Synthèse et développement d'analogues peptidiques photo-activables sélectifs au récepteur V1 ou V2 de la vasopressine et le développement d'anticorps sélectifs anti-V1 et anti-V2

Les récepteurs de la vasopressine (VP) ont jusqu'à tout récemment résisté aux efforts multiples d'isolements et de clonages. Un obstacle premier était l'absence de marqueurs sélectifs qui permettent un marquage efficace au préalable à l'isolation de la protéine réceptrice. Nous avons mené une étude de structure-activité d'analogues peptidiques de la vasopressine pour identifier des molécules qui sont à la fois dotées: d'un résidus photo-activable à hauts rendements, d'un résidu pour l'incorporation de l’125I, d'une haute affinité et d'une plus grande sélectivité entre V1 et V2. Parmi ces peptides, nous avons identifié deux analogues prometteurs. Le premier, [B, B dimethyl-B-mercaptopropionyl1, p-benzoylphenylalany2, VaL4, His8, D-tyr9] VP qui a un excellent pKd de 9.6 sur V1 (foie de rat) et un pKd de 6.1 sur V2 (rein de rat). La sélectivité pour le V1 est donc plus qu'un facteur 3000. Le photomarqueur est en position 2 et le site d'iodation est en position 9. Le deuxième peptide, le [B, B- cyclopenta-méthylene-B-mercaptopropionyl1, D-p-benzoylphenylalanyl2, nitrophényl3, Ile4, desGly9] VP démontre un pKd sur V2 de 8.7 et sur V1 de 6.65, donc une sélectivité de 100 fois pour le V2. Le site de radio-marquage est situé en position 3 et se fait par la méthode de Gatterman-Sandmeyer. Le premier analogue a permis d'identifier par photomarquage une protéine de masse moléculaire de 53 kDa et de 43 kDa, après déglycosylation, la masse identifiée correspond au 44.2 kDa déduit de la séquence du récepteur V1. Nos études effectuées avec des photo-marqueurs sélectifs pour les récepteurs de type V1 et V2 de la vasopressine ont été élargies grâce à l'utilisation d'anticorps à haute spécificité pour les récepteurs déjà clônés. Ces anticorps polyclônaux ont été produits par immunisation avec des nonapeptides correspondant à des fragments spécifiques de V1 ou de V2. Les fragments correspondant à des boucles extracellulaires du V1 et du V2 ont été synthétisés: V1 (194 à 203) : V-N- N-G-T-K-T-Q-D-NH2, V1 (324 à 332) : N-F-I-W-T-D-S-E-N-NH2 et V2 (183 à 191): V-G-N-G-S-G-V-F-D-NH2, V2 (297 à 305): P-E-A-P-L-E-R-P-P-NH2. Une immunisation ont été faite avec un mixotope représentant une séquence commune au V1, au V2 et au récepteur de l'oxytocine: V1 (208 à 218) \ V2 (193 à 205) \ OTR (193 à 205) : F-I-Q-P-W-G-(T\P\L)-R-A-Y-NH2. Celle-ci constitue un témoin non-discriminatif qui pourrait permettre éventuellement de déceler d'autres récepteurs de VP qui ne sont pas encore clonés. Les antigènes d'immunisation ont été produits en ajoutant un 3H-Lys additionnel en N-terminal. Les affinités se situaient entre 10 et 10 000 pM pour l'antigène de détection couplé à l'ovalbumine et une absence de réaction croisée indique une haute spécificité. Le buvardage de préparations membranaires hépatiques et rénales de rat confirme que les anticorps reconnaissent sélectivement leurs récepteurs respectifs. Des études d'immunofluorescence et de buvardage sur des cellules rénales humaines permettent de constater que les anticorps se lient sur les récepteurs humains sous leurs formes natives ou dénaturées

AQP2 is Necessary for Vasopressin- and Forskolin-Mediated Filamentous Actin Depolymerization in Renal Epithelial Cells

Remodeling of the actin cytoskeleton is required for vasopressin (VP)‐induced aquaporin 2 (AQP2) trafficking. Here, we asked whether VP and forskolin (FK)‐mediated F‐actin depolymerization depends on AQP2 expression. Using various MDCK and LLC‐PK1 cell lines with different AQP2 expression levels, we performed F‐actin quantification and immunofluorescence staining after VP/FK treatment. In MDCK cells, in which AQP2 is delivered apically, VP/FK mediated F‐actin depolymerization was significantly correlated with AQP2 expression levels. A decrease of apical membrane associated F‐actin was observed upon VP/FK treatment in AQP2 transfected, but not in untransfected cells. There was no change in basolateral actin staining under these conditions. In LLC‐PK1 cells, which deliver AQP2 basolaterally, a significant VP/FK mediated decrease in F‐actin was also detected only in AQP2 transfected cells. This depolymerization response to VP/FK was significantly reduced by siRNA knockdown of AQP2. By immunofluorescence, an inverse relationship between plasma membrane AQP2 and membrane‐associated F‐actin was observed after VP/FK treatment again only in AQP2 transfected cells. This is the first report showing that VP/FK mediated F‐actin depolymerization is dependent on AQP2 protein expression in renal epithelial cells, and that this is not dependent on the polarity of AQP2 membrane insertion

Identification of ROCK1 kinase as a critical regulator of Beclin1 mediated autophagy during metabolic stress

The Ser/Thr Rho kinase 1 (ROCK1) is known to play major roles in a wide range of cellular activities, including those involved in tumor metastasis and apoptosis. Here we identify an indispensable function of ROCK1 in metabolic stress-induced autophagy. Applying a proteomics approach, we characterize Beclin1, a proximal component of the PI(3)kinase class III lipid-kinase complex that induces autophagy, as an interacting partner of ROCK1. Upon nutrient deprivation, activated ROCK1 promotes autophagy by binding and phosphorylating Beclin1 at Thr119. This results in the specific dissociation of the Beclin1-Bcl-2 complex, without affecting the Beclin1-UVRAG interaction. Conversely, inhibition of ROCK1 activity increases Beclin1-Bcl-2 association, thus reducing nutritional stress-mediated autophagy. Genetic knockout of ROCK1 function in mice also leads to impaired autophagy as evidenced by reduced autophagosome formation. These results show that ROCK1 acts as a prominent upstream regulator of Beclin1-mediated autophagy and maintains a homeostatic balance between apoptosis and autophagy

Genomic Characterization of Patient-Derived Xenograft Models Established from Fine Needle Aspirate Biopsies of a Primary Pancreatic Ductal Adenocarcinoma and from Patient-Matched Metastatic Sites

N-of-1 trials target actionable mutations, yet such approaches do not test genomically-informed therapies in patient tumor models prior to patient treatment. To address this, we developed patient-derived xenograft (PDX) models from fine needle aspiration (FNA) biopsies (FNA-PDX) obtained from primary pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) at the time of diagnosis. Here, we characterize PDX models established from one primary and two metastatic sites of one patient. We identified an activating KRAS G12R mutation among other mutations in these models. In explant cells derived from these PDX tumor models with a KRAS G12R mutation, treatment with inhibitors of CDKs (including CDK9) reduced phosphorylation of a marker of CDK9 activity (phospho-RNAPII CTD Ser2/5) and reduced viability/growth of explant cells derived from PDAC PDX models. Similarly, a CDK inhibitor reduced phospho-RNAPII CTD Ser2/5, increased apoptosis, and inhibited tumor growth in FNA-PDX and patient-matched metastatic-PDX models. In summary, PDX models can be constructed from FNA biopsies of PDAC which in turn can enable genomic characterization and identification of potential therapies

Structural and Functional Insights into the Pilotin-Secretin Complex of the Type II Secretion System

Gram-negative bacteria secrete virulence factors and assemble fibre structures on their cell surface using specialized secretion systems. Three of these, T2SS, T3SS and T4PS, are characterized by large outer membrane channels formed by proteins called secretins. Usually, a cognate lipoprotein pilot is essential for the assembly of the secretin in the outer membrane. The structures of the pilotins of the T3SS and T4PS have been described. However in the T2SS, the molecular mechanism of this process is poorly understood and its structural basis is unknown. Here we report the crystal structure of the pilotin of the T2SS that comprises an arrangement of four α-helices profoundly different from previously solved pilotins from the T3SS and T4P and known four α-helix bundles. The architecture can be described as the insertion of one α-helical hairpin into a second open α-helical hairpin with bent final helix. NMR, CD and fluorescence spectroscopy show that the pilotin binds tightly to 18 residues close to the C-terminus of the secretin. These residues, unstructured before binding to the pilotin, become helical on binding. Data collected from crystals of the complex suggests how the secretin peptide binds to the pilotin and further experiments confirm the importance of these C-terminal residues in vivo

Caractérisation du site de liaison atypique de l'angiotensine II dans le foie de poulet

Le développement d'analogues non peptidiques de l'angiotensine II (AngII) a permis de mettre en évidence, dans différents tissus, de nouveaux sites de liaison de l'AngII dit [i.e. dits] atypiques. Ces sites de liaison montrent une bonne affinité envers l'AngII mais ne reconnaissent pas les ligands sélectifs des récepteurs AT[indice inférieur 1] et AT[indice inférieur 2] (L-158809 et PD123319). Dans cette étude, nous avons observé la présence d'un site de liaison de l'AngII atypique dans le foie de poulet (ATp). Ce site de liaison est saturable, réversible et relativement abondant (Bmax: 0.88 pmol/mg de protéine). Son affinité pour l'AngII est élevée (pK[indice inférieur D] ~ 8.13) mais il ne monte aucune affinité pour le L-158809 ou le PD123319. La liaison de l'AngII n'est pas affectée par le GTP[indice inférieur gamma]]S, un agent qui découple les récepteurs associés aux protéines G. De plus, l'ordre d'affinité des différents analogues de l'AngII sur le site ATp (AngII>AngI>AngIII>AngIV>Ang(1-7)>Ang(1-6)) est différent de celui observé sur le récepteur AT[indice inférieur 1] (AngII>AngIII>AngI>Ang(1-7)>Ang(1-6)[presque égal]AngIV) et le récepteur AT[indice inférieur 2] (AngIII[presque égal]AngII>AngI>Ang(1-7)[presque égal]Ang(1-6)[presque égal]AngIV).Le site ATp est différent du récepteur de l'AngII cloné à partir des surrénales de poulet ([indice inférieur c]AT[indice inférieur 1]) et de dinde ([indice inférieur t]AT[indice inférieur 1]). Contrairement à ces récepteurs homologues à l'AT[indice inférieur 1], le site ATp photomarqué à l'aide du [p-benzoylPhénylalanine[indice supérieur 8]]AngII apparait être une protéine non-glycosylée. Sa masse moléculaire apparente (75 [plus ou moins] 2.8 kDa) est le double de celle du récepteur [indice inférieur c]AT[indice inférieur 1] déglycosylé. Les études de structure activité des positions 1 et 8 de l'AngII ont été effectuées sur les préparations membranaires de foie de poulet (site ATp), de cortex surrénalien de boeuf (récepteur AT[indice inférieur 1]) et de myomètre humain (récepteur AT[indice inférieur 2]).Le même ordre d'affinité des différents analogues de l'AngII modifiés en position 8 ([Phe[indice supérieur 8]]AngII>[Leu[indice supérieur 8]]AngII>[Lys(NO[indice inférieur 2]-Z)[indice supérieur 8]]AngII>[Bpa[indice supérieur 8]]AngII>>[desPhe[indice supérieur 8]]AngII) a été observé chez toutes les préparations membranaires, démontrant une structure activité de la position 8 de l'AngII similaire entre le site ATp, le récepteur AT[indice inférieur 1] et le récepteur AT[indice inférieur 2]. L'étude de l'alkylation de l'amine primaire N-terminale de la [Gly[indice supérieur 1]]AngII, nous a montré une différence de structure activité de la position 1 de l'AngII entre le site ATp (Gly>>>Sar), le récepteur AT[indice inférieur 1] (Gly[presque égal]Sar>Me[indice inférieur 2]Gly>Meîndice inférieur 3]Gly) et le récepteur AT[indice inférieur 2] (Me[indice inférieur 3]Gly>>Me[indice inférieur 2]Gly>Sar>Gly). De façon inattendue, plusieurs analogues comme le [Me[indice inférieur 3]Gly[indice supérieur 1]]AngII montrent une meilleure affinité pour le récepteur AT[indice inférieur 2] que l'AngII lui-même. De plus la partie N-terminal de l'AngII semble jouer un rôle important dans la sélectivité de la liaison. Cette observation nous a mené [i.e. menés] à nous interroger sur l'influence de la portion N-terminal de l'AngII sur la liaison au récepteur AT[indice inférieur 2]. Pour éclaircir ce point, nous avons produit des librairies peptidiques par l'addition d'acide aminé en N-terminale de l'AngIV (H-Val-Tyr-Val-His-Pro-Phe-OH) pour produire des analogues de l'AngIII et subséquemment de l'AngII. Nos résultats démontrent que le [Arg[indice supérieur 1]]AngIII ou l'AngIII est le meilleur inhibiteur de la liaison de l'AngII sur le récepteur AT[indice inférieur 2]. L'addition d'acides aminés différents en N-terminal de l'AngIII ne semble pas influencer significativement son potentiel inhibiteur. Cette observation jette un doute sur la nature du ligand naturel du récepteur AT[indice inférieur 2]. Malgré l'abondance du site ATp et sa large distribution dans les tissus associés aux fonctions vasculaires telles que les surrénales, le coeur et les artères, aucun rôle sur l'homéostasie de la pression sanguine n'a été montré pour le site ATp dans nos études in vivo en utilisant un modèle animal de pression sanguine.Le rôle physiologique et la nature biochimique du site ATp reste donc à élucider

Impaired AQP2 trafficking in Fxyd1 knockout mice: A role for FXYD1 in regulated vesicular transport

The final adjustment of urine volume occurs in the inner medullary collecting duct (IMCD), chiefly mediated by the water channel aquaporin 2 (AQP2). With vasopressin stimulation, AQP2 accumulation in the apical plasma membrane of principal cells allows water reabsorption from the lumen. We report that FXYD1 (phospholemman), better known as a regulator of Na,K-ATPase, has a role in AQP2 trafficking. Daytime urine of Fxyd1 knockout mice was more dilute than WT despite similar serum vasopressin, but both genotypes could concentrate urine during water deprivation. FXYD1 was found in IMCD. In WT mice, phosphorylated FXYD1 was detected intracellularly, and vasopressin induced its dephosphorylation. We tested the hypothesis that the dilute urine in knockouts was caused by alteration of AQP2 trafficking. In WT mice at baseline, FXYD1 and AQP2 were not strongly co-localized, but elevation of vasopressin produced translocation of both FXYD1 and AQP2 to the apical plasma membrane. In kidney slices, baseline AQP2 distribution was more scattered in the Fxyd1 knockout than in WT. Apical recruitment of AQP2 occurred in vasopressin-treated Fxyd1 knockout slices, but upon vasopressin washout, there was more rapid reversal of apical AQP2 localization and more heterogeneous cytoplasmic distribution of AQP2. Notably, in sucrose gradients, AQP2 was present in a detergent-resistant membrane domain that had lower sedimentation density in the knockout than in WT, and vasopressin treatment normalized its density. We propose that FXYD1 plays a role in regulating AQP2 retention in apical membrane, and that this involves transfers between raft-like membrane domains in endosomes and plasma membranes