Influence of mitochondria origin on fruit quality in a citrus cybrid.

International audienceSugar, organic acid, and carotenoid are the most important indicators of fruit taste and nutritional and organoleptic quality. These components were studied on fruit pulp of the cybrid between Willow leaf mandarin ( Citrus deliciosa Ten.) and Eureka lemon [ Citrus limon (L.) Burm.] and the two parents. The cybrid possessed nuclear and chloroplast genomes of Eureka lemon plus mitochondria from Willow leaf mandarin. The impact of new mitochondria on fruit quality was studied during the mature period. Levels of organic acids were slightly higher in the cybrid fruit pulp than in Eureka lemon. No significant difference in sugar and carotenoid content was observed between the cybrid and the lemon. Results confirm that the main genetic information for the biosynthesis of sugars, organic acids, and carotenoids is contained in the nucleus. In Citrus, cybridization can be used as a strategy to breed specific traits associated with mitochondrial genomes, such as male sterility, without affecting the main organoleptic and nutritional qualities

A lipoxygenase with dual positional specificity is expressed in olives (Olea europaea L.) during ripening.

International audiencePlant lipoxygenases (LOXs) are a class of widespread dioxygenases catalysing the hydroperoxidation of polyunsaturated fatty acids. Although multiple isoforms of LOX have been detected in a wide range of plants, their physiological roles remain to be clarified. With the aim to clarify the occurrence of LOXs in olives and their contribution to the elaboration of the olive oil aroma, we cloned and characterized the first cDNA of the LOX isoform which is expressed during olive development. The open reading frame encodes a polypeptide of 864 amino acids. This olive LOX is a type-1 LOX which shows a high degree of identity at the peptide level towards hazelnut (77.3%), tobacco (76.3%) and almond (75.5%) LOXs. The recombinant enzyme shows a dual positional specificity, as it forms both 9- and 13-hydroperoxide of linoleic acid in a 2:1 ratio, and would be defined as 9/13-LOX. Although a LOX activity was detected throughout the olive development, the 9/13-LOX is mainly expressed at late developmental stages. Our data suggest that there are at least two Lox genes expressed in black olives, and that the 9/13-LOX is associated with the ripening and senescence processes. However, due to its dual positional specificity and its expression pattern, its contribution to the elaboration of the olive oil aroma might be considered

Nutrient Deficiency Tolerance in Citrus Is Dependent on Genotype or Ploidy Level

Plants require essential minerals for their growth and development that are mainly acquired from soil by their roots. Nutrient deficiency is an environmental stress that can seriously affect fruit production and quality. In citrus crops, rootstock/scion combinations are frequently employed to enhance tolerance to various abiotic stresses. These tolerances can be improved in doubled diploid genotypes. The aim of this work was to compare the impact of nutrient deficiency on the physiological and biochemical response of diploid (2x) and doubled diploid (4x) citrus seedlings: Volkamer lemon, Trifoliate orange × Cleopatra mandarin hybrid, Carrizo citrange, Citrumelo 4475. Flhorag1 (Poncirus trifoliata + and willow leaf mandarin), an allotetraploid somatic hybrid, was also included in this study. Our results showed that depending on the genotype, macronutrient and micronutrient deficiency affected certain physiological traits and oxidative metabolism differently. Tetraploid genotypes, mainly Flhorag1 and Citrumelo 4475, appeared resistant compared to the other genotypes as indicated by the lesser decrease in photosynthetic parameters (Pnet, Fv/Fm, and Gs) and the lower accumulation of oxidative markers (MDA and H2O2) in roots and leaves, especially after long-term nutrient deficiency. Their higher tolerance to nutrient deficiency could be explained by better activation of their antioxidant system. For the other genotypes, tetraploidization did not induce greater tolerance to nutrient deficiency

Recherche de molécules antibactériennes et caractérisation de leurs modes d action

L extension des résistances bactériennes aux antibiotiques est un problème majeur de la médecine contemporaine. Paradoxalement, peu de nouveaux antibiotiques ont été mis sur le marché ces dernières décennies, nous ramenant quasiment à l ère pré-antibiotique. La découverte de nouvelles molécules antibactériennes est donc primordiale. Nous avons recherché dans les plantes, et plus particulièrement dans leurs huiles essentielles, des molécules susceptibles d inhiber la croissance de bactéries pathogènes. Pour cela, nous avons testé 28 huiles essentielles, par diffusion par disque et mesure de la concentration minimale inhibitrice, afin de caractériser leurs activités antibactériennes. Les huiles actives ont été ensuite fractionnées chimiquement afin d isoler les molécules responsables de ces activités. Les caractéristiques structurales nécessaires à leurs activités ont été définies par comparaison avec les activités de molécules analogues commerciales. Enfin, sur deux huiles, Inula graveolens et Santolina corsica, qui se sont révélées particulièrement efficaces contre Staphylococcus aureus, les modes d action ont donc été étudiés, par mesure de la décroissance de population bactériennes traitées, par recherche d effets bactériolytiques et par observations en microscopie électronique à transmission des effets de ces huiles sur l ultrastructure bactérienne. Ces deux huiles essentielles bactéricides n entraînent pas de bactériolyse et semblent agir sur la paroi bactérienne.The rise of antibiotic-resistant infection is a major concern of modern medecine. However, few new antibiotics have been launched these last decades, leading us to a pre-antibiotic era. The discovery of new antibacterial molecules is necessary. We have looked for molecules able to inhibit pathogen bacteria growth extracted from plant essential oils. In this way, 28 essential oils were tested for their antibacterial activity by disc diffusion assay and determination of the minimal inhibition concentration. Then essential oils were chemically fractionated in order to isolate the molecules involved in antibacterial activity. Important structural features accounting for activity were identified by using commercially available structural analogues. Finallly, the action mode of two interesting essential oils, Inula graveolens and Santolina corsica, was explored by time-kill assays, search of bacteriolytic effects and transmission electron microscopy . These two bactericidal essential oils didn t showed bacteriolysis effect and seemed to act on the cell wall.CORTE-BU (200962101) / SudocSudocFranceF

Structure et diversité génétique de l'olivier (olea europaea L.) en Tunisie

L'olivier Olea europaea L.ssp europaea est un arbre symbolique et omniprésent dans la flore tunisienne depuis des millénaires à l'état sauvage (var. sylvestris) ou cultivé (var. europaea). Afin d'étudier la structure de la diversité génétique et de déterminer l'origine de l'olivier tunisien, nous avons effectué des analyses moléculaires des oliviers tunisiens (lOI accessions et 20 formes sauvages) et d'autres oliviers de l'Est et de l'Ouest de la Méditerranée (27 cultivars et 10 formes sauvages). L'analyse des lOI accessions d'olivier tunisien, par les techniques de RAPD et SSR, a révélé 75 profils RAPD, dont 25 ont été confirmés par le génotypage SSR. Les 50 restants, sont classés dans 17 profils SSR. Ces résultats montrent que le germoplasme d'olivier tunisien est diversifié. En conclusion, 41 génotypes ont été déterminés et retenus pour l'établissement d'une base de données moléculaires de référence représentant l'essentiel de la diversité et permettant la construction d'une Core collection . Quatre approches statistiques, l'analyse multivariée (AFe), la classification hiérarchique basée sur les distances génétiques, l'inférence baysienne et l'analyse de la variance moléculaire (AMOY A), ont été utilisées pour déterminer la corrélation entre l'apport de chacune des deux approches nucléaires (RAPD et SSR). La comparaison montre une corrélation des résultats qualitatifs, mais les valeurs quantitatives diffèrent. En se basant sur les données nucléaires RAPD et SSR, deux niveaux de structure ont été révélés: (i) les cultivars et les oléastres ont été séparés en deux groupes distincts; (ii) quatre groupes faiblement différenciés, correspondant à deux groupes de cultivars et deux groupes d'oléastres, ont été détectés. Ces résultat ont montré une divergence Est-Ouest des cultivars et ont révélé deux types de formes sauvages en Tunisie: des oléastres vrais et des formes férales. En se basant sur le polymorphisme de l'ADN nucléaire et de l'ADN chloroplastique, l'origine des variétés d'olivier tunisien a été déterminée. Ainsi, les variétés groupées avec les cultivars de l'Est et portant le chlorotype spécifique de l'Est (CEl ou CE2) sont probablement des variétés introduites de l'Est. Les variétés groupées avec des oléastres et portant un chlorotype de l'Ouest (COM 1, COM2 ou CCK) sont des variétés sélectionnées localement. Dans ce groupe, les variétés possédant un chlorotype Est sont probablement issus d'introgression entre pool génétique local et les variétés introduites. Ces résultats suggèrent différents événements de domestication et une origine multiple et complexe de l'olivier tunisien.The olive Olea europaea L.ssp europaea is an emblematic tree in Tunisia. Both wild (var. sylvestris ) and cultivars (var. europaea) forms ofthis tree are omnipresent since thousands ofyears. This olive germplasm is diversified but little is known about its origin. ln order to study the genetic structure and to determine the origin of Tunisian olives, we performed molecular analysis of olive trees sam pied inTunisia (lOI accessions and 20 wild forms) and in Estern and Western Medeterranean (27 cultivars and 10 wild forms). The analysis of the lOI Tunisian olive accessions with RAPDs and SSRs revealed 75 RAPD phenotypes from which 25 were confirmed with SSR genotyping. The 50 remaining ones were c1assified into 17 SSR genotypes. These results showed that tunisian olive germplasm is diversified. ln conclusion, 41 genotypes were determined and retained for the establishment of molecular reference data base that represent the sum of diversity and enable the construction of core collection . Genetic structure ofthese varieties in comparison with the other olive trees sam pied in this study was investigated with both RAPD and SSR data. Four statistical approaches (multivariate analysis (AFe), distance based hierarchical c1ustering, Bayesian inference and analysis of molecular variance (AMOY A)) were used. RAPD and SSR data were analysed in the same manner to determine correlation between these two nuclear approaches. Comparisons showed correlation in qualitative results but quantitative values differed according to the method of analysis. Based on nuclear SSR and RAPD data, two levels of structure were revealed: first: cultivars and oleasters were separated in two distinct groups; second, four less differentiated c1usters, corresponded to two groups of cultivars and two groups of oleasters, were detected. These results showed an East-West divergence of olive cultivars and revealed two wild forms in Tunisia: true oleasters and ferai forms. Based on nuclear and plastid data the origin ofTunisian olive varieties was investigated. Thus, varieties which displayed a chlorotype specific to the Eastern Mediterranean (CE 1 or CE2) and c1ustered with cultivars from the East are probably varieties introduced from the East. Yarieties grouped with oleasters and displayed a chlorotype of the Western Mediterranean (COMI, COM2 or CCK) are locally selected varieties. ln this group, varieties with the Eastern Mediterranean chlorotype are probably the result of introgression between local genetic pool and introduced varieties. These results suggest different domestication events and a multiple and complex origin of Tunisian cultivars.CORTE-BU (200962101) / SudocSudocFranceF

Caractérisation et rôle des enzymes impliquées dans les qualités organoleptiques de l'huile d'olive

La "voie de la lipoxygénase" est activée dans la plante en réponse à un stress environnemental (blessures, attaque de pathogènes, sécheresse,...) ou durant certaines étapes du développement de la plante (floraison, sénescence,...). Elle doit son nom à la première enzyme intervenant dans la cascade réactionnelle, la lipoxygénase, qui catalyse la formation d'hydroperoxydes à partir d'acides gras libres: l'acide linoléique et l'acide linolénique dans la plante. Ces hydroperoxydes peuvent ensuite être transformés par différentes enzymes pour former des composés impliqués dans des voies de signalisation et de défense. Nous avons étudié plus précisément la voie enzymatique de formation des composés volatils à six atomes de carbone dans l'olive car ces composés participent également à la qualité organoleptique de l'huile d'olive. D'une part, nous avons mis en évidence l'influence de la variété et du stade de maturation des olives sur l'activité enzymatique de la lipoxygénase et de l'hydroperoxyde lyase. De plus, la quantité de composés volatils à six atomes de carbone formés dans le fruit varie en fonction de l'activité enzymatique de la lipoxygénase. D'autre part, nous avons entrepris la purification de la lipoxygénase de pulpe d'olive. Le protocole mis au point au laboratoire se déroule en trois étapes au bout desquelles 4,7 mg d'enzyme purifiée sont obtenus avec un rendement de 18% et un facteur de purification de 65 fois. La masse moléculaire de la lipoxygénase d'olive a été estimée à 98kDa. La lipoxygénase de pulpe d'olive semble avoir une préférence pour l'acide linoléique (Km=82,44 M) par rapport à l'acide linolénique (Km=306,26 M). L'analyse par RMN des produits obtenus après incubation de la lipoxygénase d'olive avec l'acide linoléique met en évidence la prédominance de l'isomère 13 de l'hydroperoxyde d'acide gras. L'enzyme semble relativement stable d'un point de vue thermique et peut être inhibée de façon compétitive (propyl gallate) et non compétitive (NDGA).The "lipoxygenase" pathway is a mechanism of response to environnemental stress (wounding, pathogen attack, dryness,...) or is activated in some step of development of plant (flowering, pollen formation, senescence,...). The lipoxygenase is the first enzyme of the pathway and catalyse the formation of hydroperoxides from free fatty acids, especially linoleic and linolenic acid in plant kingdom. Hydroperoxides can then be transformed by several enzymes into signalisation (jasmonic acid and methylic ester of jasmonic acid) or defense ((E)-2-hexenal) compounds. We choose to study the enzymatic pahway of C6 volatil compounds formation in olive because they are involved in olive oil aroma. Indeed, aldehydes, alcohols and esters from the lipoxygenase pathhway are associated to "fiuity or green notes" which is an important aspect of organoleptic quality of olive oil. In first hand, we show that lipoxygenase and hydroperoxide lyase activities are influenced by variety and maturation stage of olive fruits. The amount of C6 volatil compounds in fruits is related to lipoxygenase enzymatic activity. In second hand, we purify to homogeneity lipoxygenase from olive pulp. The purification is made in 3 steps and lead to 4,7 mg of purified enzyme with a yield of 18 % and a purification factor of 65-fold. The molecular mass of olive lipoxygenase is estimated to 98 kDa. The linoleic acid (Km=82,44 M) seems to be the preferential substrat of olive lipoxygenase rather than linolenic acid (Km=306,26 M). Olive lipoxygenase seems to be a 13-LOX. Indeed, only 13-hydroperoxide isomer is detected alter NMR analysis of products obtained from incubation of olive lipoxygenase with linoleic acid. Olive LOX is thermically stable and can be competitively (propyl gallate) or non competitively (NDGA) inhibited.CORTE-BU (200962101) / SudocSudocFranceF

Caractérisation biochimique et moléculaire des fruits d'agrumes (citrus sp.) (Modèle métabolique d'utilisation des acides organiques et des sucres)

La compréhension des processus d'élaboration et d'accumulation de l'acidité et des sucres chez les fruits d'agrumes (Citrus sp.) est un enjeu important pour l'amélioration de leur qualité organoleptique. L'objectif de ce travail de thèse a été d'identifier les voies métaboliques et les gènes responsables de ces processus. La stratégie choisie a été de comparer l'évolution de l'acidité (pH, acidité titrable et composition en acides organiques) et de la composition en sucres solubles au cours du développement des fruits de trois espèces (oranger, citronnier et limettier) comportant chacune une variété acide et une variété douce. Deux approches basées sur des techniques de biologie moléculaire ont été utilisées pour rechercher les gènes potentiellement impliqués dans la variation des concentrations en acides organiques et en sucres : (1) l'approche gènes candidats associée à la mesure des quantités d'ARNm correspondants (PCR en temps réel) et (2) la construction d'une banque enrichie en ADNc intervenant dans le caractère acide à l'aide de la technique d'hybridation suppressive et soustractive (SSH). La caractérisation biochimique des fruits a permis de montrer que le pH de la pulpe diminue dès le stade I chez les fruits acides parallèlement à l'augmentation de leur acidité titrable. L'acide citrique est majoritairement impliqué dans cette variation d'acidité. En revanche, aucune variation d'acidité n'a été observée chez les fruits doux (pH et acidité titrable constants). L'absence d'accumulation d'acide citrique chez les fruits doux correspond à une plus importante accumulation de fructose. Parmi les huit gènes candidats sélectionnés, la quantité d'ARNm correspondant aux gènes codant pour l'invertase vacuolaire et l'isocitrate déshydrogénase NADP dépendante est significativement plus élevée chez les fruits doux. L'acide citrique stocké dans la vacuole des fruits acides inactiverait l'invertase vacuolaire alors que chez les fruits doux, il serait métabolisé dans le cytoplasme via la voie du GABA shunt . Les résultats de la soustraction des ADNc communs entre les fruits acides et doux ont conduit à sélectionner un fragment de gène, qui est sous-exprimé dans les fruits doux, mais son identité n a pu être déterminée. Un modèle métabolique d'utilisation de l'acide citrique a été proposé sur la base de nos résultats.Understanding organic acid and sugar accumulation processes in citrus fruit (Citrus sp.) plays an important role for improving their organoleptic quality. The aim of our work was to identify metabolic pathways and genes involved in these processes. Our strategy was to compare acidity (pH, titratable acidity and organic acid composition) and sugar composition between acid and acidless citrus varieties from three species (orange, lemon and lime). Two different methods based on molecular biology tools were undertaken to identify genes putatively involved in the variation of organic acid and sugar concentrations: (1) candidate gene aproch coupled with quantification of mRNA (Real Time PCR) and (2) construction of a cDNA bank involved in the acid character using subtractive and suppressive hybridization (SSH). Biochemical characterization of fruits showed that pH of acidic varieties decreases during the first stage of development concomitantly with titrable acidity increase. Citric acid is the major organic acid involved in the variation of acidity. By contrast, no variation of acidity was observed with acidless fruits (pH and titratable acidity were constant. Lacking of citric acid accumulation in acidless fruit was related to a more important fructose concentration. Among the eight selected candidate genes , vacuolar acid invertase and NADP-isocitrate dehydrogenase mRNA were quantitatively higher in acidless fruits that suggest that citric acid, from acidless fruits, is metabolized via the GABA shunt pathway instead of being stored in acidic fruits. SSH results allowed selecting a partial cDNA which is sub-expressed in acidless fruit. Its identity was not yet determined. A metabolic model was proposed.CORTE-BU (200962101) / SudocSudocFranceF