O efeito da dieta na sobrevivência e no desenvolvimento esquelético e digestivo de larvas e juvenis de peixe-zebra Danio rerio (Hamilton, 1822)

Dissertação mest., Biologia Marinha, Universidade do Algarve, 2009Zebrafish is a freshwater teleost which, due to several biological and genetic characters, has been widely used as a vertebrate model in a variety of research fields, with great potential in molecular biology. As a consequence of the increasing interest in zebrafish, the optimization of its rearing conditions becomes essential, such as the determination of a standardized feeding regime appropriate to this species’. Four different dietary regimes, composed of rotifers Brachionus sp., Artemia nauplii and inert food (Cyclop-eezeTM e BeneluxNV), were carried out. The effect of diet in zebrafish larvae and juvenile fish was evaluated by the determination of the survival and growth parameters as well as by the analysis of the development at the tissue, cellular and molecular levels in three distinct developmental stages. For that, histological, gene expression and immunohistochemical tools applied to molecular markers of the skeletal development (matrix Gla protein – mgp – and osteocalcin – oc) and digestive tract development (amylase and trypsin) were used. The assessment of bone remodeling regions and a histological analysis of the digestive system were also carried out. The obtained data suggest that rotifers are not appropriate for the larval requirements of this species, presenting the lowest survival and growth values. These data were also supported at the molecular level. Artemia nauplii and a weaning to inert food at 15 days post fertilization does not seem to be, also, an appropriate feeding regime. Comparatively, a diet composed exclusively by Artemia nauplii presented higher development-related parameters. These data suggest that this is a suitable food regime, as it has been argued by several authors. A daily mixture of foods also seems to be suitable to zebrafish healthy development. This work showed that, in zebrafish early development Artemia nauplii should used as food and could be, possibly, supplemented with other foods to obtain better results

Distinct patterns of notochord mineralization in zebrafish coincide with the localization of Osteocalcin isoform 1 during early vertebral centra formation

In chondrichthyans, basal osteichthyans and tetrapods, vertebral bodies have cartilaginous anlagen that subsequently mineralize (chondrichthyans) or ossify (osteichthyans). Chondrocytes that form the vertebral centra derive from somites. In teleost fish, vertebral centrum formation starts in the absence of cartilage, through direct mineralization of the notochord sheath. In a second step, the notochord is surrounded by somite-derived intramembranous bone. In several small teleost species, including zebrafish (Danio rerio), even haemal and neural arches form directly as intramembranous bone and only modified caudalmost arches remain cartilaginous. This study compares initial patterns of mineralization in different regions of the vertebral column in zebrafish. We ask if the absence or presence of cartilaginous arches influences the pattern of notochord sheath mineralization. Results - To reveal which cells are involved in mineralization of the notochord sheath we identify proliferating cells, we trace mineralization on the histological level and we analyze cell ultrastructure by TEM. Moreover, we localize proteins and genes that are typically expressed by skeletogenic cells such as Collagen type II, Alkaline phosphatase (ALP) and Osteocalcin (Oc). Mineralization of abdominal and caudal vertebrae starts with a complete ring within the notochord sheath and prior to the formation of the bony arches. In contrast, notochord mineralization of caudal fin centra starts with a broad ventral mineral deposition, associated with the bases of the modified cartilaginous arches. Similar, arch-related, patterns of mineralization occur in teleosts that maintain cartilaginous arches throughout the spine.Throughout the entire vertebral column, we were able to co-localize ALP-positive signal with chordacentrum mineralization sites, as well as Collagen II and Oc protein accumulation in the mineralizing notochord sheath. In the caudal fin region, ALP and Oc signals were clearly produced both by the notochord epithelium and cells outside the notochord, the cartilaginous arches. Based on immunostaining, real time PCR and oc2:gfp transgenic fish, we identify Oc in the mineralizing notochord sheath as osteocalcin isoform 1 (Oc1). Conclusions - If notochord mineralization occurs prior to arch formation, mineralization of the notochord sheath is ring-shaped. If notochord mineralization occurs after cartilaginous arch formation, mineralization of the notochord sheath starts at the insertion point of the arches, with a basiventral origin. The presence of ALP and Oc1, not only in cells outside the notochord, but also in the notochord epithelium, suggests an active role of the notochord in the mineralization process. The same may apply to Col II-positive chondrocytes of the caudalmost haemal arches that show ALP activity and Oc1 accumulation, since these chondrocytes do not mineralize their own cartilage matrix. Even without cartilaginous preformed vertebral centra, the cartilaginous arches may have an inductive role in vertebral centrum formation, possibly contributing to the distinct mineralization patterns of zebrafish vertebral column and caudal fin vertebral fusion.Peer Reviewe

Anti-osteogenic activity of cadmium in zebrafish

Among the many anthropogenic chemicals that end up in the aquatic ecosystem, heavy metals, in particular cadmium, are hazardous compounds that have been shown to affect developmental, reproductive, hepatic, hematological, and immunological functions in teleost fish. There is also evidence that cadmium disturbs bone formation and skeletal development, but data is scarce. In this work, zebrafish was used to further characterize the anti-osteogenic/osteotoxic effects of cadmium and gain insights into underlying mechanisms. Upon exposure to cadmium, a reduction of the opercular bone growth was observed in 6-days post-fertilization (dpf) larvae and an increase in the incidence of skeletal deformities was evidenced in 20-dpf post-larvae. The extent and stiffness of newly formed bone was also affected in adult zebrafish exposed to cadmium while regenerating their caudal fin. A pathway reporter assay revealed a possible role of the MTF-1 and cAMP/PKA signaling pathways in mechanisms of cadmium osteotoxicity, while the expression of genes involved in osteoblast differentiation and matrix production was strongly reduced in cadmium-exposed post-larvae. This work not only confirmed cadmium anti-osteogenic activity and identified targeted pathways and genes, but it also suggested that cadmium may affect biomechanical properties of bone.Portuguese Science and Technology Foundation (FCT) - UID/Multi/04326/2019 (CCMAR), PEst-C/MAR/LA0015/2011 (CCMAR); SFRH/BD/128634/2017 and SFRH/BD/52425/2013info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Skeletal quality in Senegalese sole: characterization of fish resulting from environmental and nutritional trials

The Senegalese sole (Solea senegalensis) is characteristic from southern Europe and Mediterranean. It has recently been adapted for aquaculture production since it is well accepted by consumers and reaches high commercial values. After the initial description of the ontogenic events of skeletogenesis, systematic evaluation of the incidence of skeletal malformations by several groups revealed high levels of skeletal deformities reaching up to 90% of the population

Quantitative assessment of the regenerative and mineralogenic performances of the zebrafish caudal fin

The ability of zebrafish to fully regenerate its caudal fin has been explored to better understand the mechanisms underlying de novo bone formation and to develop screening methods towards the discovery of compounds with therapeutic potential. Quantifying caudal fin regeneration largely depends on successfully measuring new tissue formation through methods that require optimization and standardization. Here, we present an improved methodology to characterize and analyse overall caudal fin and bone regeneration in adult zebrafish. First, regenerated and mineralized areas are evaluated through broad, rapid and specific chronological and morphometric analysis in alizarin red stained fins. Then, following a more refined strategy, the intensity of the staining within a 2D longitudinal plane is determined through pixel intensity analysis, as an indicator of density or thickness/volume. The applicability of this methodology on live specimens, to reduce animal experimentation and provide a tool for in vivo tracking of the regenerative process, was successfully demonstrated. Finally, the methodology was validated on retinoic acid-and warfarin-treated specimens, and further confirmed by micro-computed tomography. Because it is easily implementable, accurate and does not require sophisticated equipment, the present methodology will certainly provide valuable technical standardization for research in tissue engineering, regenerative medicine and skeletal biology

Integrated monitoring of mola mola behaviour in space and time

Over the last decade, ocean sunfish movements have been monitored worldwide using various satellite tracking methods. This study reports the near-real time monitoring of finescale (< 10 m) behaviour of sunfish. The study was conducted in southern Portugal in May 2014 and involved satellite tags and underwater and surface robotic vehicles to measure both the movements and the contextual environment of the fish. A total of four individuals were tracked using custom-made GPS satellite tags providing geolocation estimates of fine-scale resolution. These accurate positions further informed sunfish areas of restricted search (ARS), which were directly correlated to steep thermal frontal zones. Simultaneously, and for two different occasions, an Autonomous Underwater Vehicle (AUV) videorecorded the path of the tracked fish and detected buoyant particles in the water column. Importantly, the densities of these particles were also directly correlated to steep thermal gradients. Thus, both sunfish foraging behaviour (ARS) and possibly prey densities, were found to be influenced by analogous environmental conditions. In addition, the dynamic structure of the water transited by the tracked individuals was described by a Lagrangian modelling approach. The model informed the distribution of zooplankton in the region, both horizontally and in the water column, and the resultant simulated densities positively correlated with sunfish ARS behaviour estimator (r(s) = 0.184, p < 0.001). The model also revealed that tracked fish opportunistically displace with respect to subsurface current flow. Thus, we show how physical forcing and current structure provide a rationale for a predator's finescale behaviour observed over a two weeks in May 2014

Mechanisms of de novo bone formation in a fish model of fin regenaration

Unveiling the basis of animal tissue regeneration may contribute to the better understanding of disease mechanisms and the development of novel therapeutic strategies. Regeneration-competent animals are also valuable tools in drug discovery and for studying basic mechanisms of development. Bone is a dynamic tissue, formed and maintained through a balance between matrix deposition by osteoblasts and resorption by osteoclasts. When bone remodelling fails to homeostatic equilibrium, degenerative and dysplastic diseases may develop. Moreover, human bone is unable to completely restore structure and function after trauma. Hence, this work aimed at uncovering novel players in bone formation and patterning in an innovative system, the zebrafish regenerating caudal fin. A comprehensive set of imaging and analytical methodologies were first development and optimized to track bone formation and regeneration in a precise and timely manner throughout fin epimorphic regeneration. To gain insights into cellular and molecular programs underlying bone regeneration, the transcriptome of regenerates at distinct stages (blastema formation and regenerative outgrowth) was analysed. RNA-Seq data pointed toward a role of osteoclasts and calcitonin in ray patterning. Calcitonin-specific inhibition of osteoclast activity impaired ray bifurcation and demonstrated the central role that osteoclasts play in this process. Evidence toward calcitonin-specific regulation of osteoclast differentiation in the context of ray bifurcation, was also collected. To further study the mechanisms underlying bone formation, a swim-training regeneration model was established. In this model, bone formation during regeneration was stimulated and ray bifurcation was accelerated upon increased mechanical loading, further demonstrating the suitability of this system to investigate underlying mechanisms. This work provided valuable technical advancements for the study of bone regeneration in zebrafish and identified novel players in ray formation and patterning (i.e. bifurcation). Altogether, this work also proposes the zebrafish bifurcating fin ray as a potential model for tetrapod digit specification and associated diseases.Desvendar a base dos mecanismos de regeneração de tecidos animais poderá contribuir para compreender mecanismos de doença e desenvolver estratégias terapêuticas. Os animais capazes de regenerar órgãos e tecidos são, também, ferramentas-chave para a descoberta de fármacos e para o estudo de mecanismos básicos de desenvolvimento. O osso é um tecido altamente dinâmico, sendo formado e mantido através de um balanço entre os processos de deposição de matriz por osteoblastos e reabsorção por osteoclastos. Uma desregulação deste equilíbrio homeostático no processo de remodelação óssea pode levar a várias doenças degenerativas e displásticas. Para além disso, o osso humano, apesar de reparar, não tem a capacidade de restaurar eficientemente a estrutura e função após trauma. Ao contrário dos mamíferos, o peixe-zebra tem a capacidade de regenerar inúmeros órgãos, incluindo a barbatana caudal, que é composta por vários tipos de tecido, incluindo raios ósseos. Morfologicamente, estes raios são compostos por dois hemiraios, que são segmentados e bifurcados. Após amputação da barbatana caudal, células da epiderme migram rapidamente para cobrir o dano. Subsequentemente, células maturas abaixo do plano de amputação de-diferenciam, migram para a zona danificada, proliferam e formam uma estrutura intermédia, altamente heterogénea, designada de blastema. As células desta estrutura re-diferenciam então gradualmente, num eixo proximal-distal, para formar uma réplica funcional e estruturalmente equivalente à barbatana original. Deste modo, o objetivo principal do presente trabalho consiste na revelação de novos intervenientes na formação e padronização do osso, utilizando um sistema inovador, a barbatana caudal do peixezebra em regeneração. A constante avaliação de perfis mineralogénicos e de fenótipos de padronização dos raios em regeneração da barbatana caudal foi essencial durante todo o trabalho, de modo a concretizar os objetivos globais propostos. Neste sentido, foi inicialmente desenvolvido um vasto conjunto de metodologias laboratoriais e de análise de imagem, necessárias à visualização e ao seguimento da formação óssea. Foi primeiro desenvolvida uma metodologia para coloração vital do osso de peixe-zebra, baseada em microscopia de fluorescência e recorrendo a concentrações baixas e não tóxicas de vermelho de alizarina S (ARS). Esta metodologia, otimizada em larvas e posteriormente aplicada em barbatanas caudais em regeneração, permitiu seguir detalhadamente as estruturas ósseas mineralizadas ou em mineralização nas barbatanas e mostrou ser particularmente vantajosa em combinação com outros fluorocromos, como a proteína verde fluorescente (GFP). Efetuou-se, então, uma caracterização cronológica detalhada dos principais eventos estruturais durante a regeneração dos raios da barbatana (i.e. início de mineralização, segmentação e bifurcação), essencial para avaliar fenótipos relacionados com os tempos e padrões de formação óssea. Foram ainda desenvolvidos e otimizados vários procedimentos analíticos para avaliar as performances regenerativas e mineralogénicas de um modo preciso, testados em amostras fixadas e em espécimes vivos, e aplicados com sucesso em peixes expostos a ácido retinóico e varfarina. As ferramentas, os procedimentos e as metodologias desenvolvidas e estandardizadas no contexto deste trabalho, beneficiarão certamente a investigação nas áreas da medicina regenerativa, engenharia de tecidos e biologia do osso. Em última análise, contribuem para o estabelecimento do peixe-zebra como uma ferramenta valiosa para a descoberta de fármacos, em particular para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para doenças ósseas. De modo a obter evidências relativamente a mecanismos celulares e moleculares envolvidos na formação e padronização dos raios da barbatana caudal, foi analisado os transcriptoma de regenerados em estádios característicos de formação do blastema e proliferação celular (24 hpa – horas pós amputação), assim como de crescimento regenerativo e formação/padronização dos raios (72 hpa; início da bifurcação). De entre os genes associados a desenvolvimento esquelético, calca surgiu como o mRNA mais sobre-expresso durante a formação e padronização dos raios. Considerando a função da Calcitonina (uma hormona hipocalcémica secretada, codificada pelo gene calca) na inibição da atividade e diferenciação osteoclástica foi gerada a hipótese de que os osteoclastos estariam envolvidos na padronização dos raios ósseos. De entre os processos de padronização que ocorrem durante a morfogénese dos raios da barbatana, a bifurcação é, provavelmente, um dos que menos se conhece. Sabe-se que o Sonic hedgehog (Shh) é um regulador essencial deste processo, no entanto, é insuficiente para estabelecer a posição final da bifurcação. Uma caracterização pormenorizada do processo de bifurcação permitiu a definição de três fases distintas, mas complementares, durante este processo. Uma primeira fase – fase de divisão – é caracterizada pela divisão do raio induzida por sinalização morfogenética, como Shh. Uma segunda fase – fase de fusão – é caracterizada pela fusão dos raios segregados, mediada por osteoblastos. Finalmente, uma terceira fase – fase de determinação – é caracterizada por atividade anti-fusão para determinar a posição final da bifurcação do raio, de forma precisa. Os dados disponíveis (incluindo os descritos neste trabalho) sugerem que esta última fase de determinação poderá ser mediada por osteoclastos. Neste sentido, mostrámos a presença de osteoclastos e da enzima Trap, por eles secretada, nos locais de bifurcação. Demonstrámos também que a inibição da atividade osteoclástica com calcitonina de salmão é acompanhada por uma inibição do processo de bifurcação sem, no entanto, ser acompanhada por alterações relativas aos domínios de expressão de shh. Este trabalho aponta ainda para uma regulação endógena dos osteoclastos pela Calcitonina, durante o processo de bifurcação. Neste contexto, dados obtidos com a linha transgénica Tg(calca:Gal4), gerada no âmbito do presente trabalho, cruzada com Tg(UAS:GFP) sugerem que a Calcitonina poderá auto-regular os progenitores de osteoclastos, mantendo-os num estado indiferenciado. De acordo com esta hipótese, estas células progenitoras diferenciar-se-ão após inibição espacialmente controlada dos mecanismos da Calcitonina, regulando o recrutamento de osteoclastos maturos para os locais de bifurcação. Para além de gerar evidências acerca do papel dos osteoclastos e da Calcitonina na regulação do processo de bifurcação dos raios, este trabalho revelou um novo papel autócrino/parácrino da Calcitonina, para além da sua atividade endócrina clássica. Apesar das diferenças celulares intrínsecas entre o osso de peixe e mamíferos, as respostas adaptativas dos peixes teleósteos a alterações na carga mecânica são comparáveis às dos mamíferos, pelo que foi gerada a hipótese de que o osso em regeneração teria também a capacidade de responder e adaptar-se quando submetido a estímulos mecânicos. No seguimento do novo papel proposto para os osteoclastos durante a bifurcação dos raios, e de modo a obter dados adicionais relativamente os mecanismos de formação e padronização óssea durante a regeneração da barbatana caudal, foi desenvolvido um modelo de regeneração sob efeito de carga mecânica, baseado em treino de natação. Como descrito noutros modelos, foi observado um aumento na formação óssea durante a regeneração sob treino de natação, acompanhada de uma proximalização e/ou aceleração da bifurcação dos raios. Observou-se, simultaneamente, um aumento dos domínios de expressão de shh, um aumento do número de osteoblastos em estádios tardios e uma diminuição da atividade osteoclástica (sendo que o decréscimo da atividade osteoclástica observado nos locais de bifurcação é provavelmente devido a uma aceleração de todo o processo). Estes resultados sugerem que os efeitos do treino de natação na bifurcação dos raios poderão ser consequentes de um impacto geral nas fases de divisão, fusão e determinação, acima caracterizados. Para além dos efeitos morfológicos aqui descritos, o treino de natação permitiu ainda identificar novos potenciais intervenientes na formação e padronização dos raios da barbatana, como o ddit4 (possível regulador da osteoblastogénese e osteoclastogénese) e o btg2 (um possível interveniente no processo de regressão do tecido interdigital nos tetrápodes). Foi ainda proposto um provável envolvimento do gene legumain e de vários genes legumain-like no controlo da atividade osteoclástica durante a padronização dos raios, possivelmente através de uma relação neuronal-óssea mediada por mecanismos de mecano-transdução. Para além de demonstrar que o sistema de treino de natação é vantajoso para modelar os mecanismos de formação óssea em contextos de doença e regeneração, estes dados representam as primeiras descrições fenotípicas do osso em regeneração em função das condições biomecânicas. A maioria dos dados apresentados neste trabalho sugerem uma ligação morfológica e mecanística entre a bifurcação dos raios da barbatana e a especificação dos dígitos dos tetrápodes. De facto, para além de intermediários da via de sinalização Hedgehog, observou-se uma sobre-expressão de outros genes cruciais para a padronização dos membros e especificação dos dígitos (e.g. genes hox) durante a formação e padronização dos raios. Os dados de RNA-Seq mostraram ainda que os genes diferencialmente expressos entre os dois estádios analisados, estavam associados a várias doenças ósseas humanas, muitas das quais relacionadas com malformações dos dígitos, como a sindactilia (e.g. fusão digital). Os resultados deste trabalho evidenciam uma possível colaboração dos osteoclastos com outros tipos celulares (e.g. macrófagos) na remodelação do tecido inter-raio durante o processo de bifurcação, de modo comparável ao processo de regressão inter-digital nos membros de tetrápodes. Este trabalho proporcionou avanços técnicos valiosos para o estudo da regeneração óssea em peixe-zebra e permitiu a identificação de novos intervenientes na formação e padronização (i.e. bifurcação) dos raios ósseos da barbatana caudal. De um modo global, propõe-se a bifurcação dos raios da barbatana caudal do peixe-zebra como um potencial modelo para a especificação dos dígitos dos tetrápodes e doenças associadas.Financial support from the Portuguese Foundation for Science and Technology (FCT) through the doctoral grant PD/BD/52425/2013 from the ProRegeM PhD Programme (PD/00117/2012). This work was funded in part by the FCT and the European Commission (ERDFCOMPETE) through PEst-C/MAR/LA0015/2011 project and by the FCT through UID/Multi/04326/2013 and PTDC/MAR/112992/2009 (AQUATOX) projects. It was also partially funded by project 23000-ZEBRAFEEDS, co-financed by FEDER through PO Algarve 21 in the framework of QREN 2007-2013, by project OSTEOMAR – 16-02-01-FMP-0057, financed by the European Maritime and Fisheries Fund (EMFF/FEAMP) through the National Operational Programme MAR2020, and by the project COST ACTION FA1304 (FITFISH

The use of enhanced green fluorescent protein to track matrix Gla protein expression during zebrafish (Danio rerio) development

Matrix Gla protein (mgp), a vitamin K-dependent protein, is an important element of skeleton development as it regulates mineralization of both cartilaginous and bony structures, among others. Although mgp is found in a wide range of tissues, it is known to be expressed mostly by chondrocytes and vascular smooth muscle cells. Accordingly, inhibition of Mgp function results in over-mineralization of cartilages and growth plates and in ectopic mineralizations, particularly in the vascular system. Besides being a well characterized protein and the existence of developmental studies in zebrafish, there is still no description of monitoring mgp expression in live specimens

Skeletal development and performance of zebrafish Danio rerio (Hamilton, 1822) larvae and juvenile fish fed with different diets

The appearance of skeletal deformities is a major problem associated to intensive, large-scale culture of fish species, affecting growth, development and ultimately, survival of produced fish. Although the mechanisms working behind it are still unclear, it is known that environmental, genetic and nutritional factors play fundamental roles. Given its importance as a vertebrate model to study skeleton-related diseases, the selection of an appropriate dietary protocol is a critical step in order to diminish the nutritional effect on bone and cartilage development

Early skeletal development of meagre (Argyrosomus regius, Asso 1801)

The meagre (Argyrosomus regius) is a marine teleost with high growth rates and excellent biological characteristics for rearing, making it a proper candidate for diversification of aquaculture in Southern Europe. The description of skeletal development is essential to establish chronometric relationships between skeletal developments, types of ossification, processes and different development stages, contributing to the improvement of rearing conditions