Application of polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (RFLP-PCR) in the analysis of single nucleotide polymorphisms (SNPs)

Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (RFLP-PCR) is a technique used to identify single nucleotide polymorphisms (SNPs) based on the recognition of restriction sites by restriction enzymes. RFLP-PCR is an easy-to-perform and inexpensive tool for initial analysis of SNPs potentially associated with some monogenic diseases, as well as in genotyping, genetic mapping, lineage screening, forensics and ancient DNA analysis. The RFLP-PCR method employs four steps: (1) isolation of genetic material and PCR; (2) restriction digestion of amplicons; (3) electrophoresis of digested fragments; and (4) visualisation. Despite its obsolescence and the presence of high-throughput DNA analysis techniques, it is still applied in the analysis of SNPs associated with disease entities and in the analysis of genetic variation of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). RFLP-PCR is a low-cost and low-throughput research method allowing for the analysis of SNPs in the absence of specialised equipment, and it is useful when there is a limited budget

Molekularna tipizacija tuniskih klonova vrste Myzus persicae (Hemiptera: Aphididae) pomoću mikrosatelitskih biljega

In order to assess the genetic differentiation among Tunisian clones belonging to the Myzus persicae complex (M. persicae (Sulzer), M. antirrhinii (Macchiati) and M. nicotianea Blackman), the molecular technique of microsatellites was used in this study. These markers offer sensitivity and are useful in population genetic studies of parthenogenetic organisms. Here, nine polymorphic microsatellite loci were amplified to distinguish between six parthenogenetic clones belonging to M. persicae complex collected from two different Tunisian areas. Interestingly, this technique allowed discrimination between five different genotypic classes among the six clones. Furthermore, analysis of genetic relatedness between the genotypic classes revealed that two Tunisian clones did not cluster either in M. persicae or in M. antirrhinii taxa, whereas, the four other Tunisian clones clustered into the M. persicae Sulzer taxa.U cilju utvrđivanja genetičkih razlika između tuniskih klonova kompleksa Myzus persicae (Sulzer), M. antirrhinii (Macchiati) i M. nicotianea (Blackman) upotrijebljena je molekularna mikrosatelitska tehnika. Ovi su biljezi vrlo osjetljivi i korisni u takvim istraživanjima partenogenetskih organizama. Umnoženo je devet polimorfnih lokusa mikrosatelita kako bi se razlikovalo šest partenogenetskih klonova kompleksa M. persicae sabranih u dva različita područja u Tunisu. Zanimljivo je da je ova tehnika omogućila razlikovanje između pet različitih genotipskih razreda tih šest klonova. Nadalje, analize genetičke srodnosti između genotipskih razreda pokazale su da dva tuniska klona nisu u istoj grupi niti s M. persicae, niti s M. antirrhinii, dok se četiri tuniska klona nalaze unutar vrste M. persicae Sulzer

Mapping the Naked Neck (NA) and Polydactyly (PO) mutants of the chicken with microsatellite molecular markers

The bulked segregant analysis methodology has been used to map, with microsatellite markers, two morphological mutations in the chicken: polydactyly (PO) and naked neck (NA). These autosomal mutations show partial dominance for NA, and dominance with incomplete penetrance for PO. They were mapped previously to different linkage groups of the classical map, PO to the linkage group IV and NA being linked to the erythrocyte antigen CPPP. An informative family of 70 offspring was produced by mating a sire, heterozygous for each of the mutations, to 7 dams homozygous recessive for each locus. Three DNA pools were prepared, pool PO included 20 chicks exhibiting at least one extra-toe, pool NA included 20 non-polydactyly chicks showing the typical phenotype associated with heterozygosity for the naked neck mutation, and pool NP included 20 chicks exhibiting neither of the mutant phenotypes. Typings were done on an ABI-373 automatic sequencer with 147 microsatellite markers covering most of the genome. An unbalanced distribution of sire marker alleles were detected between pool PO, and pools NA and NP, for two markers of chromosome 2p, MCW0082 and MCW0247. A linkage analysis taking into account the incomplete penetrance of polydactyly (80%) was performed with additional markers of this region and showed that the closest marker to the PO locus was MCW0071 (5 cM, lod score = 9). MCW0071 lies within the engrailed gene EN2 in the chicken. In the mouse, the homologous gene maps on chromosome 5, close to the hemimelic extra-toes mutation Hx. In the case of the NA locus, markers of chromosome 3 were selected because CPPP was mapped on this chromosome. Analysis of individual typings showed a linkage of 5.7 cM (lod score = 13) between the NA locus and ADL0237 in the distal region of chromosome 3q. These results contribute to connecting the former classical map to the molecular genetic map of the chicken, and open the way to the identification of the molecular nature of two developmental mutations of the chicken that are known to occur in many breeds of chickens

Estudo de polimorfismos do gene COX7A2L associados à doença de Alzheimer

Orientador: Ricardo Lehtonen Rodrigues de SouzaMonografia (Bacharelado) - Universidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Curso de Graduação em Ciências Biológica

Punktmutationsanalysen bei GLI3-assoziierten Krankheitsbildern: Greig Cephalopolysyndaktylie-Syndrom, Pallister-Hall-Syndrom und isolierte Polydaktylien

Für die Ausbildung der Extremitäten ist eine Vielzahl von Genen verantwortlich. Eine Schlüsselrolle in der Entstehung der anterior-posterioren Polarität der Extremitäten spielt die Sonic Hedgehog-Patched-GLI Signalkaskade (SHH-PTCH-GLI Signalkaskade). Kommt es durch Mutationen zur Fehlregulation eines der beteiligten Faktoren im SHH-Pathway, so resultieren in der Regel, aber nicht ausschließlich, Dysmorphogenesen der Gliedmaßen. Zu diesen zählen auch die in dieser Arbeit untersuchten GLI3- assoziierten Morphopathien. Verschiedene Punktmutationen konnten im humanen GLI3-Gen (7p13), das für einen Transkriptionsfaktor mit Zinkfingermotiven kodiert, detektiert werden. Bisher wurden vier autosomal-dominant vererbte Fehlbildungssyndrome GLI3-Mutationen zugeordnet: 1. Greig Cephalopolysyndaktylie-Syndrom (GCPS) 2. Pallister-Hall-Syndrom (PHS) 3. Postaxiale Polydaktylie Typ A (PAP-A) 4. Präaxiale Polydaktylie Typ IV (PPD-IV) Im Rahmen dieser Arbeit konnten die Fallzahlen der GLI3-assoziierten Morphopathien erhöht werden. Als molekulargenetische Methode kamen für die Untersuchung der Patienten-DNA die nicht-radioaktive Einzelstrang-Konformationsananlyse (SSCA) sowie die Sequenzierung zur Anwendung. Insgesamt konnten 12 Mutationen bei Patienten mit klinisch diagnostiziertem GCPS, 2 Mutationen bei Patienten mit klinisch gesichertem PHS, sowie 2 weitere Mutationen bei Patienten mit PPD-IV im GLI3-Gen identifiziert werden. Dabei betreffen 9 Mutationen den N-Terminus oder die zentralen Zinkfingermotive der DNA-bindenden Domäne des GLI3-Transkriptionsfaktors. Weitere 7 Mutationen betreffen den C-terminalen Bereich. Die Erhöhung der Fallzahlen bestätigt und ergänzt das bekannte Spektrum der GLI3-Mutationen. Mindestens 8 der 16 detektierten Mutationen führen, durch den Einbau eines vorzeitigen Stoppcodons, zu einem verkürzten Protein und somit vermutlich zum Verlust einiger oder aller Funktionen des GLI3-Transkriptionsfaktors. Der Mechanismus der Haploinsuffizienz scheint in diesen Fällen den Phänotyp zu bedingen. Dagegen kann für die 4 identifizierten Missense-Mutationen sowie für die 3 Spleißstellenmutationen keine eindeutige Aussage über die Auswirkung auf Protein-ebene und somit über den molekularen Mechanismus, der den Phänotyp bedingt, getroffen werden. Entgegen der bisher angenommen 100%igen Penetranz von GLI3-Mutationen konnte eine Mutationsübertragung über eine phänotypisch gesunde Probandin im Fall der Missense-Mutation R625W nachgewiesen werden. Vor dem Hintergrund einer nicht vollständigen Penetranz sollten in Zukunft auch seltene Sequenzvarianten auf Proteinebene hinsichtlich veränderter GLI3 Funktionen und möglicher Interaktion mit anderen Faktoren untersucht werden. Die Entstehung der unterschiedlichen Phänotypen durch Mutationen im GLI3-Gen bleibt weiterhin unklar, denn die erhobenen Daten von nunmehr annähernd 50 Mutationen lassen keine eindeutige Genotyp-Phänotyp Korrelation an Hand von Lage und Art der Mutationen zu. Zur Klärung könnten weiterführende Experimente auf funktioneller Ebene (mRNA Transkript- und Proteinebene) beitragen. Drei Punktmutationen konnten mehrfach bei unverwandten Familien identifiziert werden, jedoch ist die Häufigkeit wiederholt auftretender Mutationen zu gering, um von sogenannten Mutations-Hotspots ausgehen zu können. Daher muss auch in Zukunft die molekulare Aufklärung von Defekten das gesamte GLI3-Gen erfassen

Variabilidade do gene BCHE em amostra de afro-descendentes

Resumo: A butirilcolinesterase (BChE) é uma enzima sérica, codificada pelo gene BCHE (3q26.1- q26.2), produzida no fígado e encontrada em vários tecidos do organismo. O presente estudo investigou a variabilidade genética e haplotípica do gene BCHE em uma amostra de origem Afro-descendente, da população de Curitiba, com o objetivo de comparar as frequências encontradas com as de outras populações, a fim de tentar estabelecer a origem das mutações encontradas. As variações nos exons 1 (-116G>A), 2 (D70G e E255D) e 4 (A539T) foram investigadas por PCR-SSCA e a variação 1914A>G foi detectada na Genotipagem por Taqman. Os resultados obtidos revelam uma frequência de 4,04% ± 1,28% para a variante -116A; 1,49% ± 0,56% para a variante 209G; 3,62% ± 0,86% para a variante 765C; 19,14% ± 1,81% para a variante 1615A e 38,31% ± 2,33% para a variante 1914G. Comparações das frequências das mutações nos sítios -116 e 255 com as de outros estudos revelaram que estas diferem das encontradas na população de Curitiba. A análise haplotípica revelou os seguintes haplótipos como mais frequentes: [-116G; 209A; 765G; 1615G; 1914A] com 57,34%, [-116G; 209A; 765G; 1615G; 1914G] com 21,56% e [-116G; 209A; 765G; 1615A; 1914G] com 9,17%. As análises de desequilíbrio de ligação possibilitaram concluir que os desequilíbrios encontrados eram semelhantes aos já descritos em outros estudos, com exceção da ausência de desequilíbrio entre as mutações 209A>G e A539T e, analisando esses dados para as variantes dos nucleotídeos 765 e 1615 sugere-se que a mutação 765C tenha surgido em um cromossomo que possuía a variante 1615A

Variabilidade do gene BCHE em populações indígenas do Paraná

Resumo: Kaingang e Guarani constituem os dois maiores grupos de ameríndios que vivem no sul do Brasil. Estes grupos possuem uma origem comum nos paleo-ameríndios que colonizaram a América do Sul. Historicamente compartilham espaços geográficos entre si e mais recentemente estabeleceram contato com grupos europeus e africanos. A BChE é uma enzima colinesterase sérica produzida a partir do gene BCHE. Este gene está localizado no cromossomo 3 e possui aproximadamente 70 variantes descritas, sendo a grande maioria muito rara e/ou silenciosa. A BChE não possui uma função muito bem estabelecida, porém está relacionada com diversos aspectos fisiológicos, como: metabolismo de lipídios, co-regulação da neurotransmissão colinérgica, proliferação celular nervosa e proteção contra agentes tóxicos neurais. O presente estudo analisou três SNPs dentro do gene BCHE e quatro em torno do gene através de PCR-SSCA e Genotipagem por TaqMan. Foram genotipados 60 Kaingang e 60 M’Byá Guarani, todos da reserva indígena Rio das Cobras no estado do Paraná, Brasil. Os dados obtidos foram comparados com outras populações. Dentro do gene BCHE: o alelo mutante -116A está totalmente ausente nos ameríndios, assim como em asiáticos e africanos; o alelo mutante K está presente ancestralmente nos ameríndios; e, finalmente, o alelo mutante 1914 está significantemente menos frequente em ameríndios do que em grupos europeus, asiáticos e africanos. As frequências alélicas e a diversidade haplotípica mostraram que o tempo de divergência entre estes grupos ameríndios, Kaingang e Guarani, foi suficiente para distingui-los geneticamente. O contato entre eles e com grupos nãoameríndios não criou níveis significantes de miscigenação, provavelmente por diferenças culturais e lingüísticas. Em termos gerais há também uma variação gradual do alelo ou haplótipo mais frequente. Nos extremos estão as populações mais afastadas e isoladas geograficamente, as africanas e ameríndias, e em uma condição geralmente intermediária de variação estão as populações asiáticas e européias. Dados do consórcio HapMap apresentam exatamente esta tendência entre o grupo euro-descendente (CEU) e o grupo nigeriano (YRI) para mais de 75% de 3 milhões de SNPs analisados. Adaptações locais e efeitos mais significativos da deriva genética são, por enquanto, as principais justificativas para esta forte variação