowledges funding from Medical Research Council (grant number MC_UU_12010/unit programs G0902418 and MC_UU_12025), Wolfson Foundation, Deutsche Forschungsgemeinschaft (Excellence Cluster Balance of the Microverse, Collaborative Research Center 1278 Polytarget), Leibniz Association (Leibniz Campus Infectooptics), Wellcome Institutional Strategic Support Fund, Oxford internal funds (EPA Cephalosporin Fund and John Fell Fund), and support from the Micron Oxford Advanced Bioimaging Unit (Wellcome Trust funding 107457/Z/15/Z). This work was also supported by the Platform Project for Supporting Drug Discovery and Life Science Research [Basis for Supporting Innovative Drug Discovery and Life Science Research (BINDS)] from AMED (JP21am0101091). S.I. received a predoctoral fellowship from the BasqueGovernment. P.C. would like to acknowledge the University of the Basque Country (DOCREC18/01), the Basque Government (POS_2018_1_0066) and the European Commission (H2020-MSCA-IF-2019-ST project 892232 FILM-HIV) for funding his position. This research was also supported by the CIFAR Azrieli Global Scholar program (J-P.J.), the Ontario Early Researcher Awards program (J-P.J.), and the Canada Research Chairs program (J-P.J.). Part of the biophysical data presented in this manuscript were collected at the Hospital for Sick Children Structural & Biophysical Core facility supported by the Canada Foundation for Innovation and Ontario Research Fund

Affinity for the Interface Underpins Potency of Antibodies Operating In Membrane Environments

The contribution of membrane interfacial interactions to recognition of membrane-embedded antigens by antibodies is currently unclear. This report demonstrates the optimization of this type of antibodies via chemical modification of regions near the membrane but not directly involved in the recognition of the epitope. Using the HIV-1 antibody 10E8 as a model, linear and polycyclic synthetic aromatic compounds are introduced at selected sites. Molecular dynamics simulations predict the favorable interactions of these synthetic compounds with the viral lipid membrane, where the epitope of the HIV-1 glycoprotein Env is located. Chemical modification of 10E8 with aromatic acetamides facilitates the productive and specific recognition of the native antigen, partially buried in the crowded environment of the viral membrane, resulting in a dramatic increase of its capacity to block viral infection. These observations support the harnessing of interfacial affinity through site-selective chemical modification to optimize the function of antibodies that target membrane-proximal epitopes.We are grateful to Professor Ueda (Kyushu University) for valuable advice. C.D. acknowledges RES (Red Espanola de Supercomputacio ' n) for providing computational resources. S.I. received a pre-doctoral fellowship from the Basque Government. P.C. acknowledges a research associate contract from the University of the Basque Country (DOCREC18/01) and a postdoctoral fellowship from the Basque Government (POS_2018_1_0066).This study was supported by the following grants: European Commission (790012 SI H2020MSCA-IF-2017 to E.R., J.-P.J., and J.L.N.); US NIAID (NIH) (R01 AI143563 to M.B.Z.); James B. Pendleton Charitable Trust (to M.B.Z.); Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas "Chemistry for Multimolecular Crowding Biosystems, JSPS KAKENHI (JP17H06349 to A.O.); JSPS KAKENHI (15K06962 and 20H03228 to J.M.M.C.); Spanish MINECO (BIO2015-64421R and MINECO/AEI/FEDER, UE to J.L.N.); Spanish MCIU (RTI2018-095624B-C21 and MCIU/AEI/FEDER, UE to J.L.N.); and the Basque Government (IT1196-19) (to J.L.N.). C.E. acknowledges funding from Medical Research Council (MC_UU_12010/unit programs G0902418 and MC_UU_12025), Wolfson Foundation, Deutsche Forschungsgemeinschaft (Research unit 1905, Excellence Cluster Balance of the Microverse, Collaborative Research Centre 1278 Polytarget), Wellcome Institutional Strategic Support Fund, Oxford internal funds (EPA Cephalosporin Fund and John Fell Fund), and support from the Micron Oxford Advanced Bioimaging Unit (Wellcome Trust funding 107457/Z/15/Z). This research was undertaken, in part, thanks to funding from the CIFAR Azrieli Global Scholar program (to J.-P.J.) and the Canada Research Chairs program (950-231604 to J.-P.J.). This work was also supported by the Platform Project for Supporting Drug Discovery and Life Science Research (Basis for Supporting Innovative Drug Discovery and Life Science Research [BINDS] from AMED JP19am0101091)

Characterization of the HIV-1 membrane and its interactions with anti-viral compounds using advanced microscopy techniques

174 p.El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) es un retrovirus perteneciente al género Lentivirus que infecta principalmente linfocitos T CD4+. El síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) es un espectro de enfermedades causado por la infección por VIH, que interfiere con el correcto funcionamiento del sistema inmune y aumenta el riesgo de infecciones oportunistas que acaban causando la muerte del paciente. En 2016, alrededor de 36.7 millones de personas vivían infectadas por el VIH tipo 1 (VIH-1) y se produjeron cerca de 1 millón de muertes relacionadas con el SIDA.El VIH está recubierto de una bicapa lipídica adquirida de las células huésped durante la gemación. La proteína de envuelta (Env) es la única de origen viral que se expone en esta membrana. Env es responsable del reconocimiento del receptor CD4 y los correceptores CCR5 o CXCR4 en la membrana plasmática de la célula objetivo mediante la subunidad gp120 y la subsecuente fusión de las membranas celular y viral, mediada por la subunidad transmembrana gp41. Este proceso da lugar al poro de fusión por el que la cápside del virus se libera al citosol de la célula huésped. A pesar de que la envuelta lipídica es adquirida de la membrana plasmática de la célula infectada, la composición química de ambas es muy diferente, la membrana del virus se encuentra enriquecida en lípidos como el colesterol (hasta un 50% del contenido lipídico total). Por ello se ha propuesto que el virus adquiera su membrana de balsas lipídicas o lipid rafts en la membrana celular. Los rafts son nanodominios temporales enriquecidos en colesterol, esfingolípidos y ciertas proteínas a los que se les adjudica diferentes funciones gracias a la compartimentalización de elementos de la membrana plasmática. Se desconoce la razón por la que la gemación del VIH ocurre a través de estos dominios, sin embargo diferentes estudios han demostrado que la composición de la membrana viral es crítica para la infección, es decir, que la membrana juega un papel activo durante la fusión.En esta tesis se han estudiado diferentes características y procesos que ocurren a nivel de la envuelta del VIH-1 mediante técnicas de microscopía avanzada, que han permitido la cuantificación de diferentes parametros biofísicos. En primer lugar se ha analizado el grado de empaquetamiento de bicapas lipídicas en vesículas unilamelares gigantes utilizando microscopía de dos fotones de la sonda fluorescente Laurdan, que permite, mediante la función GP, cuantificar el orden molecular de una membrana. Durante la implementación de esta técnica e inicialmente como método de validación de la misma, se ha construido un diagrama de fases de GP de la mezcla lipídica DOPC:colesterol:esfingomielina. Además se han identificado ciertas fuentes de segregación lateral artefactual, que se pueden evitar mediante la excitación por dos fotones, por ejemplo, la fotooxidación. El diagrama de fases puede ser utilizado como herramienta para definir mezclas lipídicas que emulen una membrana biológica deseada.Para definir la organización y función de la membrana viral, se ha extraído el contenido lipídico de virus infectivos. Estas mezclas lipídicas han sido reconstituidas en vesículas unilamelares gigantes y monocapas Langmuir-Blodgett para analizar su grado de orden molecular y comportamiento de fases. La determinación del nivel de empaquetamiento ha permitido el desarrollo de mezclas lipídicas que emulan la membrana viral y han sido utilizadas en los capítulos posteriores como modelo de la envuelta lipídica. Mediante microscopía de fuerza atómica se ha demostrado que la membrana viral puede organizarse en nanodominios. También se ha analizado el efecto de compuestos virucidas que actúan a nivel de membrana en los citados parametros biofísicos. Los resultados obtenidos sugieren que un agente capaz de interferir con la nanoorganización de la membrana viral podría inhibir la infección.Basado en estas evidencias se ha procedido al estudio del mecanismo de inhibición mediada por péptidos derivados del dominio MPER de la proteína gp41 del VIH-1. Únicamente un péptido cuya secuencia comprende el dominio MPER y parte del dominio TMD ha presentado actividad virucida (MPER671¿693). A pesar de que otros péptidos son también capaces de alterar la nanoorganización de membranas modelo, sólo MPER671¿693 parece estructurarse en los límites de dominios lipídicos y presentar la capacidad de inducir permeabilización de membranas modelo, dos procesos que parecen estar relacionados con su actividad virucida.Por último, se ha estudiado el mecanismo de unión de anticuerpos de amplio espectro anti-MPER directamente a viriones utilizando microscopía de fluorescencia de superresolución. De este modo, se ha determinado que los anticuerpos anti-MPER y anti-gp120 reconocen el mismo tipo de agrupaciones de Env en la membrana viral. Además se ha establecido una correlación entre la unión y la neutralización en el caso de los anticuerpos anti-MPER 4E10 y 10E8, que parece depender de la capacidad de establecer interacciones con lípidos, aunque en ningún caso se ha observado una interacción directa entre 4E10 o 10E8 y la membrana viral. Experimentos de espectroscopía de correlación de fluorescencia realizados utilizando membranas modelo sugieren que la interacción entre 4E10 y la membrana es superficial e inespecífica, además de estar impedida debido al alto empaquetamiento de la envuelta lipídica.En conclusión, los estudios de microscopía avanzada realizados durante esta tesis han permitido la caracterización y mayor comprensión de la membrana del VIH-1 y del mecanismo de inhibición y neutralización de compuestos y anticuerpos anti-VIH en el contexto de la membrana viral

Characterization of the HIV-1 membrane and its interactions with anti-viral compounds using advanced microscopy techniques

174 p.El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) es un retrovirus perteneciente al género Lentivirus que infecta principalmente linfocitos T CD4+. El síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) es un espectro de enfermedades causado por la infección por VIH, que interfiere con el correcto funcionamiento del sistema inmune y aumenta el riesgo de infecciones oportunistas que acaban causando la muerte del paciente. En 2016, alrededor de 36.7 millones de personas vivían infectadas por el VIH tipo 1 (VIH-1) y se produjeron cerca de 1 millón de muertes relacionadas con el SIDA.El VIH está recubierto de una bicapa lipídica adquirida de las células huésped durante la gemación. La proteína de envuelta (Env) es la única de origen viral que se expone en esta membrana. Env es responsable del reconocimiento del receptor CD4 y los correceptores CCR5 o CXCR4 en la membrana plasmática de la célula objetivo mediante la subunidad gp120 y la subsecuente fusión de las membranas celular y viral, mediada por la subunidad transmembrana gp41. Este proceso da lugar al poro de fusión por el que la cápside del virus se libera al citosol de la célula huésped. A pesar de que la envuelta lipídica es adquirida de la membrana plasmática de la célula infectada, la composición química de ambas es muy diferente, la membrana del virus se encuentra enriquecida en lípidos como el colesterol (hasta un 50% del contenido lipídico total). Por ello se ha propuesto que el virus adquiera su membrana de balsas lipídicas o lipid rafts en la membrana celular. Los rafts son nanodominios temporales enriquecidos en colesterol, esfingolípidos y ciertas proteínas a los que se les adjudica diferentes funciones gracias a la compartimentalización de elementos de la membrana plasmática. Se desconoce la razón por la que la gemación del VIH ocurre a través de estos dominios, sin embargo diferentes estudios han demostrado que la composición de la membrana viral es crítica para la infección, es decir, que la membrana juega un papel activo durante la fusión.En esta tesis se han estudiado diferentes características y procesos que ocurren a nivel de la envuelta del VIH-1 mediante técnicas de microscopía avanzada, que han permitido la cuantificación de diferentes parametros biofísicos. En primer lugar se ha analizado el grado de empaquetamiento de bicapas lipídicas en vesículas unilamelares gigantes utilizando microscopía de dos fotones de la sonda fluorescente Laurdan, que permite, mediante la función GP, cuantificar el orden molecular de una membrana. Durante la implementación de esta técnica e inicialmente como método de validación de la misma, se ha construido un diagrama de fases de GP de la mezcla lipídica DOPC:colesterol:esfingomielina. Además se han identificado ciertas fuentes de segregación lateral artefactual, que se pueden evitar mediante la excitación por dos fotones, por ejemplo, la fotooxidación. El diagrama de fases puede ser utilizado como herramienta para definir mezclas lipídicas que emulen una membrana biológica deseada.Para definir la organización y función de la membrana viral, se ha extraído el contenido lipídico de virus infectivos. Estas mezclas lipídicas han sido reconstituidas en vesículas unilamelares gigantes y monocapas Langmuir-Blodgett para analizar su grado de orden molecular y comportamiento de fases. La determinación del nivel de empaquetamiento ha permitido el desarrollo de mezclas lipídicas que emulan la membrana viral y han sido utilizadas en los capítulos posteriores como modelo de la envuelta lipídica. Mediante microscopía de fuerza atómica se ha demostrado que la membrana viral puede organizarse en nanodominios. También se ha analizado el efecto de compuestos virucidas que actúan a nivel de membrana en los citados parametros biofísicos. Los resultados obtenidos sugieren que un agente capaz de interferir con la nanoorganización de la membrana viral podría inhibir la infección.Basado en estas evidencias se ha procedido al estudio del mecanismo de inhibición mediada por péptidos derivados del dominio MPER de la proteína gp41 del VIH-1. Únicamente un péptido cuya secuencia comprende el dominio MPER y parte del dominio TMD ha presentado actividad virucida (MPER671¿693). A pesar de que otros péptidos son también capaces de alterar la nanoorganización de membranas modelo, sólo MPER671¿693 parece estructurarse en los límites de dominios lipídicos y presentar la capacidad de inducir permeabilización de membranas modelo, dos procesos que parecen estar relacionados con su actividad virucida.Por último, se ha estudiado el mecanismo de unión de anticuerpos de amplio espectro anti-MPER directamente a viriones utilizando microscopía de fluorescencia de superresolución. De este modo, se ha determinado que los anticuerpos anti-MPER y anti-gp120 reconocen el mismo tipo de agrupaciones de Env en la membrana viral. Además se ha establecido una correlación entre la unión y la neutralización en el caso de los anticuerpos anti-MPER 4E10 y 10E8, que parece depender de la capacidad de establecer interacciones con lípidos, aunque en ningún caso se ha observado una interacción directa entre 4E10 o 10E8 y la membrana viral. Experimentos de espectroscopía de correlación de fluorescencia realizados utilizando membranas modelo sugieren que la interacción entre 4E10 y la membrana es superficial e inespecífica, además de estar impedida debido al alto empaquetamiento de la envuelta lipídica.En conclusión, los estudios de microscopía avanzada realizados durante esta tesis han permitido la caracterización y mayor comprensión de la membrana del VIH-1 y del mecanismo de inhibición y neutralización de compuestos y anticuerpos anti-VIH en el contexto de la membrana viral

Characterization of the HIV-1 membrane and its interactions with anti-viral compounds using advanced microscopy techniques

174 p.El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) es un retrovirus perteneciente al género Lentivirus que infecta principalmente linfocitos T CD4+. El síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) es un espectro de enfermedades causado por la infección por VIH, que interfiere con el correcto funcionamiento del sistema inmune y aumenta el riesgo de infecciones oportunistas que acaban causando la muerte del paciente. En 2016, alrededor de 36.7 millones de personas vivían infectadas por el VIH tipo 1 (VIH-1) y se produjeron cerca de 1 millón de muertes relacionadas con el SIDA.El VIH está recubierto de una bicapa lipídica adquirida de las células huésped durante la gemación. La proteína de envuelta (Env) es la única de origen viral que se expone en esta membrana. Env es responsable del reconocimiento del receptor CD4 y los correceptores CCR5 o CXCR4 en la membrana plasmática de la célula objetivo mediante la subunidad gp120 y la subsecuente fusión de las membranas celular y viral, mediada por la subunidad transmembrana gp41. Este proceso da lugar al poro de fusión por el que la cápside del virus se libera al citosol de la célula huésped. A pesar de que la envuelta lipídica es adquirida de la membrana plasmática de la célula infectada, la composición química de ambas es muy diferente, la membrana del virus se encuentra enriquecida en lípidos como el colesterol (hasta un 50% del contenido lipídico total). Por ello se ha propuesto que el virus adquiera su membrana de balsas lipídicas o lipid rafts en la membrana celular. Los rafts son nanodominios temporales enriquecidos en colesterol, esfingolípidos y ciertas proteínas a los que se les adjudica diferentes funciones gracias a la compartimentalización de elementos de la membrana plasmática. Se desconoce la razón por la que la gemación del VIH ocurre a través de estos dominios, sin embargo diferentes estudios han demostrado que la composición de la membrana viral es crítica para la infección, es decir, que la membrana juega un papel activo durante la fusión.En esta tesis se han estudiado diferentes características y procesos que ocurren a nivel de la envuelta del VIH-1 mediante técnicas de microscopía avanzada, que han permitido la cuantificación de diferentes parametros biofísicos. En primer lugar se ha analizado el grado de empaquetamiento de bicapas lipídicas en vesículas unilamelares gigantes utilizando microscopía de dos fotones de la sonda fluorescente Laurdan, que permite, mediante la función GP, cuantificar el orden molecular de una membrana. Durante la implementación de esta técnica e inicialmente como método de validación de la misma, se ha construido un diagrama de fases de GP de la mezcla lipídica DOPC:colesterol:esfingomielina. Además se han identificado ciertas fuentes de segregación lateral artefactual, que se pueden evitar mediante la excitación por dos fotones, por ejemplo, la fotooxidación. El diagrama de fases puede ser utilizado como herramienta para definir mezclas lipídicas que emulen una membrana biológica deseada.Para definir la organización y función de la membrana viral, se ha extraído el contenido lipídico de virus infectivos. Estas mezclas lipídicas han sido reconstituidas en vesículas unilamelares gigantes y monocapas Langmuir-Blodgett para analizar su grado de orden molecular y comportamiento de fases. La determinación del nivel de empaquetamiento ha permitido el desarrollo de mezclas lipídicas que emulan la membrana viral y han sido utilizadas en los capítulos posteriores como modelo de la envuelta lipídica. Mediante microscopía de fuerza atómica se ha demostrado que la membrana viral puede organizarse en nanodominios. También se ha analizado el efecto de compuestos virucidas que actúan a nivel de membrana en los citados parametros biofísicos. Los resultados obtenidos sugieren que un agente capaz de interferir con la nanoorganización de la membrana viral podría inhibir la infección.Basado en estas evidencias se ha procedido al estudio del mecanismo de inhibición mediada por péptidos derivados del dominio MPER de la proteína gp41 del VIH-1. Únicamente un péptido cuya secuencia comprende el dominio MPER y parte del dominio TMD ha presentado actividad virucida (MPER671¿693). A pesar de que otros péptidos son también capaces de alterar la nanoorganización de membranas modelo, sólo MPER671¿693 parece estructurarse en los límites de dominios lipídicos y presentar la capacidad de inducir permeabilización de membranas modelo, dos procesos que parecen estar relacionados con su actividad virucida.Por último, se ha estudiado el mecanismo de unión de anticuerpos de amplio espectro anti-MPER directamente a viriones utilizando microscopía de fluorescencia de superresolución. De este modo, se ha determinado que los anticuerpos anti-MPER y anti-gp120 reconocen el mismo tipo de agrupaciones de Env en la membrana viral. Además se ha establecido una correlación entre la unión y la neutralización en el caso de los anticuerpos anti-MPER 4E10 y 10E8, que parece depender de la capacidad de establecer interacciones con lípidos, aunque en ningún caso se ha observado una interacción directa entre 4E10 o 10E8 y la membrana viral. Experimentos de espectroscopía de correlación de fluorescencia realizados utilizando membranas modelo sugieren que la interacción entre 4E10 y la membrana es superficial e inespecífica, además de estar impedida debido al alto empaquetamiento de la envuelta lipídica.En conclusión, los estudios de microscopía avanzada realizados durante esta tesis han permitido la caracterización y mayor comprensión de la membrana del VIH-1 y del mecanismo de inhibición y neutralización de compuestos y anticuerpos anti-VIH en el contexto de la membrana viral