Notch Signaling Pathway Is Activated in Motoneurons of Spinal Muscular Atrophy

Spinal muscular atrophy (SMA) is a neurodegenerative disease produced by low levels of Survival Motor Neuron (SMN) protein that affects alpha motoneurons in the spinal cord. Notch signaling is a cell-cell communication system well known as a master regulator of neural development, but also with important roles in the adult central nervous system. Aberrant Notch function is associated with several developmental neurological disorders; however, the potential implication of the Notch pathway in SMA pathogenesis has not been studied yet. We report here that SMN deficiency, induced in the astroglioma cell line U87MG after lentiviral transduction with a shSMN construct, was associated with an increase in the expression of the main components of Notch signaling pathway, namely its ligands, Jagged1 and Delta1, the Notch receptor and its active intracellular form (NICD). In the SMNΔ7 mouse model of SMA we also found increased astrocyte processes positive for Jagged1 and Delta1 in intimate contact with lumbar spinal cord motoneurons. In these motoneurons an increased Notch signaling was found, as denoted by increased NICD levels and reduced expression of the proneural gene neurogenin 3, whose transcription is negatively regulated by Notch. Together, these findings may be relevant to understand some pathologic attributes of SMA motoneurons.This work was supported by grants from Fundación Genoma España, GENAME to JL, LT and RMS, and from Instituto de Salud Carlos III-Fondo de Investigaciones Sanitarias (PI11/01047) to RMS. AG holds a postdoctoral contract from Genoma España. VC-M and AC-R have been supported by a predoctoral fellowship from “Govern de les Illes Balears, Conselleria d’Educació, Cultura i Universitats” under a program of joint financing with the European Social Fund

Cellular and molecular pathogenic mechanisms involved in experimental Spinal Muscular Atrophy

[cat] L’atròfia muscular espinal (SMA, de l’anglès Spinal Muscular Atrophy) és una malaltia neurodegenerativa que afecta a les motoneurones alfa de la medul·la espinal i és una de les principals causes genètiques de mort a la infància. La causa de la malaltia és la reducció de la proteïna per a la supervivència de la motoneurona, SMN (de l’anglès Survival Motor Neuron protein), provocada per una deleció homozigòtica o mutació específica al gen per a la supervivència de la motoneurona-1 (SMN1). Tot i que l'SMN s’expressa ubiquament, la seva mancança causa la pèrdua específica de motoneurones. Quatre funcions han estat assignades a l'SMN, tres d’elles són constitutives i necessàries per al manteniment de totes les cèl·lules, i l'altra és específica de les neurones i està relacionada amb el transport axonal de l'ARNm. S’ha descrit que la reducció d'SMN provoca alteracions en la integritat del citoesquelet. El citoesquelet d’actina juga un paper important en la migració cel·lular. A més a més, la reducció en l’expressió de l'SMN provoca defectes en la neuritogènesi de l’hipocamp, associats a alteracions en els nivells d’expressió de les proteïnes requerides per als processos de creixement cel·lular i migració. Això suggereix que la patologia de l'SMA podria estar associada a alteracions en la capacitat de migració cel·lular. A la línia cel·lular d’astroglioma humà U87MG en la que s’ha disminuït l’expressió d'SMN amb shRNA, s’ha caracteritzat l'afectació de la seva migració com a conseqüència de la reducció d'SMN. La reducció d'SMN indueix defectes en la migració cel·lular, s’observa que la via RhoA/ROCK està activada i la profilina incrementa la seva expressió. L’activació de la via RhoA/ROCK causa la fosforilació de la cadena lleugera de la miosina, proteïna que és coneguda per promoure la interacció de la miosina amb l’actina incrementant la velocitat del flux retrògrad als fil·lopodis i lamel·lipodis, procés que dificultaria la migració cel·lular. A la medul·la espinal lumbar del model murí SMNΔ7 d’SMA s’han descrit canvis patològics a les motoneurones, com la reducció del soma i la fosforilació del neurofilament, ambdós previs a la pèrdua de motoneurones a l’estadi final. En aquest model s’ha observat un increment d’astròglia al voltant de les motoneurones en l’estadi presimptomàtic, i una astrogliosi generalitzada a la medul·la espinal lumbar en l’estadi simptomàtic. Per contra, la presència de micròglia només es veu incrementada en l’estadi simptomàtic. A les motoneurones de la medul·la espinal lumbar d’aquest model a l’estadi simptomàtic, s’ha descrit una reducció dels botons presinàptics, en els quals s’ha observat un increment a la fosforilació de la cadena lleugera de la miosina. Alhora, s’ha detectat una expressió incrementada de la isoforma neuronal de l'òxid nítric sintasa a motoneurones i interneurones, però la isoforma induïble només s’ha observat a interneurones, a l'estadi simptomàtic. La via cel·lular de senyalització Notch i l’expressió incrementada dels seus lligands, Jagged i Delta, han estat àmpliament relacionades amb defectes a la neuritogènesi. A més a més, defectes a la neuritogènesi han estat directament vinculats amb la disminució d'SMN a models d'SMA. Malgrat això, la possible implicació de la via de senyalització cel·lular de Notch a la malaltia SMA no havia estat determinada. Després de la reducció d'SMN a la línia cel·lular d’astroglioma U87MG, s’han observat nivells incrementats dels lligands Jagged i Delta, del receptor Notch i del seu fragment actiu, NICD. Finalment, s’ha fet servir el model murí SMNΔ7 per a determinar si la glia o les motoneurones de la medul·la espinal lumbar presenten una activació incrementada de la via de senyalització de Notch. S’ha descrit una expressió incrementada dels lligands Jagged i Delta en astròcits en l’estadi simptomàtic. També s’han trobat nivells elevats del fragment actiu intracel·lular del receptor Notch, NICD, a motoneurones, astròglia i micròglia, associats a una expressió incrementada de Jagged i Delta a l’astròglia, en l’estadi simptomàtic. Per altra banda, s’ha observat que les motoneurones del ratolí SMNΔ7 que presenten nivells elevats del fragment actiu intracel·lular del receptor Notch, expressen menys Neurogenina, proteïna que està íntimament relacionada amb la neuritogènesi. La reducció de la proteïna SMN en models in vitro i in vivo s’ha associat amb l’activació de les vies de senyalització cel·lular RhoA/ROCK i Notch, que resulta en alteracions del citoesquelet d’actina i en la reducció de l'expressió de Neurogenina, la qual cosa provoca defectes a la migració cel·lular, pèrdua de les sinapsis a les motoneurones espinals i reducció de la mida del soma. A més a més, el procés d’astrogliosi en el ratolí SMNΔ7 podria contribuir a la creació d'un ambient perjudicial per a les motoneurones en els teixits d'SMA. Per tant, els nostres resultats suggereixen que la patogènia a l'SMA no és causada per un únic procés, sinó per la convergència de diversos processos patogènics a les motoneurones i a la glia que deriven en disfuncions de les motoneurones i posterior mort d’aquestes.[eng] Spinal muscular atrophy (SMA) is a neurodegenerative disease that affects alpha motoneurons in the spinal cord, being one of the leading genetic causes of death in childhood. The trigger of this disease is a reduction in the expression of the survival of motor neuron protein, SMN, owing to homozygous deletion or specific mutations in the survival motoneuron-1 (SMN1) gene. Although SMN is ubiquitously expressed, its lack specifically causes spinal motoneuron loss. Four functions have been assigned to SMN, three house-keeping functions, related to RNA splicing in all cells, and one neuron-specific, related to axonal transport of mRNA. SMN depletion has been described to cause alterations in cytoskeletal integrity. The actin cytoskeleton plays an important role in cell migration. Also, reduced expression of SMN induces impaired hippocampal neurogenesis, associated to alterations in the expression levels of proteins required for cell growth and migration. This suggests that alterations in cellular migration could be related to SMA. In the U87MG human astroglioma cell line depleted of SMN via shRNA, we characterized the change in migration dynamics induced by SMN depletion. We determined that SMN reduction causes reduced cell migration, associated to RhoA/ROCK signalling pathway activation and profilin overexpression. The activation of RhoA/ROCK leads to myosin light chain phosphorylation, which is known to promote interaction of myosin light chain with actin, increasing the speed of retrograde flow in filopodia and lamellipodia, thus impairing cell migration. In the lumbar spinal cord of the SMNΔ7 mouse model, we described pathological changes in motoneurons, such as soma reduction and neurofilament phosphorylation, previous to motoneuron loss at end-stage. In this model, we observed enhanced astrogliosis surrounding motoneurons at presymptomatic stage, and generalized astrogliosis in lumbar spinal cord at symptomatic stage. In contrast, microgliosis was only enhanced at symptomatic stage. In lumbar spinal cord motoneurons of this model, at symptomatic stage, we described a reduction in the number of pre-synaptic boutons, in which increased phosphorylation of myosin light chain was found. In addition, we observed increased expression of the neuronal isoform of the nitric oxide synthase in motoneurons and in interneurons, but the inducible isoform of nitric oxide synthase only was found in interneurons of the lumbar spinal cord at symptomatic stage. Notch signalling pathway and the overexpression of its ligands, Jagged and Delta, have been widely related to neuritogenesis. Moreover, neuritogenesis defects have been directly related to SMN reduction in models of SMA. However, the possible involvement of the Notch signalling pathway in the pathology of SMA has not been determined yet. After depletion of SMN in U87MG astroglioma cell line, we observed increased levels of Jagged and Delta ligands, Notch receptor and its active fragment, NICD. Thus, we used the SMNΔ7 mouse model to determine whether the glia or motoneurons in the lumbar spinal cord exhibited activation of the Notch signalling pathway. We found astroglial overexpression of Jagged and Delta ligands of Notch receptor at symptomatic stage. Increased levels of the active intracellular fragment of the Notch receptor, NICD, were also found in motoneurons, astroglia and microglia, associated to astroglial Jagged and Delta increased expression, at symptomatic stage. We observed that the motoneurons from SMNΔ7 mice at symptomatic stage, overexpressing the active fragment of Notch, expressed less Neurogenin, a protein known to be involved in neuritogenesis. The depletion of SMN protein in in vitro and in vivo models is associated to an increased activation of the RhoA/ROCK and Notch signalling pathways resulting in actin cytoskeleton disturbance and decreased Neurogenin expression, thus causing cell migration impairment, loss of synapses onto spinal motoneurons and soma reduction. In addition, the observed gliosis found in the SMNΔ7 mice could contribute to create a detrimental environment in SMA tissue. Therefore, our results suggest that SMA pathogenesis is not only a single process, but a convergence of pathogenic processes in motoneurons and glia which lead to motoneuron specific impairment and later death