Active turnover of genomic methylcytosine in pluripotent cells

Epigenetic plasticity underpins cell potency, but the extent to which active turnover of DNA methylation contributes to such plasticity is not known and the underlying pathways are poorly understood. Here we use metabolic labelling with stable isotopes and mass spectrometry to quantitatively address the global turnover of genomic methylcytidine (mdC), hydroxymethylcytidine (hmdC) and formylcytidine (fdC) across mouse pluripotent cell states. High rates of mdC/hmdC oxidation and fdC turnover characterize a formative-like pluripotent state. In primed pluripotent cells the global mdC turnover rate is about 3-6% faster than can be explained by passive dilution through DNA synthesis. While this active component is largely dependent on Tet-mediated mdC oxidation, we unveil additional oxidation-independent mdC turnover, possibly through DNA repair. This process accelerates upon acquisition of primed pluripotency and returns to low levels in lineage committed cells. Thus, in pluripotent cells active mdC turnover involves both mdC oxidation-dependent and independent processes

Comparative and functional genomics of gene families linked to secondary metabolism in grapevine (Vitis vinifera) and its relatives

La vigne (Vitis vinifera) possède un métabolisme secondaire particulièrement riche donnant naissance à une large palette de molécules dont certaines sont impliquées dans les défenses contre les pathogènes et d'autres dans la grande diversité d’arômes qui fait la renommée des vins. L’analyse de la séquence de référence du génome de la vigne a permis de mettre en évidence une remarquable expansion de certaines familles de gènes liés au métabolisme secondaire par rapport aux autres plantes. Dans ce travail, j'ai étudié les familles gènes codant pour les cytochromes P450, dont certains sont impliqués dans la production d’arômes, les gènes codant pour les stilbènes synthases (STS), les endo-β-1,3-glucanases et les gènes de résistance de type NBS impliqués dans les défenses de la vigne. Ma thèse vise à proposer des hypothèses expliquant l’organisation structurale de ces familles de gènes et ainsi à mieux comprendre pourquoi certaines familles présentent une amplification dans le génome de la vigne. Des approches bioinformatiques ont été utilisées afin d’étudier ces différentes familles de gènes. Les gènes cytochromes P450 et gènes R de type NBS ont tout d'abord été annotés de manière manuelle dans le génome de référence de la vigne. L’expression des gènes endo-β-1,3- glucanases, STS et cytochromes P450 a été analysée en utilisant une approche transcriptomique à grande échelle. Pour ce faire, un outil a été développé durant cette thèse pour estimer le niveau d’expression des gènes à partir de données RNA-Seq disponibles dans les banques de données publiques. Parallèlement, des données de reséquençage d’ADN de 56 cépages et espèces de vigne ont été analysées, afin de déterminer les variations structurales de type CNV au sein des familles de gènes à domaine NBS et de gènes STS. Ces différents travaux ont permis de montrer que l’amplification des familles de gènes étudiées n’est pas spécifique du génome de référence mais est retrouvée dans l'ensemble du genre Vitis, mais également de mettre en évidence des variations structurales au sein des différents génomes étudiés. L'analyse de la famille STS a montré que ces gènes sont organisés en blocs de duplication, et que les gènes plus conservés sont aussi les plus exprimés. Nous avons également montré que les gènes à domaine NBS sont organisés en cluster, dont certains sont particulièrement soumis à variation. Ces travaux contribuent à une meilleure connaissance de facteurs de défense efficaces et durables ainsi que des gènes impliqués dans la synthèse d’arômes dans la vigne. Ces connaissances pourront bénéficier aux programmes de création variétale mis en œuvre à l’INRA de Colmar.Grapevine (Vitis vinifera) has a particularly rich secondary metabolism, giving rise to a wide range of molecules, some of which are involved in defences against pathogens and others in the great diversity of aromas that make wines famous. Analysis of grapevine reference genome has shown a remarkable expansion of certain families of genes linked to secondary metabolism in comparison with the other plants. In this work, I have analysed gene families coding for cytochromes P450, some of them being involved in the production of aromas, genes coding for stilbene synthases (STS), endo-β-1,3-glucanases and NBS type resistance genes involved in grapevine defences. My thesis intends to propose hypothesis to explain the structural organisation of these families and therefore better understand why some of these families are amplified in the grapevine genome. Bioinformatic approaches have been used to study these different genes families. The cytochromes P450 and R genes of NBS type were manually annotated to improve the knowledge of these families of genes. The expression of endo-β-1,3-glucanases, STS and cytochromes P450 genes has been quantified using a large-scale transcriptomic approach. To this purpose, a tool has been developed during this thesis to estimate the level of genes expression from RNA- Seq data available in public databases. In the meantime, DNA resequencing data from 56 cultivars and grapevine species have been analysed to identify structural variations of CNV types within the genes with a NBS domain and the STS genes. These works showed that the amplification of the gene families of interest was not specific to the reference genome but occurred at the scale of the Vitis genus, but also to highlighted structural variations in different genomes. Regarding the STS genes, blocks of duplication and more conserved and expressed genes were identified. For the genes with NBS domain, a clustered organisation has been highlighted with some clusters varying more than others in the studied genotypes. These works contribute to a better knowledge of gene families for efficient and durable defence against pathogens and optimal aromas synthesis in grapevine. This knowledge will benefit to breeding programs currently in progress at INRA Colmar

Génomique comparative et fonctionnelle de familles de gènes liés au métabolisme secondaire de la vigne (Vitis vinifera) et de ses proches parents

Grapevine (Vitis vinifera) has a particularly rich secondary metabolism, giving rise to a wide range of molecules, some of which are involved in defences against pathogens and others in the great diversity of aromas that make wines famous. Analysis of grapevine reference genome has shown a remarkable expansion of certain families of genes linked to secondary metabolism in comparison with the other plants. In this work, I have analysed gene families coding for cytochromes P450, some of them being involved in the production of aromas, genes coding for stilbene synthases (STS), endo-β-1,3-glucanases and NBS type resistance genes involved in grapevine defences. My thesis intends to propose hypothesis to explain the structural organisation of these families and therefore better understand why some of these families are amplified in the grapevine genome. Bioinformatic approaches have been used to study these different genes families. The cytochromes P450 and R genes of NBS type were manually annotated to improve the knowledge of these families of genes. The expression of endo-β-1,3-glucanases, STS and cytochromes P450 genes has been quantified using a large-scale transcriptomic approach. To this purpose, a tool has been developed during this thesis to estimate the level of genes expression from RNA- Seq data available in public databases. In the meantime, DNA resequencing data from 56 cultivars and grapevine species have been analysed to identify structural variations of CNV types within the genes with a NBS domain and the STS genes. These works showed that the amplification of the gene families of interest was not specific to the reference genome but occurred at the scale of the Vitis genus, but also to highlighted structural variations in different genomes. Regarding the STS genes, blocks of duplication and more conserved and expressed genes were identified. For the genes with NBS domain, a clustered organisation has been highlighted with some clusters varying more than others in the studied genotypes. These works contribute to a better knowledge of gene families for efficient and durable defence against pathogens and optimal aromas synthesis in grapevine. This knowledge will benefit to breeding programs currently in progress at INRA Colmar.La vigne (Vitis vinifera) possède un métabolisme secondaire particulièrement riche donnant naissance à une large palette de molécules dont certaines sont impliquées dans les défenses contre les pathogènes et d'autres dans la grande diversité d’arômes qui fait la renommée des vins. L’analyse de la séquence de référence du génome de la vigne a permis de mettre en évidence une remarquable expansion de certaines familles de gènes liés au métabolisme secondaire par rapport aux autres plantes. Dans ce travail, j'ai étudié les familles gènes codant pour les cytochromes P450, dont certains sont impliqués dans la production d’arômes, les gènes codant pour les stilbènes synthases (STS), les endo-β-1,3-glucanases et les gènes de résistance de type NBS impliqués dans les défenses de la vigne. Ma thèse vise à proposer des hypothèses expliquant l’organisation structurale de ces familles de gènes et ainsi à mieux comprendre pourquoi certaines familles présentent une amplification dans le génome de la vigne. Des approches bioinformatiques ont été utilisées afin d’étudier ces différentes familles de gènes. Les gènes cytochromes P450 et gènes R de type NBS ont tout d'abord été annotés de manière manuelle dans le génome de référence de la vigne. L’expression des gènes endo-β-1,3- glucanases, STS et cytochromes P450 a été analysée en utilisant une approche transcriptomique à grande échelle. Pour ce faire, un outil a été développé durant cette thèse pour estimer le niveau d’expression des gènes à partir de données RNA-Seq disponibles dans les banques de données publiques. Parallèlement, des données de reséquençage d’ADN de 56 cépages et espèces de vigne ont été analysées, afin de déterminer les variations structurales de type CNV au sein des familles de gènes à domaine NBS et de gènes STS. Ces différents travaux ont permis de montrer que l’amplification des familles de gènes étudiées n’est pas spécifique du génome de référence mais est retrouvée dans l'ensemble du genre Vitis, mais également de mettre en évidence des variations structurales au sein des différents génomes étudiés. L'analyse de la famille STS a montré que ces gènes sont organisés en blocs de duplication, et que les gènes plus conservés sont aussi les plus exprimés. Nous avons également montré que les gènes à domaine NBS sont organisés en cluster, dont certains sont particulièrement soumis à variation. Ces travaux contribuent à une meilleure connaissance de facteurs de défense efficaces et durables ainsi que des gènes impliqués dans la synthèse d’arômes dans la vigne. Ces connaissances pourront bénéficier aux programmes de création variétale mis en œuvre à l’INRA de Colmar

Comparative and functional genomics of gene families linked to secondary metabolism in grapevine (Vitis vinifera) and its relatives

La vigne (Vitis vinifera) possède un métabolisme secondaire particulièrement riche donnant naissance à une large palette de molécules dont certaines sont impliquées dans les défenses contre les pathogènes et d'autres dans la grande diversité d’arômes qui fait la renommée des vins. L’analyse de la séquence de référence du génome de la vigne a permis de mettre en évidence une remarquable expansion de certaines familles de gènes liés au métabolisme secondaire par rapport aux autres plantes. Dans ce travail, j'ai étudié les familles gènes codant pour les cytochromes P450, dont certains sont impliqués dans la production d’arômes, les gènes codant pour les stilbènes synthases (STS), les endo-β-1,3-glucanases et les gènes de résistance de type NBS impliqués dans les défenses de la vigne. Ma thèse vise à proposer des hypothèses expliquant l’organisation structurale de ces familles de gènes et ainsi à mieux comprendre pourquoi certaines familles présentent une amplification dans le génome de la vigne. Des approches bioinformatiques ont été utilisées afin d’étudier ces différentes familles de gènes. Les gènes cytochromes P450 et gènes R de type NBS ont tout d'abord été annotés de manière manuelle dans le génome de référence de la vigne. L’expression des gènes endo-β-1,3- glucanases, STS et cytochromes P450 a été analysée en utilisant une approche transcriptomique à grande échelle. Pour ce faire, un outil a été développé durant cette thèse pour estimer le niveau d’expression des gènes à partir de données RNA-Seq disponibles dans les banques de données publiques. Parallèlement, des données de reséquençage d’ADN de 56 cépages et espèces de vigne ont été analysées, afin de déterminer les variations structurales de type CNV au sein des familles de gènes à domaine NBS et de gènes STS. Ces différents travaux ont permis de montrer que l’amplification des familles de gènes étudiées n’est pas spécifique du génome de référence mais est retrouvée dans l'ensemble du genre Vitis, mais également de mettre en évidence des variations structurales au sein des différents génomes étudiés. L'analyse de la famille STS a montré que ces gènes sont organisés en blocs de duplication, et que les gènes plus conservés sont aussi les plus exprimés. Nous avons également montré que les gènes à domaine NBS sont organisés en cluster, dont certains sont particulièrement soumis à variation. Ces travaux contribuent à une meilleure connaissance de facteurs de défense efficaces et durables ainsi que des gènes impliqués dans la synthèse d’arômes dans la vigne. Ces connaissances pourront bénéficier aux programmes de création variétale mis en œuvre à l’INRA de Colmar.Grapevine (Vitis vinifera) has a particularly rich secondary metabolism, giving rise to a wide range of molecules, some of which are involved in defences against pathogens and others in the great diversity of aromas that make wines famous. Analysis of grapevine reference genome has shown a remarkable expansion of certain families of genes linked to secondary metabolism in comparison with the other plants. In this work, I have analysed gene families coding for cytochromes P450, some of them being involved in the production of aromas, genes coding for stilbene synthases (STS), endo-β-1,3-glucanases and NBS type resistance genes involved in grapevine defences. My thesis intends to propose hypothesis to explain the structural organisation of these families and therefore better understand why some of these families are amplified in the grapevine genome. Bioinformatic approaches have been used to study these different genes families. The cytochromes P450 and R genes of NBS type were manually annotated to improve the knowledge of these families of genes. The expression of endo-β-1,3-glucanases, STS and cytochromes P450 genes has been quantified using a large-scale transcriptomic approach. To this purpose, a tool has been developed during this thesis to estimate the level of genes expression from RNA- Seq data available in public databases. In the meantime, DNA resequencing data from 56 cultivars and grapevine species have been analysed to identify structural variations of CNV types within the genes with a NBS domain and the STS genes. These works showed that the amplification of the gene families of interest was not specific to the reference genome but occurred at the scale of the Vitis genus, but also to highlighted structural variations in different genomes. Regarding the STS genes, blocks of duplication and more conserved and expressed genes were identified. For the genes with NBS domain, a clustered organisation has been highlighted with some clusters varying more than others in the studied genotypes. These works contribute to a better knowledge of gene families for efficient and durable defence against pathogens and optimal aromas synthesis in grapevine. This knowledge will benefit to breeding programs currently in progress at INRA Colmar

Identification of a Vitis vinifera endo‐β‐1,3‐glucanase with antimicrobial activity against Plasmopara viticola: Antimicrobial activity of a endoglucanase

Inducible plant defences against pathogens are stimulated by infections and comprise several classes of pathogenesis‐related (PR) proteins. Endo‐β‐1,3‐glucanases (EGases) belong to the PR‐2 class and their expression is induced by many pathogenic fungi and oomycetes, suggesting that EGases play a role in the hydrolysis of pathogen cell walls. However, reports of a direct effect of EGases on cell walls of plant pathogens are scarce. Here, we characterized three EGases from Vitis vinifera whose expression is induced during infection by Plasmopara viticola, the causal agent of downy mildew. Recombinant proteins were expressed in Escherichia coli. The enzymatic characteristics of these three enzymes were measured in vitro and in planta. A functional assay performed in vitro on germinated P. viticola spores revealed a strong anti‐P. viticola activity for EGase3, which strikingly was that with the lowest in vitro catalytic efficiency. To our knowledge, this work shows, for the first time, the direct effect against downy mildew of EGases of the PR‐2 family from Vitis

Annotation, classification, genomic organization and expression of the Vitis vinifera CYPome

International audienceCytochromes P450 are enzymes that participate in a wide range of functions in plants, from hormonal signaling and biosynthesis of structural polymers, to defense or communication with other organisms. They represent one of the largest gene/protein families in the plant kingdom. The manual annotation of cytochrome P450 genes in the genome of Vitis vinifera PN40024 revealed 579 P450 sequences, including 279 complete genes. Most of the P450 sequences in grapevine genome are organized in physical clusters, resulting from tandem or segmental duplications. Although most of these clusters are small (2 to 35, median = 3), some P450 families, such as CYP76 and CYP82, underwent multiple duplications and form large clusters of homologous sequences. Analysis of gene expression revealed highly specific expression patterns, which are often the same within the genes in large physical clusters. Some of these genes are induced upon biotic stress, which points to their role in plant defense, whereas others are specifically activated during grape berry ripening and might be responsible for the production of berry-specific metabolites, such as aroma compounds. Our work provides an exhaustive and robust annotation including clear identification, structural organization, evolutionary dynamics and expression patterns for the grapevine cytochrome P450 families, paving the way to efficient functional characterization of genes involved in grapevine defense pathways and aroma biosynthesis

Dot matrix of segmental duplications in the physical cluster 92.

<p>Physical cluster 92 is located on chromosome 18 and comprises twenty-two CYP82 sequences, one CYP74 sequence and one CYP704 sequence. The dots and the black lines represent the sequence similarities in cluster <b>92</b> compared to itself. The red rectangles on the sides of the graph represent cytochrome P450 sequences. Complete genes are labeled with their name and pseudogenes are labeled with “p” and the P450 family. A) The similarities for the whole cluster <b>92</b>. B) A zoom of the red squared region, which contains two 30kb blocks with very high similarity. Analysis of gene expression showed that CYP82D15 and CYP82D18 are co-expressed (expression cluster <b>A</b>, expression in ripe berries) as well as CYP82D17 and CYP82D20v2 (expression cluster <b>C</b>, expression in downy mildew infected leaves). The pseudogenes of the enlarged segment are not expressed.</p

Molecular phylogenetic analysis of grapevine cytochrome P450.

<p>The alignment of full-length cytochrome P450 protein sequences was used to generate a maximum likelihood tree. The dark blue clade is the clan 71, which often contains genes involved in specialized metabolism. The highlighted genes belong to the seven largest physical clusters.</p

Heatmap of the P450 sequences, clustered according to their expression profile.

<p>The expression levels were averaged over the experiments classified in one of the six experimental categories: leaves, downy mildew (<i>Plasmopara viticola</i>) infected leaves, powdery mildew (<i>Erysiphe necator</i>) infected leaves, flowers, young berries and ripe berries. This heatmap includes the 457 expressed cytochrome P450 sequences. The color scale for the expression level represents FPKM values normalized by row ((FPKM value − row minimum) / row maximum). The color bars on the left are showing the eight expression clusters, which are designated by the letters on the side.</p

Similarity of the P450 genes between and within clusters.

<p>For each circle, the grey bars correspond to the 19 grape chromosomes and the “Unknown chromosome”. The lines connect complete P450 genes according to their similarity. The lines outside the circles show the similarity between genes of the same cluster, whereas the lines in the circle connect similar genes of different clusters. Only P450 genes that form clusters composed of at least two complete genes are illustrated here. The seven largest clusters are labeled with numbers corresponding to <a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0199902#pone.0199902.t001" target="_blank">Table 1</a>. The lines are connecting the genes corresponding to the best BLAST hit (A), second best hit (B) or third best blast hit (C).</p