Méthodes d'acquisition rapide de spectres RMN multidimensionnels. Application à l'étude structurale de protéines.

Depuis sa première observation en 1944 par Felix Bloch et Edward Purcell [1], la Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) a toujours fasciné un grand nombre de scientifiques. La beauté de cette technique réside dans le fait qu'elle permet de manipuler facilement et d'une manière contrôlée un système de spins, dont les propriétés sont décrites par la mécanique quantique et statistique, afin d'obtenir des informations précieuses sur la structure et la dynamique de la matière. Grâce au développement d'un très grand nombre d'outils RMN (séquences d'impulsions), la RMN a trouvé de nombreuses applications dans des domaines de recherche aussi divers que la physique, les sciences des matériaux, la chimie, la biologie et la médecine.Un pas crucial dans le développement de la RMN a été l'introduction en 1966 par Weston Anderson et Richard Ernst [2] du concept de l'acquisition d'un signal RMN évoluant dans le temps (FID) après une excitation polychromatique du système de spins, et sa conversion en spectre RMN par transformation de Fourier (FT). La FT-RMN a permis d'augmenter considérablement la sensibilité de la technique. Une deuxième innovation majeure a été la RMN multidimensionnelle (RMN-nD) introduite par Jean Jeener et Richard Ernst au début des années 70 [3]. La RMN-nD anotamment permis d'augmenter la résolution des spectres RMN en étalant les signaux RMN le long de plusieurs dimensions par les différentes fréquences de noyaux formant un réseau de spins couplés. L'introduction de la FT-RMN-nD a aussi ouvert la porte à la conception d'innombrablesséquences d'impulsions permettant de manipuler les spins nucléaires afin de les corréler entre eux et d'éditer leurs propriétés spectroscopiques (fréquences, couplages, vitesses de relaxation, …) dans les différentes dimensions du spectre. Ces deux développements, qui ont été récompensés par le prix Nobel de chimie attribué à Richard Ernst en 1991, sont à la base de la grande majorité des applications RMN, notamment dans le domaine de la biologie structurale qui nous intéresse plus particulièrement ici

Resolution Enhancement in Multidimensional Solid-State NMR Spectroscopy of Proteins using Spin-State Selection

A new experimental approach is introduced which leads to significant resolution enhancement in multidimensional 13C-13C correlation experiments of microcrystalline systems. Spin-state-selective techniques, adapted for solid-state NMR, are used for removing the J-coupling contribution to the 13C lineshapes. Combination of the spin-state-selective elements and standard ZQ or DQ solid-state NMR mixing sequences allows to perform a spin-state-selective polarization transfer. In addition to the resolution improvement, the new technique enables to distinguish "direct" cross peaks involving covalently bound nuclei from "relayed" cross peaks

Band-selective hetero- and homonuclear cross-polarization using trains of shaped pulses

The performance of solution cross-polarization using trains of shaped pulses on two channels is investigated by computer simulation and experiment. It is determined that a Waltz modulation pattern of Gaussian pulses of individual flip angles of 225°, issued to two coupled spins simulatneously, yields excellent coherence transfer with good phasing behavior. Simulations and experimental verification were carried out for both heteronuclear cross-polarization between two restricted areas (e.g. 1 H α − 13 C α ) and for homonuclear cross-polarization between two spectral regions (e.g. 13 CO− 13 C α ). It is shown that shaped cross-polarization behaves as pure heteronuclear cross-polarization when the two radiofrequency (rf) fields are far apart, while it behaves in some aspects analogous to homonuclear cross-polarization when the two rf fields approach each other. The novel coherence-transfer sequence, referred to as ‘cosine-modulated shaped Waltz’ (CSW), was implemented in a 3D (H)C(CCO)NH experiment using an 18-kDa isotopically labeled protein.Peer Reviewedhttp://deepblue.lib.umich.edu/bitstream/2027.42/43054/1/10858_2004_Article_BF00211161.pd

Accurate characterization of weak macromolecular interactions by titration of NMR residual dipolar couplings: application to the CD2AP SH3-C:ubiquitin complex

The description of the interactome represents one of key challenges remaining for structural biology. Physiologically important weak interactions, with dissociation constants above 100 μM, are remarkably common, but remain beyond the reach of most of structural biology. NMR spectroscopy, and in particular, residual dipolar couplings (RDCs) provide crucial conformational constraints on intermolecular orientation in molecular complexes, but the combination of free and bound contributions to the measured RDC seriously complicates their exploitation for weakly interacting partners. We develop a robust approach for the determination of weak complexes based on: (i) differential isotopic labeling of the partner proteins facilitating RDC measurement in both partners; (ii) measurement of RDC changes upon titration into different equilibrium mixtures of partially aligned free and complex forms of the proteins; (iii) novel analytical approaches to determine the effective alignment in all equilibrium mixtures; and (iv) extraction of precise RDCs for bound forms of both partner proteins. The approach is demonstrated for the determination of the three-dimensional structure of the weakly interacting CD2AP SH3-C:Ubiquitin complex (Kd = 132 ± 13 μM) and is shown, using cross-validation, to be highly precise. We expect this methodology to extend the remarkable and unique ability of NMR to study weak protein–protein complexes

How Detergent Impacts Membrane Proteins: Atomic-Level Views of Mitochondrial Carriers in Dodecylphosphocholine.

Characterizing the structure of membrane proteins (MPs) generally requires extraction from their native environment, most commonly with detergents. Yet, the physicochemical properties of detergent micelles and lipid bilayers differ markedly and could alter the structural organization of MPs, albeit without general rules. Dodecylphosphocholine (DPC) is the most widely used detergent for MP structure determination by NMR, but the physiological relevance of several prominent structures has been questioned, though indirectly, by other biophysical techniques, e.g., functional/thermostability assay (TSA) and molecular dynamics (MD) simulations. Here, we resolve unambiguously this controversy by probing the functional relevance of three different mitochondrial carriers (MCs) in DPC at the atomic level, using an exhaustive set of solution-NMR experiments, complemented by functional/TSA and MD data. Our results provide atomic-level insight into the structure, substrate interaction and dynamics of the detergent-membrane protein complexes and demonstrates cogently that, while high-resolution NMR signals can be obtained for MCs in DPC, they systematically correspond to nonfunctional states

Hyperdimensional Protein NMR Spectroscopy in Peptide-Sequence Space

International audienc

Etude du repliement des protéines par RMN temps réel et autres méthodes biophysiques (l'exemple de la Beta-2-microglobuline)

La Beta-2-microglobuline est une protéine de 12kDa, impliquée dans une maladie dûe à un mauvais repliement: l'amylose liée à la dialyse. Elle constitue donc un modèle pour la formation de fibrilles amyloides et pour le repliement des protéines. La B2M est un objet à la fois difficile et fructueux à étudier. La production de B2M est complexe et demande une optimisation important pour obtenir une protéine correctement repliée et atteindre des rendements approprié pour des études de RMN et SAXS. Le repliement de la B2M est sensible au solvent, à la température, à la concentration et souvent aux conditions de préparation. Pourtant notre étude, à l'aide de plusieurs méthodes biophysiques, a pu révéler plusieurs faits essentiels de son mécanisme de repliement et de la structure et propriétés des intermédiaires. Un premier résultat est que le repliement et l'oligomérisation sont deux processus concourants. Une découverte majeure est l'existence d'un équilibre monomère oligomère entre deux états I1 et I2 intermédiaires du repliement. Détecté indirectement à l'aide de RMN temps réel comme SOFAST, I2 a été directement charactérisé en SAXS: Il s'agit probablement d'un dimère. Les états intermédiaires de repliement de B2M avaient été pointés comme favorisant la formation de fibrilles: cela s'explique facilement avec l'existence d'un intermédiaire dimérique. Une combinaison de méthodes biophysiques permet la caractérisation de cet équilibre monomère-oligomère. En SAXS, puis confirmé en RMN, la stoichiométrie de l'équilibre est celle d'un monomère-dimère. Des travaux complémentaires utilisant les techniques développées pour cette étude pourront servir à caractériser plus finement cet équilibre. L'étude approfondie du repliement de B2M pousse les techniques biophysiques dans leurs retranchements: la sensibilité et le temps d'acquisition pour la RMN, la polydispersité pour le SAXS. Pourtant dans les deux cas un grand oligomère I3, qui disparait en quelques minutes, a pu être détecté, ce qui fut confirmé par UV-Fluo. La caractérisation d'I3 demandera des dévelopements méthodologiques supplémentaires, ainsi qu'un nouveau plan d'expérience. D'autres méthodes comme la spectrométrie de masse nano-ESI pourraient représenter des sources d'information utiles. S'attaquer aux limites des méthodes biophysiques pousse au développement méthodologique. Ainsi pour étudier la structure et dynamique d'I1, la méthode d'acquisition continue des données a permis l'attribution des résonnances de cette espèce qui a une demi vie de quelques dizaines de minutes. Un échange conformationnel a été découvert pour l'état I1 du mutant W60G, en développant une méthode de relaxation RMN: R2-BEST-TROSY. Les méthodes développées pour cette étude pourront servir des études sur le repliement d'autres protéines, mais aussi dans d'autres contextes où la demi-vie des objets étudiés est courte, comme dans les expérience RMN intracellulaires. Cette étude est évidemment éloignée d'une application directe dans le combat contre les maladies du mauvais repliement des protéines. Pour autant, la découverte d'états intermédiaires oligomériques souligne que l'oligomérisation et le repliement ne devraient pas être étudiés séparément, mais sont des processus liés. Les développements méthodologiques de cette étude pourront aussi être appliqués à d'autres protéines comme à d'autres contexte. Il est donc permis d'espérer que ces questionnements et développements permettront d'avancer vers une meilleure compréhension de ces maladies.Beta-2-microglobulin is a 12kDa protein, involved in a misfolding disease: dialysis related amyloidosis. It is therefore a model for amyloid fibril formation and protein folding studies. B2M is both a fruitful and difficult object of study. B2M production is complex, requiring optimization to obtain a well folded protein and reach yields suitable to NMR and SAXS studies. B2M folding is highly sensitive on buffer, temperature, concentration and often preparation conditions. Yet our studies, using several biophysical methods, revealed several essential facts of the folding mechanism and of the structure and dynamics of folding intermediates. A first outcome of our studies is that folding and oligomerization are co-existing processes. A major finding is the existence of a monomer-oligomer equilibrium between I1 and I2 folding intermediate states. Indirectly detected using real time NMR methods like SOFAST, I2 was directly detected and characterized using SAXS: I2 is likely to be a dimer. Folding intermediate states of B2M had been shown to favor fibril formation: this is easily explained by the existence of a dimeric folding intermediate state with an important population. A combination of biophysical methods allows the characterization of this monomer-oligomer equilibrium. Using SAXS, and later confirmed by NMR relaxation experiments, stoichiometry is shown to be a monomer-dimer equilibrium. Further work based on the methodology applied to the folding of the W60G-B2M mutant, including a further optimization of the sensitivity of the experiment, will give a sharper picture of the I1-I2 equilibrium for the WT protein, and may provide information on the timescale of the equilibrium. The thorough study of the folding of B2M pushes biophysical methods to their limits: sensitivity and acquisition time for NMR, polydispersity for SAXS. Yet in both cases a large oligomer (I3) that disappears within minutes was detected, and confirmed using UV-fluo. Characterization of I3 will demand further methodological developments, a new experimentation plan including a full dilution scale, or double jump experiments, for example. A question that arises is the comparison of this large oligomer and oligomeric intermediate states that are populated during the formation of fibrils. Other biophysical methods, such as ESI mass spectroscopy, may be an interesting input. Tackling the limits of biophysical methods leads to methodological developments. For example, to study the structure and dynamics of I1, the continuous data acquisition method allowed the assignment of this species that has a half-lifetime of tens of minutes. A conformational exchange was discovered for the I1 state of the W60G-B2M mutant, through the development of a spin relaxation measurement experiment: R2-BEST-TROSY. The methods developed for this study may be later used to study the folding and folding intermediate states of other proteins, such as alpha-lactalbumin , or in other contexts in which the short lifetime of the protein is an issue, as for in-cell NMR experiments. Our studies are of course far from an application or a concrete result in the fight against misfolding diseases such as dialysis related amyloidosis or Parkinson's. But the discovery of oligomeric folding intermediate states underlines that oligomerization (including fibril formation) and folding should not be studied separately, and are processes that are closely related. Methodological developments included in our work can be applied to other proteins as well as other contexts. Hopefully these questionings and developments will constitute a step forward a better understanding of this diseases.SAVOIE-SCD - Bib.électronique (730659901) / SudocGRENOBLE1/INP-Bib.électronique (384210012) / SudocGRENOBLE2/3-Bib.électronique (384219901) / SudocSudocFranceF

Développement et applications de méthodes RMN rapides pour l'étude de la structure et la dynamique des protéines

La RMN multidimensionnelle (RMN-nD) est la méthode de choix pour l'étude structurale et dynamique des protéines en solution avec une résolution atomique. Une limitation de la RMN-nD est la longue durée de l'acquisition: le temps d'acquisition du jeu de données nécessaire pour une étude structurale est souvent de l'ordre de plusieurs semaines. De plus des processus cinétiques, qui se passent à l'échelle de la seconde, ne sont pas accessibles aux études en temps réel par RMN-nD en utilisant les méthodes standards. Ce travail présente des développements méthodologiques qui visent à accélérer la RMN-nD en optimisant la relaxation longitudinale des protons amides. Les méthodes proposées permettent d'acquérir des spectres de corrélation 2D 1H-15 N (3D 1H-15N-13C) en quelques secondes (quelques minutes). En plus, en combinaison avec des méthodes existantes (encodage spatial, encodage Hadamard), le temps d'acquisition pour des spectres 2D peut être réduit à une seconde. Des applications à l'étude de phenomène cinétiques des protéines sont montrées.Cette thèse présente aussi une nouvelle expérience RMN qui permet d'évaluer rapidement la qualité d'un échantillon de protéine, et une nouvelle méthode pour mesurer des couplages dipolaires résiduels entre protons amides avec une meilleure sensibilité que les méthodes existantes.Multidimensional (nD) NMR is the method ofchoice for atom-resolved studies ofprotein structure and dynamics in solution. Among its current limitations are the long acquisition times required, translating to experimental times of several days or weeks for the set of experiments required for structural studies of proteins. Furthermore, real-time studies of kinetic processes occurring on a seconds time sc ale are inaccessible to standard nD NMR. This thesis is concerned with the development of fast nD NMR techniques based on longitudinal relaxation optimization. It is shown that 2D 1H-15N (3D 1H-15N-13C) correlation spectra can be obtained in only a few seconds (few minutes) of acquisition time for samples at millimolar concentration. ln addition, the longitudinal relaxation optimized methods, when combined with alternative data sampling such as spatial or Hadamard encoding, can yield site-resolved 2D1H-15N correlation spectra in acquisition times down to one second. Applications of fast 2D methods to the study ofprotein folding and unfolding are shown. This thesis also presents a longitudinal relaxation optimized method for the sensitivity-enhanced measurement ofresidual dipolar couplings between amide protons, as well as a fast and simple experiment for the characterization of protein samples, which can be very useful in the context of screening of sample conditions.GRENOBLE1-BU Sciences (384212103) / SudocSudocFranceF

Fast real-time NMR methods for characterizing short-lived molecular states.

International audienceThe characterization of both the structure and the conformational dynamics of biological macromolecules, namely proteins and nucleic acids, is required for understanding the molecular mechanisms underlying physiological function and disease. Molecular dynamics involves the transient departure from the ground-state structures to populate short-lived excited state conformations that can play important functional roles. Real-time multi-dimensional NMR spectroscopy represents a unique tool for investigating dynamic molecular processes occurring on time scales of seconds or longer, providing atomic-resolution information about short-lived states. In this minireview, we discuss recent progress made in the field of fast real-time multidimensional NMR. The potential of these new methods is illustrated for several biomolecular systems that have recently been studied by fast real-time multidimensional NMR

BEST and SOFAST experiments for resonance assignment of histidine and tyrosine side chains in 13C/15N labeled proteins

International audienceAromatic amino-acid side chains are essential components for the structure and function of proteins. We present herein a set of NMR experiments for time-efficient resonance assignment of histidine and tyrosine side chains in uniformly 13C/15N-labeled proteins. The use of band-selective 13C pulses allows to deal with linear chains of coupled spins, thus avoiding signal loss that occurs in branched spin systems during coherence transfer. Furthermore, our pulse schemes make use of longitudinal 1H relaxation enhancement, Ernst-angle excitation, and simultaneous detection of 1H and 13C steady-state polarization to achieve significant signal enhancements