Impedimetric antimicrobial peptide-based sensor for the early detection of periodontopathogenic bacteria

Peri-implantitis, an inflammation caused by biofilm formation, constitutes a major cause of implant failure in dentistry. Thus, the detection of bacteria at the early steps of biofilm growth represents a powerful strategy to prevent implant-related infections. In this regard, antimicrobial peptides (AMPs) can be used as effective biological recognition elements to selectively detect the presence of bacteria. Thus, the aim of the present study was to combine the use of miniaturized and integrated impedimetric transducers and AMPs to obtain biosensors with high sensitivity to monitor bacterial colonization. Streptococcus sanguinis, which is one of the most prevalent strains in the onset of periodontal diseases, was used as a model of oral bacteria. To this end, a potent AMP derived from human lactoferrin was synthesized and covalently immobilized on interdigitated electrode arrays (IDEA). X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and electrochemical impedance spectroscopy (EIS) were employed to optimize and characterize the method of immobilization. Noteworthy, the interaction of Streptococcus sanguinis with AMP-coated sensors provoked significant changes in the impedance spectra, which were univocally associated with the presence of bacteria, proving the feasibility of our method. In this regard, the developed biosensor permits to detect the presence of bacteria at concentrations starting from 101 colony forming units (CFU) mL-1 in KCl and from 102 CFU mL-1 in artificial saliva. Moreover, the system was devoid of cytotoxicity for human fibroblasts. These results indicate that the proposed approach can be effective in the detection of initial stages of biofilm formation, and may be useful in the early prevention and treatment of peri-implantitisPeer ReviewedPostprint (author's final draft

Impedimetric Sensors for Bacteria Detection

The application of electrochemical biosensors based on impedance detection has grown during the past years due to their high sensitivity and rapid response, making this technique extremely useful to detect biological interactions with biosensor platforms. This chapter is focused on the use of electrochemical impedance spectroscopy (EIS) for bacterial detection in two ways. On one hand, bacteria presence may be determined by the detection of metabolites produced by bacterial growth involving the media conductivity changes. On the other hand, faster and more selective bacterial detection may be achieved by the immobilization of bacteria on a sensor surface using biorecognition elements (antibodies, antimicrobial peptides, aptamers, etc.) and registering changes produced in the charge transfer resistance (faradic process) or interfacial impedance (nonfaradic process). Here we discuss different types of impedimetric biosensors for microbiological applications, making stress on their most important parameters, such as detection limits, detection times, selectivity, and sensitivity. The aim of the paper was to give a critical review of recent publications in the field and mark the future trends

Sensor impedimétrico para la detección de bacterias patogénicas mediante péptidos antimicrobianos

Áccesit Congreso SIBB 2015La peri-implantitis, una inflamación causada por la formación del biofilm, es una de las causas más importantes de la fallida de los implantes en odontología. Por esto, la detección de bacterias patogénicas al inicio del proceso de formación de biofilms, representa una estrategia muy potente para la prevención de las infecciones en los implantes. Entre los diferentes métodos para la detección de bacterias patogénicas, los biosensores electroquímicos, especialmente los sistemas basados en impedancia (EIS), presentan una serie de ventajas como la miniaturización, la mejora en sensibilidad y el bajo coste. En este sentido, los péptidos antimicrobianos (AMPs), conocidos como componentes del sistema inmune y con actividad hacia las bacterias, pueden ser usados para desarrollar elementos de bioreconocimiento altamente efectivos. Por lo tanto, el objetivo de este estudio es la combinación del uso de EIS y la habilidad de los AMPs para obtener biosensores con alta sensibilidad, especificidad y límites de detección muy bajos para la detección de bacterias patogénicas.Peer ReviewedAward-winnin

Cooperative population coding facilitates efficient sound-source separability by adaptation to input statistics

Our sensory environment changes constantly. Accordingly, neural systems continually adapt to the concurrent stimulus statistics to remain sensitive over a wide range of conditions. Such dynamic range adaptation (DRA) is assumed to increase both the effectiveness of the neuronal code and perceptual sensitivity. However, direct demonstrations of DRA-based efficient neuronal processing that also produces perceptual benefits are lacking. Here, we investigated the impact of DRA on spatial coding in the rodent brain and the perception of human listeners. Complex spatial stimulation with dynamically changing source locations elicited prominent DRA already on the initial spatial processing stage, the Lateral Superior Olive (LSO) of gerbils. Surprisingly, on the level of individual neurons, DRA diminished spatial tuning because of large response variability across trials. However, when considering single-trial population averages of multiple neurons, DRA enhanced the coding efficiency specifically for the concurrently most probable source locations. Intrinsic LSO population imaging of energy consumption combined with pharmacology revealed that a slow-acting LSO gain-control mechanism distributes activity across a group of neurons during DRA, thereby enhancing population coding efficiency. Strikingly, such "efficient cooperative coding" also improved neuronal source separability specifically for the locations that were most likely to occur. These location-specific enhancements in neuronal coding were paralleled by human listeners exhibiting a selective improvement in spatial resolution. We conclude that, contrary to canonical models of sensory encoding, the primary motive of early spatial processing is efficiency optimization of neural populations for enhanced source separability in the concurrent environment

Estudi dels potencials mecanismes involucrats en la carcinogènesi de l'arsènic /

Arreu del món, milions de persones estan exposades a l'arsènic. Estudis epidemiològics mostren un clar augment en la incidència de diferents tipus de càncer en aquestes poblacions. No obstant, encara existeixen molts dubtes sobre els mecanismes a través dels quals els compostos d'arsènic generen els seus efectes. L'objectiu d'aquesta tesi és aprofundir en els mecanismes d'acció de l'arsènic, tractant de revelar nous coneixements. Diversos estudis suggereixen que les espècies reactives d'oxigen (ROS) generades durant el metabolisme de l'arsènic juguen un paper principal en la carcinogènesi. Per això, un dels nostres objectius, serà avaluar el comportament del dany oxidatiu, mitjançant la tècnica del cometa, i del dany genotòxic, a través del test de micronuclis, en el DNA durant el procés de transformació tumoral in vitro. També estudiarem l'expressió dels gens As3mt i Mth1, per PCR a temps real, així com les conseqüències epigenètiques de l'exposició crònica. En aquest context, es van utilitzar fibroblasts embrionaris de ratolí (MEF) prèviament transformats durant 30 setmanes d'exposició a arsenit. Els resultats mostren que, tant el dany oxidatiu com el genotòxic augmenten fins als voltants del punt de transformació, i després disminueixen dràsticament. Curiosament, l'expressió de l'As3mt segueix el mateix patró de comportament que el dany en el DNA, mentre que l'expressió de Mth1 augmenta després del punt de transformació, sent el responsable de la disminució del dany observat, i establint-se així com un biomarcador útil en la carcinogènesi associada a l'arsènic. A més, es va observar una hipometilació global del DNA durant totes les setmanes d'exposició. D'altra banda, s'ha vist que l'exposició crònica a l'arsènic interfereix amb el funcionament de les rutes de reparació BER i NER, possiblement a causa d'inhibir la funció de determinades proteïnes. En canvi, la interacció de l'arsènic amb altres rutes de reparació no s'ha estudiat mai. Per tant, un altre punt d'interès d'aquesta tesi, serà determinar si l'arsènic es capaç d'alterar la funció de la ruta FA/BRCA. Per això, es van exposar cèl·lules a baixes concentracions de dos compostos trivalents d'arsènic, l'ATO i el 05AIII, durant dos setmanes, i després es va avaluar la resposta cel·lular enfront a diferents agents inductors d'enllaços creuats en el DNA (ICLs). Els nostres resultats indiquen que, la preexposició als compostos d'arsènic sensibilitza les cèl·lules enfront d'agents inductors d'ICLs, augmenta l'acumulació de cèl·lules en fase G2/M, redueix la quantitat de proteïna FANCD2 activa i augmenta la freqüència de micronuclis. En global, aquests resultats indiquen que exposicions ambientalment rellevants d'arsènic interfereixen en la funció normal de la ruta FA/BRCA, presentant-se per primer cop com un nou mecanisme de co- i carcinogènesi. Aquestes dades són importants per a l'ús de l'arsènic en la teràpia contra el càncer. Com que l'arsènic es capaç de sensibilitzar les cèl·lules enfront agents inductors d'ICLs, es suggereix que una combinació d'ATO i un agent inductor d'ICLs, augmentaria la resposta i milloraria els resultats, reduint els efectes secundaris associats. Per provar aquesta hipòtesi, es van tractar tres línies cel·lulars de càncer de bufeta amb una combinació d'ATO i cisplatí, un fàrmac àmpliament utilitzat. Primer es va demostrar que la teràpia combinada, era capaç d'alterar la funció de la ruta FA/BRCA en les cèl·lules de bufeta, i després es van avaluar altres punts, com la toxicitat i característiques extrínseques del fenotip tumoral. Els nostres resultats mostren que, en tots els casos, la teràpia combinada disminueix significativament la viabilitat de les cèl·lules exposades, disminueix el nombre de colònies capaces de créixer en agar tou, la velocitat de migració, la secreció de 05P, i la capacitat d'invasió de cèl·lules. De manera que, es planteja aquesta estratègia com una nova teràpia contra el càncer de bufeta on s'utilitzen concentracions de cisplatí més baixes, prevenint els seus efectes secundaris tòxics i evitant la recurrència del càncer.Inorganic arsenic is a widely spread environmental contaminant. Epidemiological data clearly show an increase in the incidence of cancer in human populations living in arsenic-rich areas, mainly of the skin, lung, bladder, liver, prostate and kidney cancers. However, the associated carcinogenic mechanisms remain incompletely characterized. Hence, the aim of this Thesis is to deeper in the mechanisms of arsenic-related effects, trying to disclose new insights. Several studies suggest that reactive oxygen species (ROS) generated during arsenic biotransformation play an important role in arsenic-related carcinogenesis. One of the goals of this Thesis is to assess the behavior of oxidative damage, by using the comet assay, and genotoxic DNA damage, by using the micronucleus assay, along the acquisition of the in vitro cancer phenotype. Expression changes of AS3MT and MTH1 genes were also evaluated by real time RT-PCR, as well as, epigenetic consequences. Thus, mouse embryonic fibroblast (MEF) cells previously transformed by 30 weeks of chronic arsenite exposure were monitored at different time-of-exposure intervals for the complete duration of the exposure. Results indicate that the oxidative and genotoxic damage of chronically exposed MEF cells increase up to the point of transformation, but drop drastically afterwards. Interestingly, As3mt expression follows the same pattern than the DNA damage, while Mth1 increases its expression after the point of transformation, rather being the responsible of the observed DNA damage decrease. In addition, a global DNA hymomethylation was observed during the complete duration of the exposure. On the other hand, chronic arsenic exposure interferences with NER and BER pathways are well documented, presumably due to the arsenic ability of inhibiting proteins, but interactions with other DNA repair pathways are poorly explored. So, another point of interest of this Thesis is to scope whether arsenic disrupts the normal function of FA/BRCA pathway. For this, cells were exposed for two weeks to subtoxic concentrations of two trivalent arsenic compounds, ATO and MMAIII, and after that the cellular response to different inducers of the studied pathway was evaluated and compared to one FA/BRCA-deficient cell line. Our results show that preexposure to the trivalent arsenic compounds sensitizes cells in front of crosslinking agents, increases accumulation of cells in G2/M phase, reduces the amount of activated FANCD2 protein and increases the micronuclei frequency. Altogether our data demonstrate for the first time that environmentally relevant arsenic exposures disrupt the normal function of the FA/BRCA pathway, displaying a novel mechanism of arsenic co- and carcinogenesis. Our data are certainly significant for the use of arsenicals in cancer therapy. As it sensitizes cells to crosslinking agents, we suggest that combination chemotherapy of ATO and a crosslinking agent would increase the response and improve outcomes by lowering the associated toxicity side effects. To prove this hypothesis, three different bladder cancer cell lines were treated with a combination of low concentrations of ATO and cisplatin, a well-known chemotherapeutic drug. After proving the altered FA/BRCA repair capacity of the bladder cancer cells treated with ATO and cisplatin, several endpoints like toxicity and extrinsic hallmarks of cancer phenotype were assessed. Our results show that combined treatments significantly decrease the viability of exposed cells in all cases. Also, we find that the ATO/cisplatin cotreatment decreases the number of colonies able to grow in soft-agar, the cell migration rate, the MMP secretion, and the cell invasion capacity. Overall a combination of ATO and cisplatin would synergistically improve the anticancer outcomes with the need of lower cisplatin doses, eventually preventing from its toxic side effects and common cancer recurrence

Copper and bezafibrate cooperate to rescue cytochrome c oxidase deficiency in cells of patients with sco2 mutations

Background: Mutations in SCO2 cause cytochrome c oxidase deficiency (COX) and a fatal infantile cardioencephalomyopathy. SCO2 encodes a protein involved in COX copper metabolism; supplementation with copper salts rescues the defect in patients’ cells. Bezafibrate (BZF), an approved hypolipidemic agent, ameliorates the COX deficiency in mice with mutations in COX10, another COX-assembly gene. Methods: We have investigated the effect of BZF and copper in cells with SCO2 mutations using spectrophotometric methods to analyse respiratory chain activities and a luciferase assay to measure ATP production.. Results: Individual mitochondrial enzymes displayed different responses to BZF. COX activity increased by about 40% above basal levels (both in controls and patients), with SCO2 cells reaching 75-80% COX activity compared to untreated controls. The increase in COX was paralleled by an increase in ATP production. The effect was dose-dependent: it was negligible with 100 μM BZF, and peaked at 400 μM BZF. Higher BZF concentrations were associated with a relative decline of COX activity, indicating that the therapeutic range of this drug is very narrow. Combined treatment with 100 μM CuCl2 and 200 μM BZF (which are only marginally effective when administered individually) achieved complete rescue of COX activity in SCO2 cells. Conclusions: These data are crucial to design therapeutic trials for this otherwise fatal disorder. The additive effect of copper and BZF will allow to employ lower doses of each drug and to reduce their potential toxic effects. The exact mechanism of action of BZF remains to be determined

Interdigitated electrode arrays (idea) impedimetric transducers for bacterial biosensing applications

La tecnologia dels biosensors, basada en dispositius analítics que combinen un bioreceptor amb una unitat de transducció, s’ha aplicat en nombroses àrees de recerca per a la detecció de diferents analits d’interès. Els bacteris, especialment els bacteris patògens, són agents biològics importants per ser detectats en diversos camps com el diagnòstic clínic, la indústria alimentària o la qualitat de l’aigua per prevenir malalties en els éssers humans. No obstant això, els bacteris també es poden utilitzar en un ampli ventall d’aplicacions; per exemple, com a indicadors biològics per determinar la toxicitat de diversos compostos. En aquesta tesi es proposa l’ús de transductors impedimètrics basats en elèctrodes de tipus interdigitat (interdigitated electrode arrays, IDEA de les sigles en anglès) com a instrument per al desenvolupament d’aplicacions biosensores bacterianes. L’espectroscòpia electroquímica d’impedància és una tècnica àmpliament estudiada per caracteritzar biosistemes perquè permet monitoritzar els fenòmens que tenen lloc a la superfície dels elèctrodes. Aquesta tècnica no requereix marcadors en el procés de transducció i pot ser usada en un mode d’operació sense marcatge addicional; així se simplifiquen els assajos de biomonitoratge. Entre els diferents tipus de transductors impedimètrics, els elèctrodes de tipus interdigitat són realment avantatjosos en termes de miniaturització, d’obtenció d’una resposta ràpida i estable o d’increment en la relació senyal-soroll. La utilització dels dispositius IDEA com a base de transducció per a un biosensor permet reduir el temps i cost per assaig. A més a més, en aquest treball es detalla i demostra l’aplicabilitat dels IDEA tridimensionals (3D-IDEA), en els quals els dígits dels elèctrodes estan separats per barreres aïllants, que permeten millorar la sensibilitat en el registre de canvis superficials si els comparem amb els IDEA convencionals per a la detecció de bactèries. Els objectius d’aquest treball són l’elaboració i la validació d’estratègies de biodetecció, estables i reproduïbles, utilitzant IDEA i 3D-IDEA per a la identificació de bacteris com a analit d’interès o bé com a element de sensat. En el primer cas, s’ha dut a terme la detecció de bacteris o endotoxines bacterianes en mostres líquides, mentre que en el segon s’ha desenvolupat un biosensor del tipus microbià. Per tal de dur-ho a terme, els dispositius IDEA s’han (bio)funcionalitzat mitjançant diverses metodologies per desenvolupar en quatre aplicacions.Biosensor technology, consisting of analytical devices that conjugate a bioreceptor with a transducer unit, has been applied in numerous research areas for the detection of different analytes of interest. Bacteria, especially pathogenic bacteria, are important targets to be sensed and identified in many fields, like clinical diagnosis, food industry or water safety, to prevent a great number of diseases in humans. However, bacteria can be employed in a wide range of beneficial applications, such as their use as biological indicators to determine the toxicity of various compounds. In this thesis, the use of impedimetric transducers based on interdigitated electrode arrays (IDEA) has been proposed as a tool for the development of bacterial biosensing applications. Electrochemical Impedance Spectroscopy is a widely studied technique to characterize biosystems because it allows to monitor electrical events occurring on the surface of electrodes. This technique does not require additional markers for the transduction and can be used in a label-free operation mode and hence simplifying the biosensing assays. Among different types of impedimetric transducers interdigitated electrodes arrays are really advantageous in terms of easy-miniaturization, fast establishment of the steady-state signal response and increased signal-to-noise ratio. The utilization of IDEA devices as a base of a biosensor transducer permits reducing the time and cost per assay. In addition, the applicability of three-dimensional IDEA (3D-IDEA) is described and demonstrated, in which the electrode digits are separated by insulating barriers, to improve the sensitivity for the registration of superficial parameters compared with standard IDEA for bacteria sensing. The main aim of this work is the elaboration and testing of robust and reproducible biosensing strategies using IDEA and 3D-IDEA impedance transducers with bacteria, as an analyte target or as a sensing element. In the first case, the detection of bacteria or bacterial endotoxins in liquid samples may be performed and, in the second one, novel microbial-based biosensors may be developed. To this end, IDEA devices have been (bio)functionalized using various grafting schemes for their use in four different applications