Simultaneous encapsulation of sodium diethyldithiocarbamate and 4-nitrochalcone in solid lipid nanoparticles by water/oil/water double emulsion for biomedical aplication

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Florianópolis, 2019.A nanoencapsulação de compostos terapêuticos visa o aumento da biodisponibilidade e atividade terapêutica bem como, a diminuição de possíveis efeitos colaterais. Dada a necessidade do desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas alternativas e mais eficientes, o presente trabalho tem como objetivo a encapsulação simultânea de dietilditiocarbamato de sódio e 4-nitrochalcona em nanopartículas lipídicas sólidas (SLNs) através do método de dupla emulsão água/óleo/água sem a utilização de solventes, visando a obtenção de efeito sinérgico entre os fármacos, para elaboração de um sistema terapêutico alternativo para o tratamento do melanoma (B16F10) e leishmaniose cutânea. A produção das SLNs foi realizada combinando os métodos de dupla emulsão W/O/W e dispersão por fusão sem a aplicação de solvente, utilizando cera de abelha e crodamol como matriz lipídica. As SLNs apresentaram características desejáveis para sua internalização celular com Dp médio abaixo de 250 nm, PDI indicando distribuição relativamente monodispersa e potencial zeta negativo antes e após liofilização além de morfologia semiesférica e baixa razão de aspecto. A encapsulação simultânea de DETC e 4NC pelo método de dupla emulsão W/O/W foi realizada com sucesso, apresentando alta eficiência de encapsulação, superior a 86% e 98% para os fármacos hidrofílico e hidrofóbico, respectivamente, tanto na forma isolada como na forma conjunta. A presença dos agentes fluorescentes hidrofílicos e hidrofóbicos na mesma estrutura, bem como sua internalização por células B16F10 pôde ser confirmada por microscopia de fluorescência. Os estudos de hemólise revelaram que mesmo em altas concentrações as SLNs puras não apresentaram efeito hemolítico superior a 5%. Os ensaios de viabilidade celular utilizando células B16F10 revelaram um maior efeito citotóxico dos fármacos quando encapsulados em comparação com a sua forma livre. A combinação de DETC+4NC apresentou efeito sinérgico nas formas livre e encapsulada, com um decréscimo na viabilidade celular de 45% e 64% respectivamente. Quando testadas em macrófagos peritoneais as SLNs se mostraram capazes de proteger as células do efeito citotóxico causado pelos fármacos na forma livre. Quando expostas à combinação de DETC+4NC as células de macrófago sofreram efeito inibitório sinérgico (92.2%). As SLNs não foram capazes de proteger as células apenas na maior concentração combinada (1.71DETC/0.884NC µg/mL). Os ensaios utilizando Leishmania amazonensis na forma promastigota revelaram que quando encapsulado o DETC tem seu potencial inibitório diminuído em relação a sua forma livre; a 4NC por sua vez teve efeito maior ao ser encapsulada (83.6%) quando comparada a forma livre (61.9%); a utilização de DETC+4NC não apresentou efeito sinérgico tanto na forma livre quanto encapsulada. Os resultados apresentados permitem concluir que a técnica de dupla emulsão água/óleo/água se mostra eficiente na encapsulação simultânea de fármacos hidrofílicos e hidrofóbicos bem como, na produção de nanopartículas lipídicas sólidas na ausência de solventes. A combinação de DETC+NC foi capaz de gerar efeito terapêutico sinérgico sobre células de melanoma e este ainda pode ser potencializado pela encapsulação simultânea nas SLNs. Os ensaios em macrófagos e Leishmania amazonensis revelaram que a encapsulação foi capaz de proteger as células de macrófagos e gerar efeito citotóxico sobre a forma promastigota, conferindo maior seletividade e efeito terapêutico às moléculas. Com base nos resultados obtidos, SLNs à base de cera de abelha contendo DETC e/ou 4NC pode ser uma alternativa viável para desenvolver a próxima geração de tratamentos para melanoma e leishmaniose cutânea.Abstract: The nanoencapsulation of therapeutic agents allows to increase the bioavailability and therapeutic activity of the drug as well as reducing possible side effects associated with its use. Once that new alternative and more efficient therapeutic strategies are required, the aim of this work was the simultaneous encapsulation of sodium diethyldithiocarbamate and 4 nitrochalcone in solid lipid nanoparticles (SLNs) using water/oil/water double emulsion method in absence of organic solvents. In addition, the synergistic effect between the drugs was evaluated to propose an alternative therapeutic system for melanoma (B16F10) and cutaneous leishmaniasis. The production of SLNs was performed by combining the W/O/W double emulsion and melt dispersion technique in the absence of organic solvents and using beeswax and crodamol as lipid matrix. The SLNs presented desirable characteristics for cellular uptake such as Dp below 250 nm, PDI values indicating relatively monodisperse distributions and negative zeta potential, both before and after lyophilisation, allied to semi-spherical morphology and low aspect ratio. The simultaneous encapsulation of DETC and 4NC was successfully performed by the W/O/W double emulsion, with high encapsulation efficiency of more than 86% and 98% for the hydrophilic and hydrophobic drug, respectively, in both forms individually and simultaneously loaded. The presence of the hydrophilic and lipophilic fluorescent agents in the same structure as well as SLNs internalization by B16F10 cells was observed by fluorescence microscopy. Studies of hemolysis revealed that even at high concentrations, pure SLNs did not present hemolytic effect. Cell viability assays using B16F10 cells revealed a higher cytotoxic effect of the drugs when encapsulated in comparison with their free forms. The combination of DETC+4NC generated synergic inhibitory effect in both free (45%) and encapsulated (64%) forms. When tested in peritoneal macrophages SLNs demonstrated to be able to protect cells from the cytotoxic effect caused by the drugs. The combination of DETC+4NC had a synergistic inhibitory effect (92.2%) over macrophage cells. Only at the highest combined concentration (1.71DETC / 0.884NC µg/mL) SLNs were not able to protect the cells. The assays using the promastigote form of Leishmania amazonensis revealed that when encapsulated DETC has its inhibitory potential reduced relative to its free form. 4NC in turn had a greater effect when encapsulated (83.6%) compared to it free form (61.9%). The use of DETC+4NC showed no synergistic effect over L. amazonensis in both free and encapsulated form. The results show that the water/oil/water double emulsion technique is efficient in the simultaneous encapsulation of hydrophilic and hydrophobic drugs as well as in the production of solid lipid nanoparticles in the absence of organic solvents. The combination of DETC+4NC was able to generate synergic therapeutic effect on melanoma cells and this could be further potentialized by the simultaneous encapsulation in SLNs. Macrophage and L. amazonensis assays revealed that encapsulation was able to simultaneously protect macrophage cells and generate cytotoxic effect on the promastigote form, conferring greater selectivity and therapeutic effect to the molecules. Based on these results, beeswax SLNs containing DETC and/or 4NC may be a viable alternative for develop the next generation of melanoma and cutaneous leishmaniasis treatment

mRNA encapsulation in lipid nanoparticles formulations for macrophage-based immunotherapy and pulmonary lung delivery

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Florianópolis, 2023.Nas últimas décadas, o uso de agentes terapêuticos baseados em ácidos nucleicos tem sido amplamente investigado para o desenvolvimento de terapias genéticas, tornando-se uma estratégia interessante para o tratamento de diversos tipos de doenças pulmonares, desde condições hereditárias até câncer. A imunoterapia pode ser feita pela modulação de células do sistema imune inato, como os macrófagos. A administração de mRNA requer um transportador apropriado capaz de evitar sua degradação, e garantir sua expressão sem gerar efeitos colaterais indesejados. Nesse contexto, as nanopartículas lipídicas (NPLs) são atualmente a melhor plataforma aprovada pela FDA para a administração in vivo de mRNA. No entanto, para maximizar ainda mais os benefícios das terapias baseadas em mRNA, é preferível direcionálas diretamente ao local-alvo específico. Assim, o objetivo deste trabalho foi propor uma formulação de NPLs para a encapsulação de mRNA e investigar o uso dessas NPLs para a entrega pulmonar de medicamentos como ferramenta de imunoterapia baseada em macrófagos. Duas formulações à base de lecitina foram investigadas para a encapsulação do mRNA-Revilla em emulsão dupla água/óleo/água (A/O/A) usando duas abordagens diferentes de emulsificação ultrassônica. Ambas as formulações e abordagens de emulsificação permitiram a produção de NPLs submicrométricas estáveis e capazes de encapsular a molécula de mRNA. A presença de cera de abelha na formulação promoveu a inibição completa de células HEK 293T nas concentrações testadas. A formulação composta apenas por lecitina de soja e Crodamol mostrou-se o sistema de entrega de mRNA mais promissor, com uma eficiência de encapsulação de 31% e com baixos níveis de citotoxicidade em células Vero. No entanto, a expressão de mRNA em células HEK 293T não foi detectada usando o sistema de entrega a base de lecitina de soja e Crodamol. A aplicação de ultrassom com uma sonda invertida para promover a emulsificação não comprometeu a integridade do mRNA. Dessa forma, lecitina de soja e Crodamol têm o potencial de serem usados como formulação alternativa para a encapsulação e entrega de mRNA. Em seguida, oito formulações diferentes de NPLs contendo mRNA-FLuc foram preparadas pela técnica de autoagregação por adição gota-a-gota, e avaliadas para a entrega direcionada de mRNA a macrófagos. Todas as formulações apresentaram tamanho submicrométrico, estabilidade coloidal e níveis de encapsulamento acima de 80%. A mistura lipídica provou ser um aspecto crucial na entrega e expressão do mRNA, impactando o nível de bioluminescência in vitro das células RAW 264.7 e K7M2. A combinação de SM-102, DOPE e ß-sitosterol teve o melhor nível geral de transfecção em células de macrófagos. Finalmente, formulações de NPLs de autoagregação contendo mRNAFLuc foram preparadas pelo método de microfluídica, o que impactou significativamente o tamanho das NPLs, atingindo um nível de encapsulamento de 90%. A entrega pulmonar in vivo da formulação composta por DLin-MC3-DMA/DSPC/colesterol/DMG-PEG carregada com mRNA-FLuc foi investigada em camundongos Balc/c, com a expressão de mRNA-FLuc apresentando um pico de bioluminescência após 6 h. O rastreamento das NPLs usando o corante DiD revelou sua presença in vivo e ex vivo nos pulmões, assim como no fluido de lavagem broncoalveolar (BALF). No entanto, mesmo sendo observada in vivo e ex vivo nos pulmões, a expressão de mRNA-FLuc não foi detectada no BALF. Assim, as NPLs são uma estratégia promissora para promover a entrega direta de mRNA aos pulmões, e o ajuste da formulação lipídica pode ser usado para direcionar as NPLs aos macrófagos, para o desenvolvimento de uma ferramenta de imunoterapia.Abstract: Over the past few decades, nucleic acid-based therapeutic agents have been vastly investigated for gene therapy, becoming an interesting strategy for the treatment of several types of lung diseases, from hereditary conditions to cancer. Immunotherapies can be used to modulate innate immune cells, such as macrophages. The administration of extracellular mRNA demands an appropriate carrier capable of avoiding its degradation and securing the mRNA transfection and expression, without generating undesirable side effects. In this context lipid nanoparticles (LNPs) are currently the best FDA-approved platform for in vivo mRNA administration. Nevertheless, to further maximize the benefits of mRNA-based genomic medicines, they must be preferably delivered to the specific target site. Thus, the aim of the present work was to propose a bio-based LNPs formulation for mRNA encapsulation and investigate the use of these LNPs for pulmonary drug delivery as macrophage-based immunotherapy tool. Two lecithinbased formulations were investigated for water/oil/water (W/O/W) double emulsion encapsulation of Revilla-mRNA using two different approaches of ultrasonic emulsification. Both formulations and emulsification approaches allowed the production of submicrometric, and stable LNP structures, which successfully encapsulated the mRNA molecule. The presence of beeswax in the formulation promoted the complete inhibition of HEK 293T cells at the tested concentrations making unfeasible its use for the intended application. The formulation composed only of soy lecithin and Crodamol proved to be the most promising mRNA delivery system, with an encapsulation efficiency of 31% and low levels of cytotoxicity in Vero cells. However, mRNA expression in HEK 293T cells was not detected using the soy lecithin and Crodamol delivery system. The application of ultrasound using an invert probe to promote the emulsification did not compromise the mRNA integrity. In this way, soy lecithin and Crodamol have the potential to be used as alternative formulation for mRNA encapsulation and delivery. Next, eight different self-assembly LNP formulations containing FLuc-mRNA were prepared by the dropwise addition technique and screened for macrophages mRNA targeting delivery. All the formulations presented submicrometric size, stability, and encapsulation level above 80%. The lipid mixture proved to be a key aspect of the mRNA delivery and expression, impacting the in vitro bioluminescence level of RAW 264.7 and K7M2 cells, with the combination of SM-102, DOPE ß-sitosterol having the best overall transfection level in macrophages cells. Finally, self-assembly LNP formulations containing FLuc-mRNA were prepared by the microfluidics method, which significantly impacted the LNPs size and reached an encapsulation level of 90%, and also proved to be the most reproducible one. The in vivo lung delivery of the self-assembly formulation DLin-MC3-DMA/DSPC/Cholesterol/DMGPEG LNPs loaded with FLuc-mRNA was investigated on balc/c mice, with the FLuc-mRNA expression presenting a bioluminescence pic at 6 h. The LNPs tracking using DiD' dye revealed its in vivo and ex vivo presence in the lungs, as well as in the bronchoalveolar lavage fluid (BALF). However, even being in vivo and ex vivo identified in lungs, the FLuc-mRNA expression was not detected in the BALF. Thus, LNPs are a promising strategy to promote the direct delivery of mRNA to the lungs, and the adjustment of the lipid formulation can be used as an advantage to target LNPs to macrophages to be used as an immunotherapy tool

Diethyldithiocarbamate loaded in beeswax-copaiba oil nanoparticles obtained by solventless double emulsion technique promote promastigote death in vitro

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