Desarrollo y aplicación de un sistema de expresión de poliproteínas autoclivables basado en la proteasa NIa del virus TEV para la obtención de plantas transgénicas con capacidad de procesar, secretar y dirigir subcelularmente las proteínas expresadas

Se desarrolló, perfeccionó y evaluó la factibilidad de aplicación práctica de un vector detransformación genética vegetal que permite la coexpresión de varias proteínas bajo elcontrol de un promotor común. El sistema desarrollado basado en la proteasa NIa derivada del TEV fue capaz deprocesar poliproteínas quiméricas y producir la acumulación de varias proteínas a partirde una única unidad transcripcional in vivo. Se expresaron diferentes combinaciones deproteínas (indicadoras, como GFP y GUS, cápsides de PVX, PVY y PLRV, así comoproteínas de defensa antifúngica) in vivo e in vitro. El nivel de acumulación de cadaproteína no dependió de la posición del ORF en la poliproteína. A pesar de lo expuestoel nivel de acumulación total de una proteína expresada a través de la poliproteína puedeser influenciada por propiedades intrínsecas de las mismas. Mediante microscopíaelectrónica se demostró que la cápside de PVY expresada a través de la poliproteína nosólo se procesa correctamente sino que el producto del procesamiento es capaz deformar partículas parecidas a virus (cápsides vacías). Cuando se agregó la señal de exportación al RE del gen de la patatina apoliproteínas conteniendo GUS y GFP, éstas fueron dirigidas al RE en protoplastos detabaco de la línea BY-2. Las plantas transgénicas de papa expresando estas poliproteínasmostraron menor actividad GUS que las plantas control expresando la mismapoliproteína pero sin señal de exportación. Este menor nivel de actividad podría seratribuido a que la proteína GUS resulta glicosilada en el RE. Estos resultados sugierenque la poliproteína es dirigida al RE y luego en el lumen procesada para liberar lasproteínas individuales. Se obtuvieron plantas de papa transgénica expresando poliproteínas conteniendocuatro genes antifúngicos, codificantes para una quitinasa, una glucanasa, AP24 y RIP. Se obtuvieron plantas altamente resistentes a el ataque de R. solani, demostrando elcorrecto procesamiento de la poliproteína y el sinergismo de las proteínas antifúngicasexpresadas para producir resistencia. Se encontró una asociación entre el espaciosubcelular de acumulación de las proteínas glucanasa y AP24 (vacuolar versusapoplásmico) con el nivel de resistencia contra Rhizoctonia.Development, characterization, as well as practical application of a plant transformationvector allowing the coexpression of different proteins under the control of a singlepromoter, is described. The system, based on NIa protease gene derived from tobaccoetch potyvirus was shown to express and process chimerical polyproteins and toaccumulate different proteins from a single transcription unit, including reporter genes (green fluorescent protein —GFP-and β-glucurunidase —GUS-), as well as coat proteinsof potato virus Y (PVY), potato virus X (PVX) and antifungal proteins. Thus, differentcombinations of proteins were expressed in vitro or in vivo showing that proteinaccumulation does not depend upon relative position of the ORF within the cassette. However, the overall level of accumulation may be influenced by intrinsic properties ofthe expressed proteins. Electron microscopy showed that the PVY CP expressed in thepolyprotein cassette assembled in vivo to form void virus-like-particles. Addition of the endoplasmic reticulum (ER) targeting sequence from patatin tothe polyprotein containing GUS and GFP, targeted the protein to ER, in BY-2 tobaccoprotoplasts. Transgenic plants that encode the thus polyprotein exhibited lowerenzymatic activity than transgenic plants expressing GUS from the cassette without thepatatin leader sequence. Indirect evidence suggests that the low level of activity is theresult of glycosylation of GUS in the ER. These results suggest that the polyprotein isfirst targeted to the ER where the polyprotein is processed to release the individualproteins. Transgenic potato plants expressing a polyprotein including four anti-fungal ORFs (chitinase, glucanase, AP24 and a RIP) were produced. High levels of protectionagainst Rhizoctonia solani attack were shown, confirming the correct processing andsynergism of these proteins to produce resistance. We found an association between thesubcellular localization of the introduced glucanase and the level of resistance. Protein AP24 showed a similar but less apparent behavior. We conclude that the vector system pPRO10/20 is highly effective to expressseveral proteins in planta. The expressed proteins can be, cytoplasmic or exported to theapoplasm or other subcellular compartments like vacuoles.Fil: Asurmendi, Sebastián. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina

Antiviral efficacy of short-hairpin RNAs and artificial microRNAs targeting foot-and-mouth disease virus

RNA interference (RNAi) is a well-conserved mechanism in eukaryotic cells that directs post-transcriptional gene silencing through small RNA molecules. RNAi has been proposed as an alternative approach for rapid and specific control of viruses including foot-and-mouth disease virus (FMDV), the causative agent of a devastating animal disease with high economic impact. The aim of this work was to assess the antiviral activity of different small RNA shuttles targeting the FMDV RNA-dependent RNA polymerase coding sequence (3D). Three target sequences were predicted within 3D considering RNA accessibility as a major criterion. The silencing efficacy of short-hairpin RNAs (shRNAs) and artificial microRNAs (amiRNAs) targeting the selected sequences was confirmed in fluorescent reporter assays. Furthermore, BHK-21 cells transiently expressing shRNAs or amiRNAs proved 70 to >95% inhibition of FMDV growth. Interestingly, dual expression of amiRNAs did not improve FMDV silencing. Lastly, stable cell lines constitutively expressing amiRNAs were established and characterized in terms of antiviral activity against FMDV. As expected, viral replication in these cell lines was delayed. These results show that the target RNA-accessibility-guided approach for RNAi design rendered efficient amiRNAs that constrain FMDV replication. The application of amiRNAs to complement FMDV vaccination in specific epidemiological scenarios shall be explored further

Grapevine virus L: a novel vitivirus in grapevine

Vitiviruses are ssRNA(+) viruses in the family Betaflexiviridae (subfamily Trivirinae). There are currently 10 ICTV recognized virus species in the genus; nevertheless, the extended use of NGS technologies is rapidly expanding their diversity and official recognition of six more have been proposed recently. Here, we present the characterization of a novel virus from grapevine, which fits the genomic architecture and evolutionary constraints to be classified within the Vitivirus genus. The detected virus sequence is 7607 nt long, including a typical genome organization of ORFs encoding a replicase (RP), a 22 kDa protein, a movement protein, a coat protein (CP) and a nucleic acid binding protein. Phylogenetic analyses based on the predicted RP and CP proteins unequivocally place the new virus within the Vitivirus genus. Multiple independent RNAseq data confirmed the presence of the detected virus in berries at diverse developmental stages. Additionally, we detected, confirmed, and assembled virus sequences from grapevine samples of distinct cultivars from America, Europe, Asia and Oceania, sharing 74.4%–97.8% nt identity, suggesting that the identified virus is widely distributed and diverse. We propose the name grapevine virus L (GVL) to the detected Vitivirus.Fil: Debat, Humberto Julio. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigaciones Agropecuarias. Instituto de Patología Vegetal; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Zavallo, Diego. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación En Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular; ArgentinaFil: Soltero Brisbane, Reid. Foundation Plant Services; Estados UnidosFil: Voncina, Darko. University of Zagreb; CroaciaFil: Almeida, Rodrigo P.. University of California at Berkeley; Estados UnidosFil: Blouin, Arnaud G.. No especifíca;Fil: Al Rwahnih, Maher. University of California at Berkeley; Estados UnidosFil: Gómez Talquenca, Sebastián. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro Regional Mendoza-San Juan. Estación Experimental Agropecuaria Mendoza; ArgentinaFil: Asurmendi, Sebastian. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación En Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular; Argentin

Desarrollo y aplicación de un sistema de expresión de poliproteínas autoclivables basado en la proteasa NIa del virus TEV para la obtención de plantas transgénicas con capacidad de procesar, secretar y dirigir subcelularmente las proteínas expresadas

Se desarrolló, perfeccionó y evaluó la factibilidad de aplicación práctica de un vector de transformación genética vegetal que permite la coexpresión de varias proteínas bajo el control de un promotor común. El sistema desarrollado basado en la proteasa NIa derivada del TEV fue capaz de procesar poliproteínas quiméricas y producir la acumulación de varias proteínas a partir de una única unidad transcripcional in vivo. Se expresaron diferentes combinaciones de proteínas (indicadoras, como GFP y GUS, cápsides de PVX, PVY y PLRV, así como proteínas de defensa antifúngica) in vivo e in vitro. El nivel de acumulación de cada proteína no dependió de la posición del ORF en la poliproteína. A pesar de lo expuesto el nivel de acumulación total de una proteína expresada a través de la poliproteína puede ser influenciada por propiedades intrínsecas de las mismas. Mediante microscopía electrónica se demostró que la cápside de PVY expresada a través de la poliproteína no sólo se procesa correctamente sino que el producto del procesamiento es capaz de formar partículas parecidas a virus (cápsides vacías). Cuando se agregó la señal de exportación al RE del gen de la patatina a poliproteínas conteniendo GUS y GFP, éstas fueron dirigidas al RE en protoplastos de tabaco de la línea BY-2. Las plantas transgénicas de papa expresando estas poliproteínas mostraron menor actividad GUS que las plantas control expresando la misma poliproteína pero sin señal de exportación. Este menor nivel de actividad podría ser atribuido a que la proteína GUS resulta glicosilada en el RE. Estos resultados sugieren que la poliproteína es dirigida al RE y luego en el lumen procesada para liberar las proteínas individuales. Se obtuvieron plantas de papa transgénica expresando poliproteínas conteniendo cuatro genes antifúngicos, codificantes para una quitinasa, una glucanasa, AP24 y RIP. Se obtuvieron plantas altamente resistentes a el ataque de R. solani, demostrando el correcto procesamiento de la poliproteína y el sinergismo de las proteínas antifúngicas expresadas para producir resistencia. Se encontró una asociación entre el espacio subcelular de acumulación de las proteínas glucanasa y AP24 (vacuolar versus apoplásmico) con el nivel de resistencia contra Rhizoctonia

Current recommendations and novel strategies for sustainable management of soybean sudden death syndrome

The increase in food production requires reduction of the damage caused by plant pathogens, minimizing the environmental impact of management practices. Soil-borne pathogens are among the most relevant pathogens that affect soybean crop yield. Soybean sudden death syndrome (SDS), caused by several distinct species of Fusarium, produces significant yield losses in the leading soybean-producing countries in North and South America. Current management strategies for SDS are scarce since there are no highly resistant cultivars and only a few fungicide seed treatments are available. Because of this, innovative approaches for SDS management need to be developed. Here, we summarize recently explored strategies based on plant nutrition, biological control, priming of plant defenses, host-induced gene silencing, and the development of new SDS-resistance cultivars using precision breeding techniques. Finally, sustainable management of SDS should also consider cultural control practices with minimal environmental impact. © 2021 Society of Chemical Industry.Fil: Rodríguez,María C. Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular, CICVyA. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (CONICET). Argentina.Fil: Sautua, Francisco José. Universidad de Buenos Aires.Facultad de Agronomía. Fitopatología. Argentina.Fil: Scandiani, María Mercedes. Universidas Nacional de Rosario. Facultar de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Centro de Referencia de Micología. Argentina

A practical approach to the understanding and teaching of RNA silencing in plants

Gene silencing, also called RNA interference (RNAi) is a specific mechanism of RNA degradation involved in gene regulation, development and defense in eukaryotic organisms. It became an important subject in the teaching programs of molecular biology, genetics and biotechnology courses in the last years. The aim of this work is to provide simple and inexpensive assays to understand and teach gene silencing using plants as model systems. The use of transient and permanent transgenic plants for expressing reporter genes, like those derived from jellyfish green fluorescent protein (gfp) encoding gene, provides a nice, colorful and conclusive image of gene silencing. Three experimental approaches to evidence RNA silencing are depicted. In the first approach gene silencing is demonstrated after transient expression of reporter genes in non-transgenic plants. In the second, silencing is triggered against a reporter gene stably integrated into a transgenic plant. The third approach involves the triggering of RNA silencing against endogenous genes using viral vectors. In addition we illustrate systemic gene silencing showing how the silencing signal is spread over a plant and finally it is also demonstrated the suppression of gene silencing. The first group of experiments is recommended to be tough on undergraduate courses, the following two sections are recommended for graduate courses. Hopefully, it will help students to understand this important phenomenon and to unravel the importance of gene silencing as a key gene regulation mechanism and as a molecular and biotechnological tool

First report of grapevine red blotch virus infecting grapevine in Argentina

.Fil: Luna, Facundo Nicolás. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro Regional Mendoza-San Juan. Estación Experimental Agropecuaria Mendoza; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mendoza; ArgentinaFil: Debat, Humberto Julio. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigaciones Agropecuarias. Instituto de Patología Vegetal; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Moyano, Sabrina Noé. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro Regional Mendoza-San Juan. Estación Experimental Agropecuaria Mendoza; ArgentinaFil: Zavallo, Diego. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; ArgentinaFil: Asurmendi, Sebastian. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; ArgentinaFil: Gómez Talquenca, Sebastián. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro Regional Mendoza-San Juan. Estación Experimental Agropecuaria Mendoza; Argentin

Genomic re-assessment of the transposable element landscape of the potato genome

Transposable elements are DNA sequences with the ability to auto-replicate and move that occupy large proportions of the host genome. TEs are responsible for shaping the genome size and are major drivers of gene regulation, epigenetics, stress regulation and genome evolution. Given their significance, the development of clear and efficient TEs annotation pipelines has become essential for many species. The latest TE discovery de novo-based methods tools, along with available TEs from Repbase and sRNA-seq data, allowed us to perform an improved detection, classification and annotation of reliable potato TEs throughout an open-source and freely available pipeline (https://github.com/DiegoZavallo/TE_Discovery). Previous TEs annotation for this genome varied from 20 to 34% genome coverage. However, our pipeline revealed that only ca. 16% of the genome can clearly be annotated as TEs. Since we used a variety of tool, approaches and rules, our results suggest that several TEs annotation projects might overestimate annotations. Additionally, we described the distribution of the different types of TEs across the genome, where LTRs and MITEs present a clear clustering pattern in pericentromeric and subtelomeric/telomeric regions respectively. Finally, we analyzed the insertion age and distribution of LTRs families which display a distinct pattern between the two major families. Thus, older Gypsy elements concentrated around heterochromatic regions and younger Copia elements located predominantly on euchromatic regions. Overall, we delivered not only a reliable, ready-to-use potato TEs annotation files, but also all the necessary steps to performed de novo detection for other species.Fil: Zavallo, Diego. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación En Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular; ArgentinaFil: Crescente, Juan Manuel. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Gantuz, Magdalena. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mendoza. Instituto de Biología Agrícola de Mendoza. Universidad Nacional de Cuyo. Facultad de Ciencias Agrarias. Instituto de Biología Agrícola de Mendoza; ArgentinaFil: Leone, Melisa. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación En Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular; Argentina. Ministerio de Ciencia. Tecnología e Innovación Productiva. Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica; ArgentinaFil: Vanzetti, Leonardo Sebastián. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria; ArgentinaFil: Masuelli, Ricardo Williams. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mendoza. Instituto de Biología Agrícola de Mendoza. Universidad Nacional de Cuyo. Facultad de Ciencias Agrarias. Instituto de Biología Agrícola de Mendoza; ArgentinaFil: Asurmendi, Sebastian. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mendoza. Instituto de Biología Agrícola de Mendoza. Universidad Nacional de Cuyo. Facultad de Ciencias Agrarias. Instituto de Biología Agrícola de Mendoza; Argentin

Genome-wide identification of MITE-derived microRNAs and their targets in bread wheat

Background: Plant miRNAs are a class of small non-coding RNAs that can repress gene expression at the post-transcriptional level by targeting RNA degradation or promoting translational repression. There is increasing evidence that some miRNAs can derive from a group of non-autonomous class II transposable elements called Miniature Inverted-repeat Transposable Elements (MITEs). Results: We used public small RNA and degradome libraries from Triticum aestivum to screen for microRNAs production and predict their cleavage target sites. In parallel, we also created a comprehensive wheat MITE database by identifying novel elements and compiling known ones. When comparing both data sets, we found high homology between MITEs and 14% of all the miRNAs production sites detected. Furthermore, we show that MITE-derived miRNAs have preference for targeting degradation sites with MITE insertions in the 3’ UTR regions of the transcripts. Conclusions: Our results revealed that MITE-derived miRNAs can underlay the origin of some miRNAs and potentially shape a regulatory gene network. Since MITEs are found in millions of insertions in the wheat genome and are closely linked to genic regions, this kind of regulatory network could have a significant impact on the post-transcriptional control of gene expression.Fil: Crescente, Juan M. CONICET; ArgentinaFil: Zavallo, Diego. CONICET. INTA. Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular (IABIMO), CICVyA; ArgentinaFil: del Vas, Mariana. CONICET. INTA. Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular (IABIMO), CICVyA; ArgentinaFil: Asurmendi, Sebastián. CONICET. INTA. Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular (IABIMO), CICVyA; ArgentinaFil: Helguera, Marcelo. EEA INTA; ArgentinaFil: Fernandez, Elmer. Universidad Católica de Córdoba. Centro de Investigación y Desarrollo en Inmunología y Enfermedades Infecciosas (CIDIE-CONICET); ArgentinaFil: Fernandez, Elmer. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales; ArgentinaFil: Vanzetti, Leonardo S. CONICET; ArgentinaFil: Vanzetti, Leonardo S. EEA INTA; Argentin