Molecular diagnosis of familial hypercholesterolemia and functional characterization of missense variants in the LDLR gene

Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2015A Hipercholesterolemia Familiar (FH) é uma patologia genética que é transmitida de forma autossómica dominante e é caracterizada por elevados níveis de colesterol no plasma desde o nascimento. A FH ocorre devido a variantes funcionais num dos genes codificantes de três proteínas: recetor de lipoproteínas de baixa densidade (LDLR), apolipoproteína B-100 (APOB) ou pró-proteína convertase subtilisina quexina tipo 9 (PCSK9). O LDLR é uma glicoproteína membranar que liga e internaliza colesterol associado às lipoproteínas de baixa densidade (LDL), que constituem o principal transportador de colesterol no sangue. Variantes no gene LDLR podem resultar num catabolismo deficiente das LDL, tendo como consequência o aumento do colesterol no plasma, que se acumula nos tendões e artérias. Esta acumulação pode levar ao desenvolvimento prematuro de aterosclerose e doença cardiovascular. A FH apresenta duas formas clínicas: a forma heterozigótica, que apresenta um fenótipo menos agressivo, com valores de colesterol total entre 290 e 500 mg/dl (com LDL>190 mg/dl); e a forma homozigótica, que apresenta um fenótipo mais agressivo, com valores de colesterol total entre 600 mg/dl e 1000 mg/dl. Estima-se que as prevalências das formas heterozigótica e homozigótica sejam de 1/500 e de 1/1000000 indivíduos, respetivamente. Sabe-se ainda que mais de 90% dos casos identificados apresentam uma variante no LDLR, fazendo deste gene o mais associado a esta doença. Apesar de haver mais de 1600 variantes do LDLR reportadas em bases de dados, para a maior parte delas não existe registo de estudos funcionais que provem a sua patogenicidade, levando a que não seja possível atribuir um diagnóstico molecular definitivo a estes casos. Assim sendo, a necessidade de avaliar funcionalmente estas variantes, de modo a perceber em que medida afetam a função do recetor, também se torna imperativa. Tendo em conta as prevalências acima referidas, estima-se que em Portugal existam cerca de 20000 casos de FH. O Estudo Português de Hipercolesterolemia Familiar (EPHF), implementado em 1999 no Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge, tem como objectivo a determinação da prevalência e distribuição desta patologia em Portugal. A população em estudo é constituída por indivíduos de ambos os sexos e todas as idades, desde que cumpram com os critérios para o diagnóstico clínico de FH. O diagnóstico clínico de FH é feito, em Portugal, de acordo com os critérios clínicos adaptados de “Simon Broome Heart Research Trust” e idealmente deverá ser realizado o estudo genético, com a identificação da variante, pois só desta forma é possível confirmar o diagnóstico clínico. A realização de estudos funcionais para determinar o efeito de variantes identificadas na função da proteína é também de elevada importância, podendo contribuir para uma terapêutica mais personalizada. O EPHF está dividido em duas partes: o estudo bioquímico e o estudo molecular. Este último está sub-dividido em cinco fases. A fase I compreende a extração de DNA, o estudo do promotor, todos os exões e regiões adjacentes do LDLR, bem como das variantes mais comuns nos exões 26 e 29 da APOB. A fase II consiste no estudo de grandes rearranjos por Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA). A fase III consiste no estudo do PCSK9 e a fase IV no estudo de todo o gene da APOB. A V e última fase consiste na realização de estudos funcionais in vitro para variantes cuja patogenicidade ainda é desconhecida. Assim sendo, este projeto está dividido em duas partes, que compreendem três das cinco fases do EPHF, nomeadamente as fases I, II e V. A primeira parte consistiu na realização do estudo molecular em participantes do EPHF, estudando o promotor e os 18 exões e regiões adjacentes do LDLR, bem como o estudo de parte dos exões 26 e 29 da APOB por Polymerase Chain Reaction (PCR) e sequenciação de Sanger. De seguida, procedeu-se à pesquisa de grandes rearranjos por MLPA. Uma predição, utilizando as ferramentas in silico, foi também realizada, de modo a prever o impacto das alterações encontradas ao nível da proteína. Esta predição foi realizada tanto para alterações identificadas ao nível do exão, com as ferramentas Polymorphism Phenotyping (PolyPhen-2), Sorting Tolerant From Intolerant (SIFT) e Mutationtaster, como para as alterações identificadas ao nível do intrão, de modo a prever efeitos no splicing, com as ferramentas Human Splicing Finder (HSF), the Splice Site Prediction by Neutral Network (NNSSP) e FSPLICE. A segunda parte deste projeto consistiu então no estudo funcional das 10 variantes do LDLR mais comuns na população portuguesa, até à data sem estudos funcionais. As diferentes variantes do LDLR foram obtidas por mutagénese dirigida num plasmídeo pcDNA3_LDLR sob o controlo do promotor viral SV40. Toda a região de interesse foi confirmada por sequenciação de Sanger e foi feita uma reclonagem, em que o gene LDLR, já com a variante, foi transferido para um vetor limpo. Células CHO-ldlA7, que não expressam endogenamente o recetor, foram transfetadas com os diferentes plasmídeos. A expressão do recetor foi avaliada através da deteção com anticorpos; a ligação e a internalização foram avaliados através do uso de LDL fluorescentemente marcada com FITC. O impacto de todas as variantes ao nível da expressão, ligação e internalização foi analisado por citometria de fluxo. Em 25 casos índex estudados, 11 variantes foram identificadas em 12 doentes, embora duas destas sejam provavelmente benignas. A variante patogénica mais frequentemente encontrada na APOB foi identificada em apenas 2 doentes. De entre as alterações encontradas no LDLR (10), 2 foram aqui primeiramente reportadas e 8 já tinham sido anteriormente identificadas. De entre estas últimas, 7 já apresentavam estudos funcionais comprovando a sua patogenicidade. Aquando da pesquisa por grandes rearranjos nestes doentes por MLPA, nenhuma alteração deste tipo foi identificada no grupo em estudo. O estudo funcional das dez alterações mais frequentemente identificadas no decorrer do EPHF, até à data sem estudos funcionais que comprovem o impacto na função do recetor, revelou que, de entre as 10 variantes estudadas, 7 são patogénicas, afetando de alguma forma a função do LDLR. A variante c.1802A>T p.(Asp601Val) é patogénica, fazedo com que não haja sequer LDLR à superfície celular. Como não atinge a membrana (por não ser expressa ou por não se ancorar a esta) apresenta valores de ligação e de internalização igualmente baixos. As variantes c.1876G>A p.(Glu626Lys), c.631C>G p.(His211Asp), c.661G>T p.(Asp221Tyr), c.618_638del p.(Gly207_Ser213del) e c.551G>A p.(Cys184Tyr) apresentaram uma expressão normal. No entanto, foram observáveis valores muito reduzidos para a fluorescência associada à união das LDL nestes casos. Consequentemente, a internalização também é defetiva, parecendo lógico classificar estas variantes como patogénicas. A variante c.1775G>A p.(Gly592Glu) resulta num defeito, possivelmente, ao nível da reciclagem do recetor, sendo também considerada patogénica. Por outro lado, as variantes c.1816G>T p.(Ala606Ser), c.1966C>A p.(His656Asn) e c.2177C>T p.(Thr726Ile) parecem não revelar qualquer impacto no LDLR, sugerindo a sua neutralidade, pois obtiveram-se valores de fluorescência, associados à expressão e atividades de ligação e internalização, comparáveis ao wt. Estes resultados sugerem que os doentes portadores destas variantes devem apresentar outra justificação para o seu fenótipo hipercolesterolémico. A análise destas variantes através de ferramentas de predição in silico, realizada para todas as variantes identificadas no decorrer deste projeto, permitiu concluir que estas predições nem sempre vão de encontro ao determinado através da realização de estudos funcionais. Assim sendo, estes programas deverão ser usados, mas com a devida ressalva de que são apenas preditores. A FH é uma doença para a qual, felizmente, existe um diagnóstico definitivo (genético) e variados tratamentos farmacológicos. Apesar de ser uma doença subdiagnosticada, estão a ser realizadas diversas iniciativas para que haja uma maior divulgação da doença, nomeadamente dos benefícios do diagnóstico precoce. No âmbito da EPHF tem-se feito um esforço para que seja implementado o diagnóstico molecular como diagnóstico preferencial, juntamente com a execução de estudos funcionais para determinar a patogenicidade de variantes desconhecidas. Só assim os doentes têm a possibilidade de ter um diagnóstico definitivo para a sua patologia tornado possível instituir medidas preventivas com uma terapêutica dirigida e personalizada, melhorando o prognóstico destes doentes.Familial Hypercholesterolemia (FH) is an autosomal dominant disorder characterized by increased levels of plasmatic cholesterol since birth. FH occurs due to functional variants in one of three genes: low density lipoprotein receptor (LDLR), apolipoprotein B-100 (APOB) and proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9). This disorder has an estimated prevalence of 1:500 individuals, being more than 90% of FH patients identified with a variant in the LDLR gene. The LDLR is a membrane glycoprotein, responsible for binding and uptake of low density lipoproteins (LDL), the major cholesterol transporter in blood. Variants in LDLR gene may result in a defective LDL catabolism, leading to increased cholesterol levels in plasma, accumulating in tendons and arteries. Cholesterol accumulation in untreated FH patients leads to premature atherosclerosis and cardiovascular disease development. Although more than 1600 variants identified in this gene are reported in databases, the majority of them remains, until now, without functional studies proving their pathogenicity. For patients carrying these variants, a definitive molecular diagnosis for FH is not possible. The main purpose of Portuguese Study of Familial Hypercholesterolemia (EPHF) is to perform the molecular diagnosis of patients who were clinically diagnosed. Criteria used are adapted from the ones of Simon Broome. Furthermore, the performance of functional studies for variants of unknown pathogenicity is imperative, in order to better clarify the molecular basis of this disorder. During this project, the molecular diagnosis was performed for 25 index cases, participants of Portuguese FH Study. Among all of them, 11 variants were identified in 12 patients. Among these, 2 were novel, being first described in this project. The remaining 9 have been previously reported, although only 7 have been functionally assessed. The search for large rearrangements was performed by Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA), but no alteration of this type was identified. The 10 most common LDLR variants described during the Portuguese FH Study, to date without functional assessment, were selected. In silico assessment was performed using described tools, in order to predict their pathogenicity. Site-directed mutagenesis was successfully performed in a pcDNA3_LDLR plasmid for all variants, being expressed in CHO–ldlA7 cells, lacking endogenous expression of LDLR. LDLR expression, binding and uptake were independently assessed by flow cytometry. Results suggest that among 10 functionally studied variants, 7 cause an impairment in LDLR function. Variants c.1802A>T p.(Asp601Val), c.1876G>A p.(Glu626Lys), c.631C>G p.(His211Asp), c.661G>T p.(Asp221Tyr), c.618_638del p.(Gly207_Ser213del), c.551G>A p.(Cys184Tyr) and c.1775G>A p.(Gly592Glu) were classified as pathogenic. However, variants c.1816G>T p.(Ala606Ser), c.1966C>A p.(His656Asn) e c.2177C>T p.(Thr726Ile) seem to be neutral, not revealing any kind of impact on the LDLR function. Comparing functional studies with in silico tools predictions led to the conclusion that these are useful, but should not be the only source of evidence for a diagnosis associated to a pathology. FH is a disease for which, fortunately, a genetic diagnosis and therapeutic options exist. Although it remains as a subdiagnosed disorder, the performance of a molecular diagnosis, along with functional assessment of variants with unknown pathogenicity, allows a definite diagnosis. This way, preventive measures and personalized counseling can be made in order to improve FH patients’ prognostic, providing them longer and better lives

Representação da sexualidade não normativa no cinema : o caso português

Durante vários anos a homossexualidade foi vista como um desvio comportamental e não era aceite pela sociedade. Assim sendo ela não era representada numa das mais populares formas de arte, o cinema. Havia assim uma tentativa de tornar invisível a existência da sexualidade não normativa. Aos poucos, e com o desenvolvimento da mentalidade social, a representação desse tipo de sexualidade apresentou um trajecto na sua representação cinematográfica. Em Portugal tal trajecto também aconteceu e, com este estudo, tento perceber como a sexualidade não normativa se apresenta no cinema nacional e como essa presença afecta ou não a receptividade por parte do público

Romantismo brasileiro e a “musa popular do Norte”

Sob o influxo alemão, o culto das tradições populares no sentido da valorização do povo, da exaltação nacionalista ou humanitária do passado foi um dos traços marcantes do romantismo. Além de compactuar com a valorização das origens da nacionalidade, Franklin Távora estará empenhado em acentuar o espírito científico de suas pesquisas sobre o folclore, a exemplo das “Lendas e tradições populares do Norte”, publicadas na Ilustração Brasileira, em 1877.Bajo la influencia alemana, el culto a las tradiciones populares como una forma de valorización del pueblo, o sea, la exaltación nacionalista o humanitaria del pasado fue uno de los rasgos marcantes del romanticismo. Más allá de concordar con la valorización de los origenes de la nacionalidad, Franklin Távora se empeñará en profundizar el espíritu científico de sus investigaciones acerca del folclore, como vemos en “Lendas e tradições populares do Norte”, publicadas en la Ilustração Brasileira en 1877

Diabo e cultura popular

Ce travail présente l'image du diable qui jouait un rôle important dans la culture populaire du Moyen Âge. Des fêtes comme le Carnaval, la Fête des Fous, la Fête de l'Âne, m'ont permis voir, a travers le symbole du diable, l'interaction de deux formes de culture: la première, sérieuse, religieuse, féodale - ayant un rapport avec le monde des institutions du Moyen Âge; l'autre, comique, irrévérencieuse, profane liée au monde médiéval en dehor des institutions.O presente trabalho focaliza a figura do diabo participando de duas expressões da chamada cultura popular medieval. Por meio de espetáculos como o Carnaval, a Festa dos Loucos, a Festa do Asno, procurei aprender, através da figura demoníaca, o intercâmbio entre duas formas de cultura - uma, séria, religiosa, feudal - relacionada com o mundo das instituições medievais - outra, cômica, irreverente, profana - ligada ao mundo medieval não institucionalizado

ASTROJILDO PEREIRA, LEITOR DE MACHADO DE ASSIS

Escritor, jornalista, crítico literário, fundador do Partido Comunista Brasileiro (1922), Astrojildo Pereira (1890-1965) entrou para a história da literatura brasileira como protagonista no célebre episódio da “última despedida” de Machado de Assis, imortalizado na crônica de Euclides da Cunha. Leitor rigoroso da obra machadiana, Astrojildo Pereira foi dos primeiros críticos a descartar a interpretação acerca da indiferença de Machado de Assis em relação aos assuntos políticos e históricos no Brasil da segunda metade do século XIX, exposto em seu ensaio mais famoso, “Machado de Assis, romancista do Segundo Reinado”. O objetivo do presente artigo é propor uma leitura do referido texto, tendo em vista os respectivos suportes de publicação, na Revista do Brasil (1939), e republicação, nos livros Interpretações (1944) e Machado de Assis, ensaios e apontamentos avulsos (1959), em conexão com a conjuntura político-cultural no Brasil, nessas três décadas

Esaú e Jacó: de rivalidades e progenitura

Novel with a “particularly tedious and insipid” story (John Gledson), Machado de Assis’ Esau and Jacob is presented, in fact, as a narrative that challenges the reader’s analytic and interpretative capacity, beginning with the “Advertence”, artifice cunningly placed at the entrance of the text, establishing an ambiguity around the categories of real author, “transcriber author” (Oscar Tacca) and narrator, with repercussions in the relation between fiction and history, the central axle of the novel’s intrigue

A educação social em Portugal: novos desafios para a identidade profissional

A Educação Social surge, em Portugal, devido sobretudo à exigência dos sistemas de proteção social. Enquanto profissão, a Educação Social realiza-se no âmbito das ciências da educação, enquadrada pela Pedagogia Social. A Educação Social desenvolve-se pela diversidade de categorias profissionais e de perfis de competências e áreas disciplinares. O reconhecimento da identidade profissional dos educadores sociais portugueses depende, ainda, da polivalência dos contextos de trabalho e populações com os quais interage. A sua identidade profissional deve evidenciar o compromisso educativo do seu trabalho social, que supera lógicas de ação assistencialistas e se centra em lógicas de desenvolvimento e capacitação dos sujeitos. Neste artigo, é dado destaque à Pedagogia Social, enquanto saber matricial de referência dos educadores sociais. A Pedagogia Social constitui-se como a ciência da Educação Social, conferindo-lhe a própria especificidade da profissão. Por outro lado, o exercício profissional da Educação Social requer dos seus profissionais uma formação rigorosa, inicial e contínua, de forma a incorporar novos saberes e posturas para se adaptar a novos desafios e realidades. A educação social deve ser capaz de acompanhar as políticas sociais, participando permanentemente na negociação do contrato social. Partindo destes pressupostos, é dado a conhecer alguns desafios que se colocam à Educação Social em Portugal.La Educación Social emerge en Portugal, debido sobre todo a la exigencia de los sistemas de protección social. Como profesión, la Educación Social se realiza en el ámbito de las ciencias de la educación, encuadrada por la Pedagogía Social. La Pedagogía Social se desarrolla por la diversidad de categorías profesionales y de los perfiles de las competencias y áreas disciplinarias. El reconocimiento de la identidad profesional de los educadores sociales portugueses depende, aun, de la polivalencia de los contextos del trabajo y poblaciones con los cuales interactúan. Su identidade profesional de poner en evidencia el compromisso educativo de su trabajo social, que supera la lógica de la acción asistencialista y se centra en la lógica del desarrollo y capacitación de los sujetos. En este artículo es destacada la Pedagogía Social, como un saber que es referencia para los educadores sociales. La Pedagogía Social se constituye como la ciencia de la Educación Social dotándolo la propia especificidade de la profesión. Además, el ejercicio profesional de la Educación Social requiere de sus profesionales una formación precisa, inicial y continua, para incorporar nuevos saberes y posturas para que se adecuen a los nuevos retos de la contemporaneidad. La educación social tiene que ser capaz de seguir las políticas sociales, participando permanentemente en la negociación del contrato social. A partir de estos presupuestos, se puede conocer algunos retos que se pongan a la Educación Social en Portugal.The Social Education comes in Portugal, mainly due to the requirement of social protection systems. As a profession, the Social Education takes place in the context of science education, framed by the Social Pedagogy. The Social Education develops the diversity of professional categories and skills and disciplines profiles. The recognition of professional identity of the Portuguese social workers also depends on the versatility of work contexts and populations with which it interacts. Their professional identity should highlight the educational commitment of its social work, which surpasses logic welfare action and focuses on logical development and training subjects. In this article, emphasis is given to the Social Pedagogy, while knowing reference matrix of social educators. The Social Pedagogy was established as the science of Social Education, giving it the very specificity of the profession. On the other hand, the professional practice of Social Education requires its professionals a rigorous initial and ongoing training in order to incorporate new knowledge and attitudes to adapt to new challenges and realities. The social education should be able to monitor social policies, constantly participating in the negotiation of the social contract. Under these assumptions, is made known some challenges facing the Social Education in Portugal

Farmacologia dos antibióticos beta-lactâmicos

Projeto de Pós-Graduação/Dissertação apresentado à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências FarmacêuticasOs beta-lactâmicos, que atuam inibindo a última etapa da biosíntese da parede celular bacteriana, constituem a família mais numerosa de antibióticos e a mais utilizada na antibioterapia. Todos os compostos, naturais ou sintéticos, deste grupo (penicilinas, cefalosporinas, carbapenemos e monobactamos) são caracterizados por possuírem um anel beta-lactâmico com uma cadeia lateral variada, que explica as características, espetros de ação e resistências às beta-lactamases de cada antibiótico. Trata-se de compostos de ação bactericida lenta que interferem na síntese do peptidoglicano. São dependentes da concentração plasmática, apresentam escassa toxicidade devido ao elevado tropismo para as células bacterianas, possuindo uma ampla margem terapêutica. O seu espetro de ação tem ampliado ao longo dos anos devido à incorporação de novas moléculas com maior atividade principalmente frente a bactérias Gram-positivo, mas o aparecimento progressivo de resistências tem limitado o seu uso e a sua eficácia em determinadas situações. É urgente desenvolver novas moléculas e técnicas para ultrapassar estas vantagens das bactérias, de forma a não perder a eficácia desta família de antibióticos de extrema importância para a Saúde Pública. The beta-lactam antibiotics, which act by inhibiting the last step of the biosynthesis of the bacterial cell wall, constitute the largest family of antibiotics and the most used in antibiotic therapy. All the compounds, natural or synthetic, from this group (penicillins, cephalosporins, monobactams and carbapenems) are characterized by having a beta-lactam ring with a wide side chain, which explains the characteristics, spectrum of action and resistance to beta-lactamases of each antibiotic. They are compound of slow bactericidal action that interferes with the synthesis of peptidoglycan. They are dependent on the plasma concentration, exhibit little toxicity due to the high tropism for bacterial cells having a wide therapeutic margin. Its spectrum of action has expanded over the years due to the incorporation of new molecules with increased activity, mainly against Gram-positive bacteria, but the gradual emergence of resistance has limited its use and its effectiveness in certain situations. It is urgent to develop new molecules and techniques to overcome these advantages of bacteria, so as not to lose the effectiveness of this family of antibiotics which is extremely important to public health