Plant Molecular Farming – Integration and Exploitation of Side Streams to Achieve Sustainable Biomanufacturing

Plants have unique advantages over other systems such as mammalian cells for the production of valuable small molecules and proteins. The benefits cited most often include safety due to the absence of replicating human pathogens, simplicity because sterility is not required during production, scalability due to the potential for open-field cultivation with transgenic plants, and the speed of transient expression potentially providing gram quantities of product in less than 4 weeks. Initially there were also significant drawbacks, such as the need to clarify feed streams with a high particle burden and the large quantities of host cell proteins, but efficient clarification is now readily achieved. Several additional advantages have also emerged reflecting the fact that plants are essentially biodegradable, single-use bioreactors. This article will focus on the exploitation of this concept for the production of biopharmaceutical proteins, thus improving overall process economics. Specifically, we will discuss the single-use properties of plants, the sustainability of the production platform, and the commercial potential of different biomass side streams. We find that incorporating these side streams through rational process integration has the potential to more than double the revenue that can currently be achieved using plant-based production systems

Plant cell packs: a scalable platform for recombinant protein production and metabolic engineering

Industrial plant biotechnology applications include the production of sustainable fuels, complex metabolites and recombinant proteins, but process development can be impaired by a lack of reliable and scalable screening methods. Here, we describe a rapid and versatile expression system which involves the infusion of Agrobacterium tumefaciens into three‐dimensional, porous plant cell aggregates deprived of cultivation medium, which we have termed plant cell packs (PCPs). This approach is compatible with different plant species such as Nicotiana tabacum BY2, Nicotiana benthamiana or Daucus carota and 10‐times more effective than transient expression in liquid plant cell culture. We found that the expression of several proteins was similar in PCPs and intact plants, for example, 47 and 55 mg/kg for antibody 2G12 expressed in BY2 PCPs and N. tabacum plants respectively. Additionally, the expression of specific enzymes can either increase the content of natural plant metabolites or be used to synthesize novel small molecules in the PCPs. The PCP method is currently scalable from a microtiter plate format suitable for high‐throughput screening to 150‐mL columns suitable for initial product preparation. It therefore combined the speed of transient expression in plants with the throughput of microbial screening systems. Plant cell packs therefore provide a convenient new platform for synthetic biology approaches, metabolic engineering and conventional recombinant protein expression techniques that require the multiplex analysis of several dozen up to hundreds of constructs for efficient product and process development

Overcoming Hurdles in Downstream Processing of Tobacco-derived Biopharmaceutical Proteins

Monoklonale Antikörper (mAks) haben im vergangenen Jahrzehnt die Landschaft der biopharmazeutischen Industrie dominiert und werden diese Vormachtstellung vermutlich auch noch einige Zeit behaupten. Dies liegt an der Vielseitigkeit ihrer Einsatzmöglichkeiten, z.B. in der Krebstherapie. Typischerweise werden mAks in Säugerzellen, z.B. Chinese hamster ovary (CHO) Zellen, hergestellt. In der Folge haben sich biopharmazeutische Unternehmen auf dieses Expressionssystem fokussiert um das mittlerweile eine ganze Industrie entstanden ist. Trotzdem ist in den letzten Jahren festzustellen, dass das Interesse an Biopharmazeutika, die in Pflanzen produziert wurden, steigt. Der Grund dafür ist die wachsende Anzahl und Diversität von biopharmazeutischen Proteinen bei denen es sich neben mAks auch um proteinbasierte Toxine (z.B. Visumin aus der Mistel (Viscum album)) oder Enzyme wie Glycocerebrosidase handelt. Diese Substanzen können u.a. in der Krebstherapie oder zur Behandlung von Stoffwechselerkrankungen wie Morbus Gaucher eingesetzt werden. Im Mai 2012 erhielt eine in Karottenzellen von Protalix Biotherapeutics hergestellte Glycocerebrosidase als erstes Biopharmakum aus Pflanzen die Zulassung für die Anwendung im Menschen durch die FDA und konkurriert seither das erfolgreich mit dem in Säugerzellen produzierten Gegenstück. Zusammen mit der Veröffentlichung der ersten Richtlinien für die Herstellung von Biopharmazeutika in Pflanzen durch die regulatorischen Behörden der USA und der EU ist es wahrscheinlich, dass eine steigende Anzahl pflanzlich hergestellter Proteine in klinischen Phasen getestet und letztlich auch in den Markt eintreten werden. Entsprechend ist mit einem Bedarf an Produktionskapazitäten für diese Proteine zu rechnen, die aktuell jedoch vor allem nur in den USA vorhanden sind. Seit 2009 ist das Fraunhofer-Institut für Molekularbiologie und Angewandte Oekologie IME die einzige Einrichtung in der EU, die eine behördliche Genehmigung für die pflanzliche Herstellung von rekombinanten Proteinen für klinische Studien besitzt. Mehr als sieben Chargen des gegen HIV gerichteten mAks 2G12 wurden bereits erfolgreich hergestellt. Generell können Proteine auf zwei verschiedene Arten in Pflanzen hergestellt werden. Transiente Expression beruht auf dem Transfer der für das Produkt kodierenden DNA Sequenz in die Pflanzenzellen durch Viren oder im Prozessmaßstab häufiger verwendet durch Infiltration mit Agrobacterium tumefaciens. Diese Methode ermöglicht die Herstellung von Proteinen innerhalb von zwei Wochen nachdem ihre DNA-Sequenz bekannt ist. Außerdem sind die Produkttiter bei dieser Methode oft höher als bei transgenen Pflanzen. Letztere haben allerdings die Vorteile, dass ihr genetischer Status klar definiert ist und sogenannte Master und Working Seed Banks ähnlich den Master Cell Banks bei Zellkulturen erstellt werden können. Außerdem zeigen transgene Pflanzen sehr reproduzierbare Produktausbeuten, was günstig für die Beurteilung des Prozesses durch die Behörden sein kann, da diese Konsistenz zwischen Produktionschargen als Qualitätskriterium der Herstellungsprozesse auffassen. Weiterhin sind Prozesse die auf transgenen Pflanzen basieren einfacher zu skalieren, da im Gegensatz zur transienten Expression nicht jede Pflanze einer speziellen Behandlung unterzogen werden muss, durch die eine Produktbildung initiiert wird, sondern die Pflanzen per se das Produkt herstellen können. Entsprechend sind transgene Pflanzen gut für die Herstellung von biopharmazeutischen Proteinen im Großmaßstab geeignet. Vor allem Tabak (Nicotiana tabacum) hat sich zu einer Standardproduktionsplattform entwickelt, wobei die Zielproteine typischerweise aus der Blattmasse extrahiert werden. Bei dem resultierenden Rohextrakt (Figure I-1) handelt es sich um ein problematisches Prozessintermediat, da er nicht nur eine große Anzahl von Partikeln im Mikro- und Millimeterbereich enthält, sondern auch eine hohe Konzentration pflanzlicher Metabolite und Proteine aufweist. Während die Partikel die Kapazität von zur Klärung eingesetzten Filtern herabsetzen, können Metabolite und vor allem pflanzliche Proteine einen negativen Einfluss auf nachfolgende chromatographische Reinigungsschritte oder das Produkt haben, z.B. durch proteolytische Aktivität. Als Folge können bei pflanzenbasierten Prozessen die Produktreinigungskosten mehr als 80% der gesamten Prozesskosten ausmachen. Diese hohen Kosten haben zu Diskussionen geführt, ob pflanzlich hergestellte Biopharmazeutika überhaupt wirtschaftlich konkurrenzfähig hergestellt werden können. Daher beschäftigen sich die in dieser Dissertation beschriebenen Arbeiten mit Strategien welche die Kosten der Produktreinigung aus Pflanzen reduzieren und somit die Konkurrenzfähigkeit dieses Expressionssystems verbessern sollen. Auf der einen Seite wurde ein etablierter Filtrationsprozess optimiert, d.h. die Anzahl der Tiefenfiltrationsschritte wurde von drei auf einen reduziert. Dadurch konnten die entsprechenden Verbrauchsmittelkosten um 50% gesenkt werden während sich die Handhabung des Systems und seine Abgeschlossenheit verbesserten. Der letzte Punkt wird vor allem auch für Prozesse die auf transiente Expression zurückgreifen wichtig sein, da dort mit S1-Bakterien gearbeitet werden muss. Außerdem wurden Hitzefällungsmethoden zur Entfernung von pflanzlichen Proteinen aus Rohextrakt standardisiert und für eine Maßstabsvergrößerung vorbereitet (Figure I-2). Auf der anderen Seite wurde ein kombinierter Ansatz aus experimentellen und modellgestützten Untersuchungen verfolgt mit dem eine Datenbank der häufigsten Tabakproteine erstellt wurde welche wiederrum zur wissensbasierten Vorhersage des chromatographischen Trennverhaltens dieser Proteine genutzt wurde. Dieser Ansatz wird in Zukunft eine vereinfachte und beschleunigte Prozessentwicklung für die Reinigung von biopharmazeutischen Proteinen aus Tabakextrakt ermöglichen, was wiederrum die Wettbewerbsfähigkeit dieses Expressionssystems verbessern wird. Die erzeugten Modelle können darüber hinaus auch mit solchen der Proteinexpression kombiniert werden, wie sie für Tabak bereits etabliert wurden und so zu einer ganzheitlichen Prozessbeschreibung im Sinne eines QbD Ansatzes dienen (Figure I-3)

Simulation and optimization of nutrient uptake and biomass formation using a multi-parameter Monod-type model of tobacco BY-2 cell suspension cultures in a stirred-tank bioreactor

IntroductionTobacco (Nicotiana tabacum) cv Bright Yellow-2 (BY-2) cell suspension cultures enable the rapid production of complex protein-based biopharmaceuticals but currently achieve low volumetric productivity due to slow biomass formation. The biomass yield can be improved with tailored media, which can be designed either by laborious trial-and-error experiments or systematic, rational design using mechanistic models, linking nutrient consumption and biomass formation.MethodsHere we developed an iterative experiment-modeling-optimization workflow to gradually refine such a model and its predictions, based on collected data concerning BY-2 cell macronutrient consumption (sucrose, ammonium, nitrate and phosphate) and biomass formation. Results and discussionThe biomass formation was well predicted by an unstructured segregated mechanistic Monod-type model as long as the nutrient concentrations did not approach zero (we omitted phosphate, which was completely depleted). Multi-criteria optimization for sucrose and biomass formation indicated the best tradeoff (in a Paretian sense) between maximum biomass yield and minimum process time by reducing the initial sucrose concentration, whereas the inoculation biomass could be increased to maximize the biomass yield or minimize the process time, which we confirmed in calibration experiments. The model became inaccurate at biomass densities > 8 g L-1 dry mass when sucrose was almost depleted. We compensated for this limitation by including glucose and fructose as sucrose hydrolysis products in the model. The remaining offset between the simulation and experimental data might be resolved by including intracellular pools of sucrose, ammonium, nitrate and phosphate. Overall, we demonstrated that iterative models can be used to systematically optimize conditions for bioreactor-based processes

Innovative CEA-based plant production – from greenhouse-based apllications to vertical farming

Im Gegensatz zur Freilandkultivierung schafft „controlled environment agriculture“ (CEA) durch Einstellung spezifischer abiotischer Faktoren wie Temperatur, Luftfeuchte, CO2-Gehalt, Licht und Nährstoffkonzentration kontinuierliche und reproduzierbare Bedingungen für die Kultivierung von Pflanzen. Die häufigste Anwendung von CEA findet sich in Gewächshäusern, die jedoch aufgrund der Glasstruktur äußeren Veränderungen, wie z.B. tageszeit- und jahreszeitabhängigen Sonnenständen, unterliegen. Wird eine konstante Kultivierungsumgebung unter Ausschluss externer Störfaktoren benötigt, kommen geschlossene Pflanzenwuchskammern (sog. Phytotrone) zum Einsatz, die sich insbesondere in der Art der verfügbaren Beleuchtungsquelle (z.B. Natriumdampflampe vs. LED) und der Nettokultivierungsfläche unterscheiden. Aktuelle Entwicklungen verfolgen die vertikale Kultivierung von Pflanzen über mehrere Ebenen im geschlossenen Produktionssystem, was zu einer signifikanten Erhöhung der Produktionseffizienz bei verringertem Flächenbedarf führt und die Möglichkeit für eine lokale Pflanzenproduktion in urbanen Ballungszentren eröffnet. Auf Basis eigener Forschungsansätze aus dem Fraunhofer-Institut für Molekularbiologie und Angewandte Oekologie IME in Aachen werden exemplarisch verschiedene pflanzenbasierte Anwendungen aus den Bereichen der biopharmazeutischen Produktion (MA et al., 2015) sowie der Nahrungsmittelproduktion im Gewächshaussystem bis zum innovativen orbitropalen Vertical Farming System vorgestellt. Der Kultivierungsmaßstab kann hierbei je nach Bedarf von der Einzelpflanze mit Multiparametertestung bis zur Produktion homogener „Pflanzenbatches“ im Pilotmaßstab variieren. Darüber hinaus wird ein Ausblick auf das neue Fraunhofer IME Innovationsraumkonzept „VertiPROD“ gegeben, das den Fokus auf einen holistischen Ansatz zur Erforschung einer biobasierten vertikalen Produktion unter Berücksichtigung eines zirkulären Stoffmanagements im urbanen Umfeld legt.Im Gegensatz zur Freilandkultivierung schafft „controlled environment agriculture“ (CEA) durch Einstellung spezifischer abiotischer Faktoren wie Temperatur, Luftfeuchte, CO2-Gehalt, Licht und Nährstoffkonzentration kontinuierliche und reproduzierbare Bedingungen für die Kultivierung von Pflanzen. Die häufigste Anwendung von CEA findet sich in Gewächshäusern, die jedoch aufgrund der Glasstruktur äußeren Veränderungen, wie z.B. tageszeit- und jahreszeitabhängigen Sonnenständen, unterliegen. Wird eine konstante Kultivierungsumgebung unter Ausschluss externer Störfaktoren benötigt, kommen geschlossene Pflanzenwuchskammern (sog. Phytotrone) zum Einsatz, die sich insbesondere in der Art der verfügbaren Beleuchtungsquelle (z.B. Natriumdampflampe vs. LED) und der Nettokultivierungsfläche unterscheiden. Aktuelle Entwicklungen verfolgen die vertikale Kultivierung von Pflanzen über mehrere Ebenen im geschlossenen Produktionssystem, was zu einer signifikanten Erhöhung der Produktionseffizienz bei verringertem Flächenbedarf führt und die Möglichkeit für eine lokale Pflanzenproduktion in urbanen Ballungszentren eröffnet. Auf Basis eigener Forschungsansätze aus dem Fraunhofer-Institut für Molekularbiologie und Angewandte Oekologie IME in Aachen werden exemplarisch verschiedene pflanzenbasierte Anwendungen aus den Bereichen der biopharmazeutischen Produktion (MA et al., 2015) sowie der Nahrungsmittelproduktion im Gewächshaussystem bis zum innovativen orbitropalen Vertical Farming System vorgestellt. Der Kultivierungsmaßstab kann hierbei je nach Bedarf von der Einzelpflanze mit Multiparametertestung bis zur Produktion homogener „Pflanzenbatches“ im Pilotmaßstab variieren. Darüber hinaus wird ein Ausblick auf das neue Fraunhofer IME Innovationsraumkonzept „VertiPROD“ gegeben, das den Fokus auf einen holistischen Ansatz zur Erforschung einer biobasierten vertikalen Produktion unter Berücksichtigung eines zirkulären Stoffmanagements im urbanen Umfeld legt

Monitoring EPR Effect Dynamics during Nanotaxane Treatment with Theranostic Polymeric Micelles

Cancer nanomedicines rely on the enhanced permeability and retention (EPR) effect for efficient target site accumulation. The EPR effect, however, is highly heterogeneous among different tumor types and cancer patients and its extent is expected to dynamically change during the course of nanochemotherapy. Here the authors set out to longitudinally study the dynamics of the EPR effect upon single- and double-dose nanotherapy with fluorophore-labeled and paclitaxel-loaded polymeric micelles. Using computed tomography-fluorescence molecular tomography imaging, it is shown that the extent of nanomedicine tumor accumulation is predictive for therapy outcome. It is also shown that the interindividual heterogeneity in EPR-based tumor accumulation significantly increases during treatment, especially for more efficient double-dose nanotaxane therapy. Furthermore, for double-dose micelle therapy, tumor accumulation significantly increased over time, from 7% injected dose per gram (ID g–1) upon the first administration to 15% ID g–1 upon the fifth administration, contributing to more efficient inhibition of tumor growth. These findings shed light on the dynamics of the EPR effect during nanomedicine treatment and they exemplify the importance of using imaging in nanomedicine treatment prediction and clinical translation

Manufacturing biopharmaceutical proteins by transient expression in Nicotiana tabacum (L.)

Interest in plant derived biopharmaceuticals has increased over the last few years, and will continue to do so following the full regulatory approval of the first plant-derived pharmaceutical protein in May 2012. There have been several reports of biopharmaceutical proteins produced in intact plants by Agrobacterium-mediated transient expression. However, the variable expression levels in this system make it difficult to develop robust production processes that will achieve regulatory approval. The potential high downstream processing costs have raised questions about the economic viability of plant-based biopharmaceuticals. Both of these critical aspects have been addressed in this thesis. In the first part, parameters were identified that affected transient protein expression in tobacco plants. The quantitative impact of these parameters was determined and modeled using a design of experiments approach. The post-infiltration incubation temperature, plant and leaf age and incubation time were found to be major factors influencing protein yields and variation. Therefore, carefully controlling these parameters in future production processes will significantly reduce batch-to-batch variability and will improve compliance with regulatory guidelines. In the second part the influence of genetic elements such as promoters on the spatiotemporal expression levels was determined and summarized in predictive models. These models indicated that recombinant gene expression is not only dependent on promoters and 5'UTRs but also on the interaction between these elements. Furthermore, the models implied that a rational combination of promoters and 5'UTRs can result in balanced levels of two or more recombinant proteins throughout the duration of transient expression in plants which can improve yields of complex targets such as sIgA. The last section of this thesis focuses on the effect that plant-bacteria interactions have on the yield of transiently expressed target proteins and investigated instruments that can alter these interactions. Additionally, the models developed in this thesis can serve as the basis for a QbD concept in future processes, helping to define, evaluate and control critical process parameters