The Complete Genome Sequence of Thermoproteus tenax: A Physiologically Versatile Member of the Crenarchaeota

Here, we report on the complete genome sequence of the hyperthermophilic Crenarchaeum Thermoproteus tenax (strain Kra 1, DSM 2078(T)) a type strain of the crenarchaeotal order Thermoproteales. Its circular 1.84-megabase genome harbors no extrachromosomal elements and 2,051 open reading frames are identified, covering 90.6% of the complete sequence, which represents a high coding density. Derived from the gene content, T. tenax is a representative member of the Crenarchaeota. The organism is strictly anaerobic and sulfur-dependent with optimal growth at 86 degrees C and pH 5.6. One particular feature is the great metabolic versatility, which is not accompanied by a distinct increase of genome size or information density as compared to other Crenarchaeota. T. tenax is able to grow chemolithoautotrophically (CO2/H-2) as well as chemoorganoheterotrophically in presence of various organic substrates. All pathways for synthesizing the 20 proteinogenic amino acids are present. In addition, two presumably complete gene sets for NADH:quinone oxidoreductase (complex I) were identified in the genome and there is evidence that either NADH or reduced ferredoxin might serve as electron donor. Beside the typical archaeal A(0)A(1)-ATP synthase, a membrane-bound pyrophosphatase is found, which might contribute to energy conservation. Surprisingly, all genes required for dissimilatory sulfate reduction are present, which is confirmed by growth experiments. Mentionable is furthermore, the presence of two proteins (ParA family ATPase, actin-like protein) that might be involved in cell division in Thermoproteales, where the ESCRT system is absent, and of genes involved in genetic competence (DprA, ComF) that is so far unique within Archaea

Untersuchungen zur Regulation des zentralen Kohlenhydratmetabolismus von Thermoproteus tenax unter besonderer Berücksichtigung der Phosphoenolpyruvat Synthetase und Pyruvat, Phosphat Dikinase

Der Mechanismus und die komplexen Regulationsnetzwerke des zentralen Kohlenhydratmetabolismus von T. tenax stehen seit einigen Jahren im Mittelpunkt der Forschung unserer Arbeitsgruppe. Ein wesentliches Anliegen der vorliegenden Untersuchungen bestand darin, den ersten Schritt des anabolen EMP-Weges, d.h. die Synthese von Phosphoenolpyruvat (PEP) aus Pyruvat zu charakterisieren. Die Identifizierung einer PEP Synthetase (PEPS)-Aktivität in zellfreien Extrakten von T. tenax [Siebers, 1995] wurde im Zuge dieser Arbeit durch Klonierung und Sequenzierung des codierenden Gens (pps) bestätigt. Überraschenderweisende wurde zusätzlich ein Leserahmen identifiziert, der für ein bis dahin ausschließlich auf die Domänen Eucarya und Bacteria beschränktes Enzym, die Pyruvat, Phosphat Dikinase (PPDK) codiert: Dieses Enzym katalysiert in einer mit der PEPS vergleichbaren Reaktion de Interkonversion von Pyruvat und PEP. Mit dem Ziel, durch einen direkten Vergleich der katalytischen und regulativen Fähigkeiten von PEPS und PPDK diese ungewöhnliche Coexistenz zu erklären, wurden beide Enzyme heterolog in E. coli exprimiert und sowohl funktionell als auch strukturell charakterisiert. Die PEPS von T. tenax katalysiert in einer irreversiblen Reaktion die Umsetzung von Pyruvat und ATP zu PEP, AMP und P i. Durch gezielte Mutagenese konnte der Histidin-Rest an Position 406 des Enzyms als katalytisch essentieller Rest identifiziert werden, der am Phosphorylgruppen-Transfer von ATP auf Pyruvat beteiligt ist. Die aus der reversiblen Phosphorylierung des katalytischen Histidin-Restes resultierenden Isoformen der PEPS (phosphoryliert / dephosphoryliert) zeichnen sich durch unterschiedliche Mobilität in der SDS-PAGE aus. Unter nativen Bedingungen bildet die T. tenax PEPS - wie die Enzyme der hyperthermophilen Archaea P furiosus und S. marinus - einen multimeren Proteinkomplex aus.Im Gegensatz dazu liegt die mesophile E. coli PEPS als homomeres Dimer vor. Dieser Befund steht im Einklang mit der ber hyperthermophilen Organismen häufig beobachtbaren Tendenz zur Bildung höherer Oligomerisierungsformen von Enzymproteinen, die im Zusammenhang mit der Anpassung an extrem hohe Temperaturen diskutiert wird. Wie am heterolog in E. coli exprimierten Enzym untersucht, zeichnet sich PEPS durch ein großes regulatorisches Potential aus: So wirken vor allem alpha-Ketoglutarat, AMP und ADP, in geringerem Maße auch GAP, DHAP, 3-PG und P i inhibierend auf die Umsatzgeschwindigkeit des Enzyms. Die PPDK von T. tenax katalysiert die reversible Umsetzung von Pyruvat, ATP und P i zu PEP, AMP und PP i. Die enzymatische Eigenschaften der PPDK lassen allerdings eine deutliche Bevorzugung der katabolen Reaktion (Pyruvat-Synthese), die offenbar nicht auf Protein-Ebene reguliert wird, wurde für die katabole Reaktion eine Inhibierung der Umsatzgeschwindigkeit durch ATP, UDP und Glc-1-P festgestellt. Die T. tenax PPDK liegt nach vorliegenden Untersuchungen als homomeres Dimer vor und ist damit den bacterialen Enzym-Homologen ähnlicher als den PPDKs aus Pflanzen und Protozoen, die ausschließlich homomere Tetramere bilden. Mit der strukturellen und funktionellen Charakterisierung der PEPS und der ersten archaealen PPDK konnte in dieser Arbeit im unteren Abschnitt des EMP-Weges eine wichtige Schaltstelle des Kohlenhydratmetabolismus von T. tenax identifiziert werden, die über die Richtung des Kohlenstoff-Fluxes in der Zelle entscheidet. Dabei ist die PEPS aufgrund ihrer unidirektionellen Reaktion als strikt anaboles Enzym festgelegt, während die PPDK vornehmlich eine katabole Funktion innerhalb des EMP-Weges erfüllt. Beide Enzyme werden durch den Energiestatus der Zelle sowie durch verschiedene Intermediate des Kohlenhydratmetabolismus auf Proteinebene reguliert. Die katabole Reaktion der PPDK ergänzt dabei die katalytischen und regulativen Fähigkeiten der PK. Northern Blot-Analysen weisen darauf hin, daß die codierenden Gene der PEPS und PPDK während des expotentiellen Wachstums von T. tenax unter autotrophen und heterotrophen Bedingungen gleich stark exprimiert werden. Der eher überraschende Befund einer konstitutiven Expression wird damit erklärt, daß beide Enzyme bei einer Veränderung der trophischen Bedingeungen möglichst unmittelbar für die entsprechend geforderte Reaktionsrichtung zur Verfügung stehen sollten und damit ausschließlich auf Proteinebene reguliert werden. Die konstitutive Expression läßt zudem die Möglichkeit offen, daß die PEPS auch unter heterotrophen, die PPDK auch unter autotrophen Bedingungen katalytisch aktiv ist: So kann die PEPS unter heterotrophen Bedingungen möglicherweise über einen 'futile cycle' mit der PK und/oder PPDK als Ventil für überschüssige Energie wirken ('energy spilling'), während die PPDK bei einem Energie-Notstand unter autotrophen Bedingungen als 'stand-by' Enzym ATP-Synthese über den Abbau interner C-Quellen (Glykogen) erlaubt. Im Gegensatz zur logarithmischen Wachstumsphase wird in der stationären Wachstumsphase bei heterotroph gezogenen T. tenax-Zellen eine deutliche Reduktion der pps-Transskripte beobachtet, die dafür spricht, daß die Transskription des Gens unter einer übergeordneten, Wachstumsphasenabhängigen Kontrolle steht. Möglicherweise soll unter Bedingungen, die eher durch Energie-Mangel der Zelle ausgezeichnet sind und damit ein Energie-Ventil als überflüssig erscheinen lassen, die Energie für die Expression der PEPS gespart werden. In einem weiteren Projekt dieser Arbeit wurde die bis dahin unvollständige genetische Information eines acn-tpi-cis1-Genclusters durch Klonierung und Sequenzierung der flankierenden Bereiche komplettiert. Untersuchungen zur Transkriptiondes ungewöhnlichen Genclusters haben gezeigt, daß das codierende Gen der Citrat Synthase 1 als monocistronische mRNA abgelesen wird. Die verstärkte Expression von Aconitase und TIM unter heterotrophen Wachstumsbedingungen spricht dabei für eine Regulation auf Transkriptebene in Abhängigkeit von der angebotenen Kohlenstoff-Quelle. Die gemeinsame Transkription von Genen des EMP-Weges (tpi) und des TCA-Zyklus (acn) wird als starkes Indiz für eine enge funktionelle Kopplung und direkte Koordination der reversiblen Soffwechselwege gewertet

The carbon switch at the level of pyruvate and phosphoenolpyruvate in sulfolobus solfataricus P2

CITATION: Haferkamp, P., et al. 2019. The carbon switch at the level of pyruvate and phosphoenolpyruvate in sulfolobus solfataricus P2. Frontiers in Microbiology, 10:757, doi:10.3389/fmicb.2019.00757.The original publication is available at https://www.frontiersin.orgSulfolobus solfataricus P2 grows on different carbohydrates as well as alcohols, peptides and amino acids. Carbohydrates such as D-glucose or D-galactose are degraded via the modified, branched Entner–Doudoroff (ED) pathway whereas growth on peptides requires the Embden–Meyerhof–Parnas (EMP) pathway for gluconeogenesis. As for most hyperthermophilic Archaea an important control point is established at the level of triosephophate conversion, however, the regulation at the level of pyruvate/phosphoenolpyruvate conversion was not tackled so far. Here we describe the cloning, expression, purification and characterization of the pyruvate kinase (PK, SSO0981) and the phosphoenolpyruvate synthetase (PEPS, SSO0883) of Sul. solfataricus. The PK showed only catabolic activity [catalytic efficiency (PEP): 627.95 mM⁻¹s⁻¹, 70°C] with phosphoenolpyruvate as substrate and ADP as phosphate acceptor and was allosterically inhibited by ATP and isocitrate (Ki 0.8 mM). The PEPS was reversible, however, exhibited preferred activity in the gluconeogenic direction [catalytic efficiency (pyruvate): 1.04 mM⁻¹s⁻¹, 70°C] and showed some inhibition by AMP and α-ketoglutarate. The gene SSO2829 annotated as PEPS/pyruvate:phosphate dikinase (PPDK) revealed neither PEPS nor PPDK activity. Our studies suggest that the energy charge of the cell as well as the availability of building blocks in the citric acid cycle and the carbon/nitrogen balance plays a major role in the Sul. solfataricus carbon switch. The comparison of regulatory features of well-studied hyperthermophilic Archaea reveals a close link and sophisticated coordination between the respective sugar kinases and the kinetic and regulatory properties of the enzymes at the level of PEP-pyruvate conversion.https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2019.00757/fullPublisher's versio

Structure and function of a regulated archaeal triosephosphate isomerase adapted to high temperature

Triosephophate isomerase (TIM) is a dimeric enzyme in eucarya, bacteria and mesophilic archaea. In hyperthermophilic archaea, however, TIM exists as a tetramer composed of monomers that are about 10% shorter than other eucaryal and bacterial TIM monomers. We report here the crystal structure of TIM from Thermoproteus tenax, a hyperthermophilic archaeon that has an optimum growth temperature of 86 °C. The structure was determined from both a hexagonal and an orthorhombic crystal form to resolutions of 2.5 Å and 2.3 Å, and refined to R-factors of 19.7% and 21.5%, respectively. In both crystal forms, T. tenax TIM exists as a tetramer of the familiar (βα)8-barrel. In solution, however, and unlike other hyperthermophilic TIMs, the T. tenax enzyme exhibits an equilibrium between inactive dimers and active tetramers, which is shifted to the tetramer state through a specific interaction with glycerol-1-phosphate dehydrogenase of T. tenax. This observation is interpreted in physiological terms as a need to reduce the build-up of thermolabile metabolic intermediates that would be susceptible to destruction by heat. A detailed structural comparison with TIMs from organisms with growth optima ranging from 15 °C to 100 °C emphasizes the importance in hyperthermophilic proteins of the specific location of ionic interactions for thermal stability rather than their numbers, and shows a clear correlation between the reduction of heat-labile, surface-exposed Asn and Gln residues with thermoadaptation. The comparison confirms the increase in charged surface-exposed residues at the expense of polar residues

Reconstruction of the Central Carbohydrate Metabolism of Thermoproteus tenax by Use of Genomic and Biochemical Data

The hyperthermophilic, facultatively heterotrophic crenarchaeum Thermoproteus tenax was analyzed using a low-coverage shotgun-sequencing approach. A total of 1.81 Mbp (representing 98.5% of the total genome), with an average gap size of 100 bp and 5.3-fold coverage, are reported, giving insights into the genome of T. tenax. Genome analysis and biochemical studies enabled us to reconstruct its central carbohydrate metabolism. T. tenax uses a variant of the reversible Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) pathway and two different variants of the Entner-Doudoroff (ED) pathway (a nonphosphorylative variant and a semiphosphorylative variant) for carbohydrate catabolism. For the EMP pathway some new, unexpected enzymes were identified. The semiphosphorylative ED pathway, hitherto supposed to be active only in halophiles, is found in T. tenax. No evidence for a functional pentose phosphate pathway, which is essential for the generation of pentoses and NADPH for anabolic purposes in bacteria and eucarya, is found in T. tenax. Most genes involved in the reversible citric acid cycle were identified, suggesting the presence of a functional oxidative cycle under heterotrophic growth conditions and a reductive cycle for CO(2) fixation under autotrophic growth conditions. Almost all genes necessary for glycogen and trehalose metabolism were identified in the T. tenax genome

The semi-phosphorylative Entner–Doudoroff pathway in hyperthermophilic archaea: a re-evaluation

Biochemical studies have suggested that, in hyperthermophilic archaea, the metabolic conversion of glucose via the ED (Entner–Doudoroff) pathway generally proceeds via a non-phosphorylative variant. A key enzyme of the non-phosphorylating ED pathway of Sulfolobus solfataricus, KDG (2-keto-3-deoxygluconate) aldolase, has been cloned and characterized previously. In the present study, a comparative genomics analysis is described that reveals conserved ED gene clusters in both Thermoproteus tenax and S. solfataricus. The corresponding ED proteins from both archaea have been expressed in Escherichia coli and their specificity has been identified, revealing: (i) a novel type of gluconate dehydratase (gad gene), (ii) a bifunctional 2-keto-3-deoxy-(6-phospho)-gluconate aldolase (kdgA gene), (iii) a 2-keto-3-deoxygluconate kinase (kdgK gene) and, in S. solfataricus, (iv) a GAPN (non-phosphorylating glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; gapN gene). Extensive in vivo and in vitro enzymatic analyses indicate the operation of both the semi-phosphorylative and the non-phosphorylative ED pathway in T. tenax and S. solfataricus. The existence of this branched ED pathway is yet another example of the versatility and flexibility of the central carbohydrate metabolic pathways in the archaeal domain